SIRT2通过组蛋白H4K8去乳酸化修饰调控巨噬细胞趋化功能.pdf

Vol.43 No.8 Aug.2023上海交通大学学报（医学版）JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)Vol.43 No.8 Aug.2023JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)SIRT2通过组蛋白H4K8去乳酸化修饰调控巨噬细胞趋化功能宋文汀1，陶悦2，潘艺2，莫茜2，曹清11.上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心感染科，上海 200127；2.上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心儿科转化医学研究所，上海 200127摘要 目的探讨沉默信息调节因子2（silent information regulator 2，SIRT2）通过组蛋白H4第8位赖氨酸（H4K8）去乳酸化修饰对早期感染后巨噬细胞免疫表型的调节作用及相应机制。方法使用佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA）诱导人单核细胞白血病 THP-1 细胞，使其分化为具有巨噬细胞特性的人血单核细胞株（PMA-primed THP-1，pTHP-1），再以脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激建立巨噬细胞感染模型。将未经LPS处理的巨噬细胞（pTHP-1）设为对照（CTRL）组，经过LPS处理的巨噬细胞设为感染（LPS）组。通过蛋白质印迹法（Western blotting）检测巨噬细胞中组蛋白乳酸化各位点修饰水平、组蛋白乙酰化各位点修饰水平及SIRT2蛋白水平；通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）方法检测2组间糖酵解限速酶乳酸脱氢酶A（lactate dehydrogenase A，LDHA）、肝脏磷酸果糖激酶（phosphofructokinase liver type，PKFL），糖酵解调剂因子低氧诱导因子 1（hypoxia inducible factor 1，HIF-1），以及Sirtuin家族基因和HDAC家族基因表达水平；通过Transwell方法检测巨噬细胞趋化能力；使用慢病毒包装及细胞感染方法建立SIRT2过表达细胞系；使用RNA测序技术（RNA sequencing，RNA-seq）与染色质免疫共沉淀测序技术（chromatin immunoprecipitation sequencing，ChIP-seq）交互分析方法对组蛋白H4第8位赖氨酸乳酸化（lactylation of histone H4 lysine 8，H4K8la）特异性结合的基因进行差异性分析及通路富集分析。结果相较于CTRL组，LPS组巨噬细胞糖酵解上调，组蛋白H4K8位点乳酸化水平显著增加（P0.05），而组蛋白其余位点乙酰化水平未见显著变化。所有已知的具有去乳酸化修饰功能的酶中，仅SIRT2在LPS处理后出现显著降低（P0.05），且SIRT2过表达可显著抑制巨噬细胞中组蛋白H4K8位点的乳酸化水平（P0.05）。ChIP-seq与RNA-seq交互分析发现，组蛋白H4K8位点乳酸化修饰可调控巨噬细胞趋化相关基因，并且巨噬细胞的趋化能力在SIRT2过表达、H4K8la修饰水平下调后显著下降（P0.05）。结论SIRT2可通过去修饰组蛋白H4K8位点乳酸化改变趋化相关靶基因表达，从而降低巨噬细胞趋化能力。靶向SIRT2及H4K8la修饰将有助于控制巨噬细胞介导的炎症反应。关键词巨噬细胞；趋化；乳酸化；翻译后修饰；沉默调节蛋白2DOI10.3969/j.issn.1674-8115.2023.08.008 中图分类号R725.1 文献标志码ASIRT2 regulates macrophage chemotaxis by de-modifying histone H4K8 lactylationSONG Wenting1,TAO Yue2,PAN Yi2,MO Xi2,CAO Qing11.Department of Infectious Disease,Shanghai Childrens Medical Center,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200127,China;2.Pediatric Translational Medicine Institute,Shanghai Childrens Medical Center,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200127,ChinaAbstract Objective To explore the regulatory role of silent information regulator 2(SIRT2)in modulating the immune phenotype of macrophages after infection by removing the lactylation at H4K8 site of histone and the corresponding mechanism.Methods Human THP-1 leukemia cells were induced by phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)and stimulated by lipopolysaccharide(LPS)to establish a macrophage infection