鱼类肌肉蛋白的提取.doc

实验二 鱼类肌肉蛋白的提取、蛋白含量测定及其
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

一、 实验目的和内容
（一）目的：
1． 了解从动物组织中提取蛋白的原理和实验方法；
2． 熟悉蛋白质含量测定的各种方法和基本原理，并根据实验结果，比较不同种类的鱼肌肉中水溶性蛋白和盐溶性蛋白含量的差异；
3． 掌握SDS-PAGE的原理和垂直板型凝胶电泳的操作方法，并根据电泳结果，比较不同种类的鱼肌肉中水溶性蛋白和盐溶性蛋白成分的差异。
（二）内容：
1． 利用机械破碎和高速离心分离等手段，从不同种类的鱼肌肉中提取水溶性蛋白和盐溶性蛋白；
2． 采用紫外吸收法测定以上各蛋白提取液中的总蛋白含量；
3． 对以上蛋白提取液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测，并利用凝胶成像系统软件对电泳结果进行分析。
二、 实验原理
蛋白质在组织或细胞中一般都以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此，蛋白质的提取、分离和鉴定工作是生物工程中一项十分艰巨的任务。要想分离提纯某一特定的蛋白，首先必须把蛋白质从组织活细胞中以溶解的状态释放出来。为此，动物组织或动物细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎，细菌和植物细胞可用超声破、高压挤压或砂研磨等方法进行破碎。
鱼类肌肉蛋白按溶解性分为水溶性蛋白质（如各种蛋白水解酶）和盐溶性蛋白质（如肌原纤维蛋白质）。
为了了解鱼体肌肉组织中水溶性蛋白和盐溶性蛋白的含量，需要进行蛋白含量的测定。测定蛋白质含量的方法主要有紫外吸收法、考马斯亮蓝G-250染色法、Folin试剂法（Lowry法）及微量凯氏定氮法等。每种方法都有其优缺点，可根据实验的具体要求，选择不同的测定方法。本实验选择了简单而快捷的紫外吸收法和常用的考马斯亮蓝G-250染色法。
紫外吸收法的基本原理为：蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸等残基在280nm波长下具有最大光吸收。由于绝大多数蛋白质中都含有酪氨酸或色氨酸，因此280nm的光吸收度是蛋白质的一种普遍性质。在一定程度下，蛋白质溶液在280nm吸光度与其浓度成正比，故可作定量测定，核酸在紫外区（260nm）也有吸收，可通过校正加以消除。
肌肉组织中含有多种蛋白质，具有不同的电荷、形状和分子量。强阴离子表面活性剂SDS与还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷和规则的椭圆形状。在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采用考马斯亮蓝快速染色，可及时观察电泳分离效果。根据电泳结果，可比较不同种类的鱼肌肉中水溶性蛋白和盐溶性蛋白成分的差异。
三、 实验步骤
（一）鱼肌肉蛋白的提取
1． 称取新鲜的淡水鱼和海水鱼肉各6g，用刀切碎，分别加入 30 ml 冰冷的Bufffer I（20mM Tris-Cl, pH8.0），在捣碎机中捣碎成匀浆。
2． 将以上匀浆转入50ml 离心管中，在4℃下，10000×g，离心15min，将上清和沉淀分开。
3． 上清用四层纱布进行过滤除去脂肪，滤液即水溶性蛋白提取液（留样1（1.5ml）、量体积、测蛋白含量、SDS化）
4． 在以上沉淀中，加入30 ml 冰冷的蒸馏水，重悬沉淀，在4℃下，10000×g，离心15min， 取沉淀。
5． 重复操作4二次。
6． 在以上沉淀中，加入30 ml 冰冷的Buffer II（Buffer I含有0.5M NaCl），重悬沉淀，再次用组织捣碎机进行捣碎。
将以上匀浆转入50ml 离心管中，在4℃下，8000×g，离心15min，将上清和沉淀分开。上清即为盐溶性溶性蛋白提取液（留样2（1.5ml）、量体积、测蛋白含量、SDS化）。

（二）蛋白含量测定——紫外吸收法
取适量的样品提取液（以上水溶性蛋白液/盐溶性蛋白液），根据蛋白质浓度，用Buffer I适当稀释后，用紫外分光光度计分别在280 nm和260 nm波长下读取吸光度，以Buffer I为空白调零。
结果计算：
蛋白质浓度= n ×（1.45 A280－0.74 A260）（mg／mL）
式中：l.45和0.74为校正值；
A280为蛋白质溶液在280nm处的吸光度；
A260为蛋白质溶液在260nm处的吸光度；
n为稀释倍数。
（三）蛋白提取液的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
1． 聚丙烯酰胺凝胶的配制
（1）分离胶(12%)的配制（10ml）：
   ddH2O 3.3 ml
   30%储备胶 4.0 ml
   1.5M Tris-HCl（pH8.8） 2.5 ml
   10% SDS 0.1 ml
   10% AP 0.1 ml
TEMED 4 μl
  混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平（凝胶完全聚合需30-60min）。

（2）积层胶的配制（5ml）：
ddH2O 3.4 ml
30%储备胶 0.83 ml
1M Tris-HCl（pH6.8） 0.63 ml
10%SDS 0.05 ml
10%AP 0.05 ml
TEMED 5 μl
将分离胶上的水倒去,加入上述混合液，立即将梳子插入玻璃板间（完全聚合需15-30mim）。
2．样品处理：将样品（以上水溶性蛋白液/盐溶性蛋白液）加入等量的2×SDS上样缓冲液，100℃加热5min，离心12000g×1min，取上清作SDS-PAGE分析，同时将SDS分子量蛋白标准品作平行处理。
1． 上样：分别取10μl处理后的样品加入样品池中，并加入6μl蛋白标准品作对照。
2． 电泳：在电泳槽中加入1´电泳缓冲液，连接电源，注意正负极接向。电泳时，刚开始电压控制在90V，当样品到达分离胶后，可将电压调至180V，电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止。
3． 染色：将胶从玻璃板中小心取出，用考马斯亮兰染色液染色。
4． 脱色；将胶从染色液中取出,放入脱色液中，脱色至蛋白带清晰。
5． 凝胶摄像和保存：在图像处理系统下将脱色好的凝胶摄像，并利用系统软件分析实验结果，凝胶可保存于双蒸水中或7%乙酸溶液中。