单个B细胞抗体制备技术研究进展.pdf

中国兽医杂志():单个 细胞抗体制备技术研究进展杨郑欣 李 琰 张晓茜 李芳韬 赵启祖 李文涛 朱元源(中国兽医药品监察所 国家/猪瘟参考实验室 北京 海淀 华中农业大学动物科学技术学院、动物医学院 农业微生物资源发掘与利用全国重点实验室 湖北 武汉 湖北洪山实验室 湖北 武汉)摘要:单克隆抗体在疾病预防、诊断和治疗方面具有重要意义尤其在免疫机制研究方面具有突出贡献 随着单克隆抗体制备技术的发展单个 细胞抗体制备技术成为新一代快速制备单克隆抗体的方法 该技术利用每个 细胞仅可产生一种特异性抗体的特性直接筛选出分泌特异性抗体的 细胞对其表达抗体重链和轻链的基因进行克隆和体外表达从而获得特异性单克隆抗体 相较传统抗体制备技术该技术具有快速、高效、产量高等优点且表达的抗体具有天然构象不仅可用于病原微生物相关抗原的抗体开发、病毒跨种传播机制等研究还在抗肿瘤治疗、抗自身免疫病等方面发挥重要作用 本文主要对单个 细胞抗体制备过程和应用现状进行综述以期为单克隆抗体制备技术的发展和完善提供参考促进其更好地应用于相关领域关键词:单个 细胞 抗体 克隆 制备中图分类号:文献标志码:文章编号:()(./.):.:.收稿日期:基金项目:国家重点研发计划项目()国家现代农业产业技术体系()贵州省科技计划项目(黔科合支撑)作者简介:杨郑欣()男硕士生主要从事动物病毒抗体相关研究:.通信作者:朱元源:.李文涛:.单克隆抗体()简称单抗可识别特定的抗原决定簇解析抗原结构可与病毒结合从而诊断或治疗病毒病 在诊断方面具有良好结合性的单抗可以用于建立更加敏感和特异的检测方法在治疗方面单抗是一种效果较好的治疗手段但该治疗对单抗的要求较高获取与治疗对象具有相同属性来源的单抗是治疗的 期杨郑欣等:单个 细胞抗体制备技术的研究进展关键 随着技术手段的日新月异出现了很多成熟的单抗制备方法 单抗制备的首次突破是 年开发的杂交瘤技术 除此之外目前还有爱泼斯坦巴尔病毒()永生化技术、转基因小鼠技术、噬菌体展示技术和单个 细胞抗体制备技术等 本文从单个 细胞抗体的制备和应用方面进行综述以期为单抗制备技术的发展和完善提供参考促进其更好地应用于相关领域 单抗制备技术 年 和 首次开发了杂交瘤技术因其操作简单且成本低现已成为一种成熟的单抗制备方法但该方法耗时长、效率低且所得抗体为鼠源抗体仍存在一些局限性 永生化技术是利用 将 细胞转化为具有永生化特征的细胞系产生永生化 细胞进而产生抗体虽然该方法在理论上可行性很高但其用于制备人源抗体时仍存在很多问题 年首次报道了转基因小鼠技术该技术通过敲除小鼠内源性重轻链基因敲入编码人源抗体的重轻链基因获得转基因小鼠 由于人和鼠的种属差异抗原免疫转基因小鼠后不能完全实现人源抗体的制备 噬菌体展示技术起源于 年该技术通过扩增抗体编码基因形成基因文库将组合文库展示在噬菌体表面后经筛选得到抗体但该抗体为重轻链随机组合不能保证其天然构象 单个 细胞抗体制备技术 年 等首次报道了一种抗体制备的新方法该方法利用免疫球蛋白()的可变区互补()进行分子克隆和抗体表达 首先通过特异性溶血空斑试验筛选产生特定抗体的单个 细胞并从中提取可变区 然后利用逆转录聚合酶链式反应()扩增和回收重链可变区和轻链可变区基因并连接到人源 恒定区基因进行表达最终获得特异性抗体 不同单抗制备技术的优缺点如表 所示单个 细胞抗体制备技术是基于 基因谱系分析和单细胞水平的 反应性分析相结合的方法利用细胞分选和测序技术仅需很少的细胞便可以得到表达抗体的基因再通过体外表达即可在短时间内迅速产生大量抗原特异性单抗 