model.Macrophages without LPS treatment(pTHP-1)were set as the control(CTRL)group,and macrophages with LPS treatment were set as the infected(LPS)group.Western blotting was used to detect the level of histone modification and SIRT2 protein in macrophages.RT-qPCR was used to detect the expression level of glycolytic key enzymes phosphofructokinase liver type(PFKL),lactate dehydrogenase A(LDHA)and modulators genes hypoxia inducible factor 1(HIF-1),and the expression level of Sirtuin genes and HDAC genes between the two groups.Transwell was used to detect the ability of macrophage chemotaxis.Lentivirus packaging and cell infection were used to construct SIRT2 论著 基础研究作者简介 宋文汀（1997），女，硕士生；电子信箱：。通信作者 曹 清，电子信箱：。Corresponding Author CAO Qing,E-mail:.1008宋文汀，等SIRT2通过组蛋白H4K8去乳酸化修饰调控巨噬细胞趋化功能http:/上海交通大学学报（医学版），2023，43（8）overexpression cell line.The interaction analysis method of RNA sequencing(RNA-seq)and chromatin immunoprecipitation sequencing(ChIP-seq)was used to analyze the difference and pathway enrichment of the genes specifically bound to H4K8 lactylation(H4K8la).Results Compared to the CTRL group,macrophage glycolysis was upregulated and the level of H4K8la was significantly increased in the LPS group(P0.05),while the level of lactylation in other sites remained unchanged.Among all known enzymes with deacetylation modification function,only SIRT2 showed a significant decrease after LPS treatment(P0.05).The interactive analysis of ChIP-seq and RNA-seq revealed that chemotaxis-related genes were regulated by H4K8la,and macrophage chemotaxis ability significantly decreased after the overexpression of SIRT2 and downregulation of H4K8la(P0.05).Conclusion SIRT2 can change the expression of target genes related to chemotaxis by removing H4K8la modification,thereby reducing the chemotaxis ability of macrophages.Targeting SIRT2 and H4K8la modification may help control inflammation mediated by macrophages.Key words macrophage;chemotaxis;lactylation;post-translational modification;silent information regulator 2(SIRT2)感染性疾病是导致死亡的主要原因之一，如何对其精准治疗并提高患者预后是亟待解决的问题。机体免疫应答在感染的发生、发展和转归中起到重要作用，其中固有免疫是抵抗病原体入侵的第一道防线。作为最重要的固有免疫细胞之一，巨噬细胞可吞噬、杀伤病原体，并通过产生大量细胞因子及趋化因子诱导强烈的免疫炎症反应1-2。当遭受病原体刺激后，巨噬细胞会进行代谢重编程，将主要产能途径转变为糖酵解。该过程可产生包括乳酸在内的大量中间代谢产物，并且乳酸已被证明可通过多种方式在免疫调节中发挥作用3-6。组蛋白翻译后修饰是表观遗传调控最重要的方式之一，其可通过影响染色质构象调控下游基因转录，进而在生理病理过程中发挥作用7。近年来，已有多种组蛋白修饰被证明与固有免疫相关，可调节巨噬细胞功能并参与感染进程8。2019年，有研究9首次发现乳酸可作为反应底物在巨噬细胞中修饰组蛋白H3第18位赖氨酸（H3K18）位点，并在感染晚期调节巨噬细胞向M2型极化。但组蛋白乳酸化修饰是否可以调控感染早期的巨噬细胞功能，其在巨噬细胞内又是如何被调控的尚不清楚。因此本研究通过建立巨噬细胞感染早期模型，明确感染早期巨噬细胞不同位点组蛋白乳酸化修饰的变化及其机制，揭示组蛋白乳酸化对感染早期巨噬细胞的功能调控作用，旨在为感染性疾病宿主控制炎症和改善预后提供新的靶点。1材料与方法1.1细胞和质粒人单核细胞白血病THP-1细胞及人胚胎肾上皮细胞系 HEK 293T 均购自中国科学院上海细胞库。SIRT2过表达（SIRT2 overexpression，SIRT2 OE）质粒由上海儿童医学中心感染研究室李畅技术员提供。1.2主要试剂和仪器佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA；上海碧云天生物技术有限公司），重组人单核细胞趋化蛋白-1（recombinant human monocyte chemotactic protein-1，rhMCP-1；Peprotech，美 国），脂 多 糖（lipopolysaccharide，LPS；上海碧云天生物技术有限公司），TRIzol试剂（Life Technologies，美 国），Hifair 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR 和 SYBR Green Realtime PCR Master Mix（上海翌圣生物科技有限公司），RPMI-1640培养基（Hyclon，美国），10%胎牛血清（Gemini，美国），0.25%胰酶（Gibco，美国），LIPOFECTAMINE 3000和puromycin（Life Technologies，美国），乙酰化及乳酸化抗体（杭州景杰生物科技股份有限公司），Anti-Rabbit/Mouse IgG抗体（CST，美国），抗 SIRT2 抗体（CST，美国），辣 根 过 氧 化 物 酶（horseradish peroxidase，HRP）-conjugated GAPDH 抗体和 HRP-conjugated-actin抗体（上海翌圣生物科技有限公司），Anti-Rabbit-488抗 体（Invirtrogen，美 国），染 色 质 免 疫 共 沉 淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）试剂盒、结晶紫和 4%多聚甲醛（上海碧云天生物技术有限公司），16%甲醛（CST，美国），ECL 发光试剂盒（Millipore，美国）。生物安全柜 力新仪器（上海）有限公司，二氧化碳培养箱（Thermo Scientific，美国），电热恒温水槽（上海一恒科技有限公司），荧光倒置显微镜（Olympus，日本），水平脱色摇床（海门市其林贝尔10092023,43（8）上海交通大学学报（医学版）Vol.43 No.8 Aug.2023JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)仪 器 制 造 有 限 公 司），涡 旋 振 荡 器（Scientific Industries，美国），冷冻离心机（Eppendorf，德国），生物分子成像仪（GE，美国），自动聚焦超声波破碎仪（Covaris，美国）。1.3实验方法1.3.1巨噬细胞感染早期细胞模型建立THP-1细胞采用添加 10%胎牛血清的 RPMI-1640培养基，置于5%CO2、37 恒温湿润培养箱培养。将THP-1细胞加入含 100 ng/mL PMA 的 RPMI-1640 培养基，孵育48 h后更换普通RPMI-1640培养基继续培养24 h，使其刺激分化为具有巨噬细胞特性的人血单核细胞株（PMA-primed THP-1，pTHP-1）。使 用 含 1 g/mL LPS处理pTHP-1细胞12 h，获得巨噬细胞早期感染的细胞模型。将未经LPS处理的巨噬细胞（pTHP-1）设为对照组（CTRL组），经LPS处理的巨噬细胞设为感染组（LPS组）。1.3.2蛋白质印迹法取 CTRL 组及 LPS 组巨噬细胞，使用 1.25Loading Buffer 进行裂解，99 煮10 min，Nanodrop检测蛋白浓度。采用15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离总 蛋 白，并 转 移 至 聚 偏 氟 乙 烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜；5%脱脂奶粉室温封闭1 h；添加一抗包括乙酰化、乳酸化抗体（11 000）、抗SIRT2 抗体（11 000）、抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（140 000）、抗-actin抗体（150 000），4 孵育过夜；聚对苯二甲酸-共-丁二酸丁二醇酯 poly（butylene succinate-co-terephthalate），PBST 洗涤后加入HRP偶联的二抗（13 000）孵育1 h；PBST洗涤后使用ECL发光检测试剂盒显色后成像分析。1.3.3RNA提取及实时荧光定量PCR取LPS组巨噬细胞，按TRIzol试剂盒说明书提取总RNA；取总RNA 1 g，使用反转录试剂盒合成cDNA；取cDNA 1 L进行实时荧光定量PCR（RT-qPCR）反应，引物序列见表 1。反应条件：95，30 s；95 5 s，60 30 s，共39个循环；再95 15 s。1.3.4Transwell趋化实验Transwell小室提前1 h置于含RPMI-1640培养基的24孔板中孵育。取CTRL组及LPS组巨噬细胞，洗涤后取同等密度细胞悬液200 L加入Transwell小室上室，下室加入趋化因子rhMCP-1，于37 培养箱培养16 h；取出小室，4%多聚甲醛固定30 min，洗涤后结晶紫染色10 min，显微镜下观察计数。1.3.5慢病毒包装及细胞感染在HEK 293T细胞中使用Lipo3000试剂盒进行SIRT2 OE质粒转染，48 h后收集病毒液并过滤；将THP-1细胞与病毒液11混合，培养6 h后使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培 养 基 换 液，继 续 培 养 48 h，使 用 杀 稻 瘟 菌 素（blasticidin）筛选细胞并检测细胞过表达效率。