现已应用该技术成功制备了大量人源单抗并广泛用于疾病的诊断和治疗 单个 细胞抗体制备技术已经应用于抗肿瘤治疗和抗病毒治疗如寨卡病毒和流感病毒等且在抗击新冠疫情时发挥了重要作用表 单抗制备技术的优缺点 单抗制备技术 优点缺点杂交瘤技术技术成熟制备的单抗纯度高操作步骤繁琐周期长效率低抗体为鼠源或兔源不能直接应用于人体临床研究 永生化技术可制备人源抗体直接应用于人体临床试验 操作需要在生物安全三级实验室开展转基因小鼠技术利用人源化转基因小鼠可获得全人源抗体直接应用于人体临床试验技术不成熟人源化小鼠难以获得噬菌体展示技术库容量大筛选周期短易量产非自然源性抗体在体内容易被清除难以应用于治疗单个 细胞抗体制备技术全人源抗体可直接用于人体临床研究周期短效率高全天然性抗体技术较成熟对抗原质量要求较高费用较高 单个 细胞抗体制备过程单个 细胞抗体制备技术主要包括以下步骤:()对主动免疫或被动免疫过的人或其他动物进行外周血分离体型较小的动物可以选择分离脾脏()对外周血或脾脏中的 细胞进行富集以提高分选效率()对富集的 细胞进行特异性分选()对分选的单个 细胞进行细胞裂解以释放其中的核酸()将核酸进行反转细胞内的()根据表达抗体重链可变区()和轻链可变区()的基因设计引物通过 扩增获得可变区序列()将可变区序列插入带有恒定区基因的载体质粒获得单抗表达质粒()选择合适的表达系统进行表达获取抗体(图)文 献 综 述 卷图 单个 细胞抗体制备技术主要步骤 外周血或脾脏分离 外周血中 细胞充足且容易获取方便 细胞分离因此可从人和动物外周血单核细胞中分离 细胞 等从黑色素瘤患者的外周血中分离单个 细胞获取抗体基因并克隆表达巨细胞病毒 特异性的人源单抗魏德陇从免疫猪外周血中筛选出分泌猪繁殖与呼吸综合征病毒()抗原特异性抗体的 细胞克隆并表达 特异性单抗对于小鼠这种体型较小的动物外周血量较少多选用 细胞充足的脾脏进行 细胞分离 等从免疫小鼠的脾脏分离出特异性 细胞克隆并表达针对疟原虫的特异性单抗 细胞分离筛选 细胞分离方法包括随机分离法和特异性分离法 随机分离法操作简单但工作量大一般可作为特异性分离法的前步骤 特异性分离法需要利用免疫学原理即抗原抗体特异性结合原理识别 细胞或特异性抗体对 细胞进行特异性筛选获得目标 细胞 常用的 细胞分离方法包括显微操作法、激光捕获显微切割()法、溶血斑块技术、免 疫 磁 珠 分 离()法、荧光激活细胞分离()法、微雕刻分离法、芯片免疫斑点微阵列测定()法等(表)表 细胞分离方法的优缺点 细胞分离方法 优点缺点显微操作法要求低操作简单识别和分离效率低激光捕获显微切割法操作简单定位准确样品要求较高效率低溶血斑块技术快捷特异性好无法获取活细胞免疫磁珠分离法操作简单可重复性高可以富集目标 细胞磁珠要求高操作要求高荧光激活细胞分离法灵活性高准确性高对设备要求高微雕刻分离法高效、快速对设备要求高操作要求高芯片免疫斑点微阵列测定法全自动效率高操作要求高成本高 显微操作法显微操作法是在显微镜观察下用显微操作仪人工进行 细胞分离 等将分离的浆细胞用抗 抗体染色后进行鉴定用倒置显微镜上的标准显微操作器捕获单个细胞 该方法对仪器设备的要求低无需特殊仪器设备即可进行相对简单但细胞识别和分离效率低 激光捕获显微切割法 法需要提前将样品切片染色再通过显微激光切割系统对细胞进行观察以捕获单细胞或单细胞群 等通过 期杨郑欣等:单个 细胞抗体制备技术的研究进展该方法从房水、玻璃体、视网膜下液体和脑脊液中获得特异性 细胞 该方法操作简单定位准确但对于样品要求较高无法在短时间内获取大量单个 细胞 