1.3.6 RNA 测 序 RNA 测 序（RNA sequencing，RNA-seq）文库构建和Illumina测序由明码生物科技（上 海）有 限 公 司 完 成；使 用 基 因 本 体（gene ontology，GO）数据库、京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）数据库进行基因功能注释；使用DESeq2软件分析各细胞之间的差异基因表达。1.3.7 ChIP 测 序 ChIP 测 序 技 术（chromatin 表1RT-qPCR引物序列Tab 1Primer sequences for real-time qPCRGeneHIF-1PFKLLDHASIRT1SIRT2SIRT3SIRT5HDAC1HDAC2HDAC3GAPDHForward primer(53)GAACGTCGAAAAGAAAAGTCTCGGTACCTGGCGCTGGTATCTGATGGCAACTCTAAAFFATCAGCAGGCCACGGATAGGTCCATATGCGGAACTTATTCTCCCAGATGCTCATCAACCGGGACTTGCTCAAGATGCCAGCATCCCACATCGCTGTGAATTGGGCTGTCTGCTACTACTACGACGGTGACATGACGGTGTCCTTCCACATCTCCTCTGACTTCAACAGCGACAReverse primer(53)CCTTATCAAGATGCGAACTCACACCTCTCACACATGAAGTTCTCCCCAACCCCAACAACTGTAATCTGTGGAGGTATTGTTTCCGGCGAGAGCGAAAGTCGGGGATTTGTCTGGTCCATCAAGCCTAAGGAAGTGCCCACCACTAGAACCCTCTGGTGATACTTTAGCAGTCATTTCTTCGGCAGTGGCTCAGAGTCAGCTCCACACTGGCCCTGTTGCTGTAGCCAAATTCGTNote:PFKLphosphofructokinase liver type;LDHAlactate dehydrogenase A;HDAC1histone deacetylase 1.1010宋文汀，等SIRT2通过组蛋白H4K8去乳酸化修饰调控巨噬细胞趋化功能http:/上海交通大学学报（医学版），2023，43（8）immunoprecipitation sequencing，ChIP-seq）是 ChIP后结合高通量测序的方法。取LPS组巨噬细胞，使用1%甲醛交联10 min后加入1甘氨酸终止交联；SDS裂解液重悬细胞后超声法破碎DNA，取10%DNA产物作为 Input，其余 DNA 产物用于后续免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）实验，分别加入抗组蛋白H4 第 8 位赖氨酸乳酸化（lactylation of histone H4 lysine 8，H4K8la）抗体及抗IgG抗体，4 低速混合孵育过夜；每个样本中加入30 L protein A/G beads，4 低速混合孵育2 h；按说明书洗涤DNA产物，并使用Elute buffer洗脱；加入无水乙醇沉淀产物后，使用 乙 二 胺 四 乙 酸（ethylenediaminetetra-acetic acid，EDTA）、三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷（trihydroxymethyl aminomethane，Tris）及 Proteinase K 解交联；使用DNA纯化试剂盒纯化DNA。后续文库构建和测序由安诺优达基因科技有限公司完成。1.4统计学分析使用GraphPad Prism 9进行统计分析。每组实验进行3次独立生物学重复，组间比较采用配对t检验。P0.05表示差异具有统计学意义。2结果2.1巨噬细胞经LPS处理后糖酵解增强与CTRL组相比，LPS组巨噬细胞可观察到糖酵解限速酶肝脏磷酸果糖激酶（phosphofructokinase liver type，PFKL）和 乳 酸 脱 氢 酶 A（lactate dehydrogenase A，LDHA）显著升高，糖酵解调剂因子 低 氧 诱 导 因 子 1（hypoxia inducible factor 1，HIF-1）也显著升高（均 P0.05，图 1），提示感染早期的巨噬细胞存在糖酵解通路激活。2.2LPS 处理显著上调巨噬细胞组蛋白 H4K8 乳酸化水平与 CTRL组相比，LPS组巨噬细胞组蛋白 H4K8位点乳酸化修饰水平显著升高（P0.05，图 4B），表明巨噬细胞中 SIRT2对H4K8la修饰具有去修饰作用。Relative mRNA expression0CTRL1.01.50.52.0LPSPFKLABLDHARelative mRNA expression0CTRL1.01.50.52.5LPS2.0CHIF1ARelative mRNA expressionCTRLLPS02314Note：P=0.027,P=0.015,P=0.049,compared with the CTRL group.图1RT-qPCR检测巨噬细胞糖酵解限速酶及糖酵解调节因子表达Fig 1Expression of glycolytic rate-limiting enzyme and transcription factors in macrophages detected by RT-qPCR10112023,43（8）上海交通大学学报（医学版）Vol.43 No.8 Aug.2023JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)2.4SIRT2通过去修饰H4K8la调控巨噬细胞趋化功能为探索受H4K8la调控的靶基因，我们对LPS组巨噬细胞进行RNA-seq和ChIP-seq检测（图5A、B）。ChIP-seq 与 RNA-seq 交互分析结果（图 6A、B）表明，受H4K8la调控的基因富集在巨噬细胞趋化相关通路。为验证H4K8la修饰是否调控巨噬细胞趋化功能，我们对SIRT2过表达前后的巨噬细胞趋化能力进ABLPS-+H3K14ac-actinH3K18la-actinH3K14la-actinH3K18ac-actinH4K8ac-actinH4K12la-actinLPS-+CTRLLPSRelative band intensity(fold of control cells)00.51.01.52.0H3K18laH3K14laH4K8laH4K12laH3K18acH3K14acH4K8acH4K12acRelative band intensity(fold of control cells)00.51.01.5H4K12ac-actinH4K8la-actinNote：A.Detection of histone lactylation(left)and acetylation(right)levels by Western blotting.B.Expression of histone lactylation(above)and acetylation(below).P=0.000,P=0.002,compared with the CTRL group.图2蛋白质印迹法检测巨噬细胞组蛋白修饰水平Fig 2Histone modification levels in macrophages detected by Western blottingACBLPS-+SIRT2GAPDHSIRT1Relative mRNA expression0CTRL1.01.50.5LPSRelative mRNA expression01.01.50.5CTRLLPSSIRT3Relative mRNA expression01.01.50.5CTRL LPSSIRT2CTRL LPSRelative mRNA expression01.01.50.5SIRT5CTRLLPSRelative mRNA expression01.01.50.5HDAC1CTRLLPSRelative mRNA expression01.01.50.5HDAC2Relative mRNA expression01.01.50.5CTRLLPSHDAC3Note：A.Expression of Sirtuin family mRNA.B.Expression of HDAC family mRNA.C.Detection of SIRT2 protein by Western blotting.P=0.010,compared with the CTRL group.图3LPS处理后巨噬细胞Sirtuin家族和HDAC家族的RNA表达水平Fig 3RNA expression levels of Sirtuin family and HDAC family of macrophages after LPS treatment1012宋文汀，等SIRT2通过组蛋白H4K8去乳酸化修饰调控巨噬细胞趋化功能http:/上海交通大学学报（医学版），2023，43（8）行检测。与CTRL组相比，LPS组可观察到巨噬细胞趋化水平显著升高（P0.05），表明SIRT2可通过去修饰H4K8la降低巨噬细胞趋化能力（图7）。ABWTSIRT2GAPDHSIRT2 OERelative mRNA expression01.01.50.52.0LPSCTRLLPSCTRLWTSIRT2 OEH4K8la-actinLPSCTRLLPSCTRLWTSIRT2 OENote：A.Detection of SIRT2 protein by Western blotting.B.Detection of H4K8la by Western blotting.P=0.001.图4Western blotting检测巨噬细胞SIRT2和H4K8la水平Fig 4The levels of SIRT2 and H4K8la in macrophages detected by Western blottingPromoter(1 kb)(42.8%)Promoter(12 kb)(5.3%)Promoter(23 kb)(4.06%)5 UTR(0.35%)3 UTR(2.05%)1st Exon(1.16%)Other Exon(2.98%)1st Intron(9.36%)Other Intron(14.23%)Downstream(300)(0.04%)Distal Intergenic(17.66%)AB0100200-55100SLC7A2HIVEP2SLAMF7MSR1TRAF1PTGS2APBB1IPLAMP3KCNN2SLC7A8RIN3CD40PIM2EBI3TFPI2CCL1DTX4IL23APERPIL12BEVA1AIGFBP5KCNQ4ECE1NRP2CD80LRP1TNFAIP6MT2AIL1BCCR7DLL4IDO1RFTN1IL15RAADAMTS8CD36SERPINE2IL6IL33LOXL4LGI2MERTKMCOLN2CSF2ABTB2CKBSERPINB7PARM1P2RY12SERPINA9SERPINB9GIMAP8CCL19CHST2TAC4CD163CHST13SPNS2SOCS3TNFAIP2ADACACNA1ETNFSHANK3 SPP1 DHRS3CCL5PRAG1RAB7BUpDownLog2FoldChange-Log10 PNote：A.Genomic distribution