溶血斑块技术溶血斑块技术利用抗原特异性结合抗体原理在补体作用下使红细胞裂解形成溶血斑块再通过显微技术筛选和分离抗原特异性 细胞 等通过溶血空斑技术鉴定和分离到产生单克隆抗体的细胞 该方法快捷且特异性好但是红细胞相对脆弱无法获取活细胞 免疫磁珠分离法 法是通过磁珠结合抗原进而结合抗体捕获特异性 细胞经磁场作用获取被磁珠吸附的细胞或去除未被磁珠吸附的细胞以获取目标 细胞 等利用抗 的磁珠达到浓缩外周血单核细胞()中原代 细胞的目的该方法操作简单可重复性高可以富集目标 细胞但对磁珠要求高可能会使目标 细胞流穿导致分离效率降低 荧光激活细胞分离法 法利用带有荧光标记的抗原与带有特异性抗体的 细胞结合通过流式细胞仪的多色流式分析和分选功能纯化特定的 细胞或细胞群 该方法可以高通量筛选分泌特异性抗体的 细胞具有灵活性高、准确性高的特点可以根据表面分子不同的荧光靶标抗体同时对多种类型的 细胞进行分离目前已被广泛用于体外和体内细胞分离 微雕刻分离法微雕刻分离法是一种软光刻技术其为发现新的单抗提供了一种快速而有效的替代方法 将 细胞群体的单个细胞分离到微孔阵列中该阵列被用于打印蛋白质微阵列微阵列上的抗体可以用于抗原筛选并映射到相应的细胞然后通过微操作将目标细胞转移到培养皿中进行后续操作 等使用微雕技术筛选小鼠杂交瘤成功筛选出产生独特单抗的新细胞系 该方法可直接获得产生目的抗体的杂交瘤克隆株可同时获得大量不同的单克隆抗体用时大大缩短但其缺点是对设备要求高对操作人员技术水平要求高 芯片免疫斑点微阵列测定法 法是微阵列芯片法的进一步延伸将抗抗体包被于芯片表面结合抗体后用荧光标记的抗原特异性识别需要的抗体进而获得目的 细胞 等利用微阵列和菌落挑选仪建立了一种可以高通量自动筛选产生抗体的细胞的方法 该方法用时短效率高具有较好的前景但问题在于构建芯片阵列的成本较高在芯片上操作较复杂 细胞裂解和核酸反转录筛选到目标特异性 细胞后需要获取 细胞内表达抗体的序列因此需对单个 细胞进行裂解后将其核酸进行 筛选获得的单个 细胞数量较多但每个细胞核酸含量较少故可选用 孔板进行操作满足大批量样本同时反应的要求 利用细胞仪分选细胞时可将分选到的单个 细胞直接放入具有细胞裂解液、酶抑制剂的 孔板内在对应孔内利用反转录试剂将 细胞裂解后释放的 反转录成 目标抗体可变区序列获取 抗体类型 根据重链组成和抗原性的不同可将抗体分为、和 五类分别对应、和 五种亚型根据轻链组成和抗原性的不同可分为 型和 型两类一个天然抗体分子上 条轻链的型别总是相同的且 个型别轻链功能无差异 不同种属生物体内抗体 个型别轻链的比例不同人抗体轻链 约为 小鼠抗体轻链 约为 牛抗体轻链 约为 猪抗体轻链 约为 引物设计和序列 扩增 在使用单个 细胞抗体制备技术进行抗体可变区序列分析时不同动物、不同类型的抗体需要使用不同的引物进行巢式或半巢式 扩增 通常情况下巢式 扩增的正向引物位于 和 基因的前导序列反向引物位于恒定区序列 引物设计的合理性是扩增全部抗体可变区序列的关键影响因素因此是该技术的难点 等设计了一套扩增引物可识别所有功能的人源抗体可变区基因 等针对鼠 和 基因的可变区序列设计了一套扩增引物 为解决因引物设计不合理无法扩增出完整序列的问题 等通过 末端快速克隆技术()利用端恒定区已知序列设计引物通过 次 成功扩增完整重轻链可变区序列 表达质粒构建扩增得到目标抗体的可变区基因片段后将其插入含有恒定区基因的表达载体中构建表达质粒 表达载体需要包含所有转录和翻译调控所必需的元件 等设计了线性表达载体包括巨细胞病毒()启动子、前导序列、重链或轻链的恒定区、()尾巴和可替代的 或 基因该载体的使用文 献 综 述 卷省去了克隆步骤通过在 启动子和 前导序列、恒定区和()尾巴间插入合适的酶切位点直接将 和 基因克隆到表达载体中随后将表达质粒转染入合适的表达系统即可产生目标重组抗体 抗体表达及其验证 抗体原核表达系统原核表达多用大肠杆菌系统 等利用大肠杆菌系统表达出针对巨细胞病毒的人源单抗 原核表达系统能够在短时间内获得表达产物而且成本相对低廉方法简单可表达蛋白较多但其所表达的蛋白未经修饰不一定具有天然活性且该表达系统无法对表达时间和表达水平进行调控有些基因持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用过量表达可能导致非生理反应 目前该系统表达的蛋白常以包涵体形式表达也会导致产物纯化困难 抗体真核表达系统真核表达系统包括酵母表达系统、昆虫表达系统和哺乳动物细胞表达系统等 哺乳动物细胞表达系统能诱导蛋白的高效表达可对表达的蛋白进行正确折叠并进行复杂糖基化修饰所得蛋白的活性接近于天然蛋白且不存在内毒素污染所以被认为是表达抗体的最佳选择 等利用人胚肾细胞 成功表达有效治疗甲型 流感的单抗 等利用野生型人胚肾细胞 成功表达针对甲型流感血凝素的单抗 等利用中国仓鼠卵巢细胞()成功表达针对乙肝病毒的人源单抗 表达抗体验证所表达抗体经纯化后可用聚丙烯酰胺凝胶电泳()和蛋白免疫印迹试验()等常规方法进行初步验证再通过酶联免疫吸附试验()、间接免疫荧光()和中和试验等方法进行生物活性验证也可以通过流式分析法、活细胞成像测定法和体内药物活性测定等方法进一步进行生物学特性测定 应用单个 细胞抗体制备技术已经成为当前抗体研究领域的重要技术 该技术具有快速、高效、产量高等特点表达的抗体具有天然构象在治疗病原微生物感染、肿瘤研究、免疫系统研究等领域应用前景广泛 在治疗病原微生物感染方面等利用该技术制备了多株针对乙肝病毒的单抗其中 以上具有中和活性有助于开发针对乙肝疾病的单抗治疗方法 等利用该技术平台成功制备了上百株针对 蛋白的人源单抗其中多株单抗可以中和病毒达到抑制病毒感染的效果 在肿瘤研究方面 等利用该技术成功制备了人源黑色素瘤的单抗为后续开发黑色素瘤治疗性单抗提供了技术支撑 等利用该技术平台获得对黑色素瘤细胞具有杀伤作用的抗黑色素瘤单抗建立了具有良好敏感型的新型 检测方法 在免疫系统研究方面该技术可将所有 细胞单独分离结合二代测序等技术对 细胞重轻链基因库进行整合分析 从 而 对 整 个 免 疫 系 统 和 免 疫 机 理 进 行探究单个 细胞抗体制备技术以其快速、高效和高产量等优点受到广泛关注但也面临一些挑战如该技术的成本较高、技术复杂难以实现规模化应用该技术依赖于从免疫动物或患者体内获取用于抗体制备的 细胞难以避免样本差异性和个体差异性可能会导致一定程度的抗体异质性 有待开发更加智能化、高效化的单个 细胞筛选和克隆技术等以实现快速、大规模的单抗制备进而加速治疗性单抗的发展开启疾病治疗的新时代参考文献:.:.():.():.:.():./.():.:.():.:.():.期杨郑欣等:单个 细胞抗体制备技术的研究进展 ():.:.():.():.().():.魏德陇.基于单个 细胞抗体技术研制 特异性单克隆抗体.北京:中国农业科学院.:.:.():.:.:.():.():.():.康懿刘华王蕾等.血清/轻链比值及蛋白电泳在诊断多发性骨髓瘤中的临床应用.检验医学():.王省.利用单个 细胞抗体技术研制口蹄疫病毒 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