of H4k8la signal peaks.B.Volcano plot of differential genes after LPS stimulation.MERTKMER proto-oncogene,tyrosine kinase;APBB1IPamyloid beta precursor protein binding family B member 1 interacting protein;SLC7A8solute carrier family 7 member 8;LRP1LDL receptor related protein 1;ADAMTS8ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif 8;RAB7BRAB7B,member RAS oncogene family;MSR1macrophage scavenger receptor 1;SPNS2SPNS lysolipid transporter 2,sphingosine-1-phosphate;CHST13carbohydrate sulfotransferase 13;PRAG1PEAK1 related,kinase-activating pseudokinase 1;SHANK3SH3 and multiple ankyrin repeat domains 3;DHRS3dehydrogenase/reductase 3;SPP1secreted phosphoprotein 1;LGI2leucine rich repeat LGI family member 2;LOXL4lysyl oxidase like 4;TAC4tachykinin precursor 4;P2RY12purinergic receptor P2Y12;TRAF1TNF receptor associated factor 1;CACNA1Ecalcium voltage-gated channel subunit alpha1 E;PARM1prostate androgen-regulated mucin-like protein 1;EBI3Epstein-Barr virus induced 3;ABTB2ankyrin repeat and BTB domain containing 2;CCL5C-C motif chemokine ligand 5;PERPp53 apoptosis effector related to PMP22;IL1Binterleukin 1 beta;CKBcreatine kinase B;RFTN1raftlin,lipid raft linker 1;TNFAIP2TNF alpha induced protein 2;MT2Ametallothionein 2A;ECE1endothelin converting enzyme 1;CHST2carbohydrate sulfotransferase 2;GIMAP8GTPase,IMAP family member 8;TNFtumor necrosis factor;SLAMF7SLAM family member 7;NRP2neuropilin 2;SERPINE2serpin family E member 2;KCNQ4potassium voltage-gated channel subfamily Q member 4;ADAadenosine deaminase;SOCS3suppressor of cytokine signaling 3;DLL4delta like canonical Notch ligand 4;HIVEP2HIVEP zinc finger 2;TFPI2tissue factor pathway inhibitor 2;PIM2Pim-2 proto-oncogene,serine/threonine kinase;KCNN2potassium calcium-activated channel subfamily N member 2;DTX4deltex E3 ubiquitin ligase 4;TFPI2tissue factor pathway inhibitor 2;PTGS2prostaglandin-endoperoxide synthase 2;MCOLN2mucolipin TRP cation channel 2;EVA1Aeva-1 homolog A,regulator of programmed cell death;RIN3Ras and Rab interactor 3;SLC7A2solute carrier family 7 member 2;TNFAIP6TNF alpha induced protein 6;IGFBP5insulin like growth factor binding protein 5;SERPINB7serpin family B member 7;IDO1indoleamine 2,3-dioxygenase 1;SERPINA9serpin family A member 9;CCL1C-C motif chemokine ligand 1;CCR7C-C motif chemokine receptor 7;CSF2colony stimulating factor 2;LAMP3lysosomal associated membrane protein 3.图5测序结果概述Fig 5Overview of sequencing results10132023,43（8）上海交通大学学报（医学版）Vol.43 No.8 Aug.2023JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL