PBMC线粒体自噬对高原移居人群运动能耗、线粒体呼吸链复合酶活性的影响.pdf

张赛，宋正阳，王淑远，等三七总皂苷通过 （）信号通路抑制低氧性肺动脉高压大鼠肺血管重构 中国病理生理杂志，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：线粒体自噬对高原移居人群运动能耗、线粒体呼吸链复合酶活性的影响孔海军，王凤华，李新龙，甘胜前，谌晓安（吉首大学体育科学学院，湖南 吉首 ；喀什大学体育学院，新疆 喀什 ；新疆师范大学体育学院，乌鲁木齐 ）【摘要】目的：探究高原移居中青年男性走、跑状态运动能耗及外周血单个核细胞（）线粒体自噬标志物变化特征。方法：招募 名受试者，根据移居高原年限分为高原移居组（）、高原移居组（）、高原移居组（）、世居高原组（）。检测受试者 、及 条件下运动能耗；检测受试者 线粒体 氧化还原酶、琥珀酸 氧化还原酶、细胞色素 氧化还原酶、细胞色素 氧化酶水平；和 检测受试者 线粒体 、及蛋白表达水平。结果：与 组比较，、组 步行能耗显著上升（）；与 组比较，组显著降低（）。与 组比较，组 、及 走、跑能耗均显著上升（）。与 组比较，、和 组复合物、复合物及复合物水平均显著降低（）；与 组和 组比较，组显著上升（）；与 组比较，组显著上升（）。与 组比较，、组复合物水平显著降低（）；与 组和 组比较，组显著上升（）。与 组比较，、和 组 表达显著上升（），、组高于 组（）；与 组比较，、和 组 表达显著降低（），组显著低于 、组（）；与 组比较，、和 组 表达显著降低（），组和 组显著低于 组，组显著低于 组（）；与 组比较，、和 组 和 蛋白表达显著上升（），组和 组显著高于 组，组显著低于 组（）。与 组比较，、组 蛋白表达显著上升（），组、组显著高于 组（）；与 组比较，、组 和 蛋白表达显著降低（），组、组显著低于 组（）。结论：高原移居者随高原移居时间延长，线粒体自噬水平逐步下降，线粒体呼吸酶活性逐渐增殖；高原定量负荷运动能量消耗逐渐降低。【关键词】高原移居；单核细胞线粒体；细胞自噬；线粒体呼吸链；运动能耗【】；【中图分类号】【文献标识码】【文章编号】（）【】中国应用生理学杂志，（）帕米尔高原地处我国西北边陲，是亚洲多个主要山脉的汇集地，平均海拔 以上，地形地貌复杂，主要气候特征为低氧、干燥、低气压、强紫外线 。随着西部大开发、对口援疆等战略的制定实施，西部地区人口输入不断增加，世居平原人群移居高原的数量亦持续上升。在无病理学相关混杂因素的情况下，世居平原人群移居高原环境是研究机体对缺氧综合反应的有力模型。多项研究证实，机体能量代谢特征可能与外界环境密切相关，因此能量代谢适应是高原移居人群逐步习服高原环境的关键因素 。体内外研究显示，高原移居人群能量代谢逐步呈现“高原化”特征，即“能量节省化”现象。等 研究表明，急进高原（，月）人群定量负荷运动能量消耗显著高于平原（）能耗水平，且高原习服超 年可能使机体定量负荷运动能耗接近世居高原人群。动物实验证实，低氧暴露大鼠心肌组织脂肪酸氧化及丙酮酸氧化能力持续降低，随着长时间高海拔暴露（），肌肉组织线粒体密度下降，缺氧信号通路可能在该过程中发挥作用 ，但应考虑到高海拔环境低氧、低压、低温的混杂因素。然而，有证据表明，高原原住居民低氧适应的自然选择可能通过线粒体自噬诱导的缺氧诱导因子途径，且该群体的代谢特征（如，较低的心肌磷酸肌酸与 比率、较高的心脏葡萄糖摄取和较低的肌组织线粒体密度）与低海拔原住居民类似 ，因此线粒体自噬诱导的低氧诱导因子途径可能在高原移居人群心肌、骨骼肌能量代谢反应中发挥重要作用。前期研究证实，线粒体自噬是缺氧受损线粒体凋亡的重要发起方式 。线粒体自噬包括同源性磷酸酶张力蛋白诱导激酶 （，）帕金森蛋白（）、相互作用蛋白 （，）样蛋白（，）和 结构域包含蛋白 （，）等多条通路。既往研究认为，线粒体能量代谢的适应性变化在高原环境习服过程中发挥重要作用 ，但有关线粒体自噬与定量负荷运动能耗特征间的关系以及二者的变化特征是否会影响高原移居人群的运动能耗的研究，国内外鲜有报道。基于此，本研究以高原移居人群外周血单个核细胞（，）线粒体自噬、线粒体呼吸链复合酶活性与运动能耗的变化规律为切入点，力求探析高原习服人群运动能耗变化的分子机制。资料与方法 测试对象本研究招募世居 海拔高原及移居 海拔高原（世居 海拔以下）的 岁健康青年男性，纳入标准为：（）青年男性，年龄介于 岁，无心血管系统、呼吸系统疾病及慢性代谢病史；（）无肢体残疾；（）近 年无手术史；（）无饮酒、药物依赖史；（）可完成既定运动试验。排除标准包括：（）患心血管系统、呼吸系统及慢性代谢疾病；（）习惯性饮酒或药物依赖；（）近 月有急下高原或急进高原史；（）存在其它潜在运动风险。最终，本次研究纳入 名受试者，受试者年龄（）、民族成分及 （）等人口学特征指标之间均无统计学意义（，表）。参照 等 对高原习服时间的界定，本研究将高原移居者初步习服、基本习服及完全习服的时间切点确定为 年、年及 年。将受试者区分为高原移居组（）、高原移居组（）、高原移居组（）和世居高原组（）。（）（）（）（）（）（），（）（），（）（），（）；（）（）；（）；（）：；：【基金项目】国家自然科学基金（）；新疆维吾尔自治区高校科技计划（）【收稿日期】【修回日期】【通讯作者】：；：运动能耗监测采用 加速度计监测受试者运动能耗，参照王道等 研究中关于加速度计收集运动信息参数及运动能耗计量方法，受试者将加速度传感器佩戴于髋部，先进行约 跑台的适应性走、跑练习，适应性练习后休息 ，待心率恢复至练习前水平，依次完成 （慢走），（正常速度行走），（快走），（跑步）测试，每项走、跑活动时间为 ，每项活动间歇 ，实时采集运动学参数。参照杨世军 对加速度计与运动能耗的推算公式进行换算，公式为：（）（）。外周血 线粒体分离受试者于清醒、安静状态下，卧位取 静脉血，将全血转入 离心管，加入 磷酸盐缓冲液稀释并混匀；取两支 离心管，先加入 蔗糖多聚体溶液；将稀释血分别加入两支离心管上层，离心 ，所在细胞层为白色；吸取该层细胞，转移至清洁 离心管；加入磷酸盐缓冲液至 ，离心 后去上清，离心 ，培养基重悬，即获得 。于裂解液中裂解 ，、离心 ；取上清，、离心 ，取沉淀获得线粒体粗提 ，（）组分；起始缓冲液重悬，、离心 ，重复次、纯化；离心 ，取沉淀加入蛋白裂解液超声裂解，每次 ，重复 次；离心 、，取上清液；加入细胞分离液，、离心 ，获得精提纯线粒体组分；、离心 纯化后保存备用。酶联免疫检测线粒体呼吸链酶活性酶联免疫吸附试验检测受试者 线粒体 氧化还原酶（复合物）、琥珀酸 氧化还原酶（复合物）、细胞色素 氧化还原酶（复合物）、细胞色素 氧化酶（复合物）水平。取 线粒体裂解物，加入 总 抽提试剂，充分混合，转移至 管中，室温反应 ；，离心 ，取上清，加 氯仿，剧烈振荡 管 ，室温反应 ；，离心 ，取水相；加等体积异丙醇，室温反应 ；，离心 ，弃上清；每 管加 乙醇洗涤 沉淀；，离心 ，弃上清，洗涤后稀释备用。扩增条件为：预变性 ，、，末段 延伸 ，熔解曲线 ，每 升温，循环 次。根据熔解曲线剔除异常数据，导出数据后，逐个计算样品目标基因相对表达量。实时荧光定量 引物序列见表 。（）（）取线粒体裂解物，加入 蛋白抽提试剂，充分混合 管中，冰上孵育 ；，离心 ，取上清，低温保存备用。使用 蛋白浓度试剂盒测定蛋白浓度，加入上样缓冲液，变性 。配置聚丙烯酰胺凝胶，浓缩胶恒压 电泳 ，分离胶恒压 电泳至溴酚蓝到达分离胶底部，上样，电转法将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯膜。脱脂牛奶室温封闭 ，加入一抗（稀释），摇床孵育过夜；缓冲盐 吐温溶液洗膜 次，加二抗（稀释），孵育 ；缓冲盐 吐温溶液洗膜 次。采用增强化学发光法显影，凝胶成像系统成像后使用 软件分析，以 作为内参，以目的蛋白条带和内参蛋白条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。统计学处理数据以平均数 标准差（珋 ）表示，采用 统计学软件进行统计分析，两样本平均数间比较采用 检验分析，组间比较采用单因素方差分析，均值比较采用 检验。结果 不同高原适应人群运动能耗的比较由表 可知，各组受试者运动能耗随走、跑速上升而增加。就 阶段而言，与 组比较，、组显著上升（）；与 组比较，组显著降低（）。就 阶段而言，与 组比较，组显著上升（）。就 及 阶段而言，与 组比较，组显著上升（）；与 组比较，组显著降低（）。（）：；：；不同高原适应人群线粒体呼吸链复合酶活性的比较由表可知，组受试者 线粒体复合物、复合物及复合物水平显著高于 、和 组（），组和 组 线粒体复合物、复合物及复合物水平显著低于 组，组显著低于 组（）；组复合物显著高于 、组，、组显著低于 组（）。（）（）（）（）：；：；中国应用生理学杂志，（）不同高原适应人群 线粒体自噬、融合 分裂相关 表达的比较 线粒体自噬相关基因表达检测结果显示（图 ），及 表达随高原移居时间延长而下降，及 表达随高原移居时间延长而上升。就 表达而言，与 组比较，、及 组显著上升（）；与 组和 组比较，组显著降低（）。就 表达而言，与 组比较，、及 组显著下降（）；与 组比较，、组显著上升（）。就 表达而言，与 组比较，、及 组显著降低（）；与 组和 组比较，组显著上升（）；与 组比较，显著降低（）。就 表达而言，与 组比较，、及 组显著上升（）；与 组和 组比较，组显著降低（）；与 组比较，显著上升（）。，：；：；不同高原移居人群 线粒体自噬相关蛋白表达就 蛋白表达而言（表 、图 ），与 组比较，组、和 组显著上升（）；与 组和 组比较，组显著降低（）。就 蛋白表达而言，与 组比较，组、组显著降低（）；与 组和 组比较，组显著上升（）；与 组比较，组显著降低（）。就 蛋白表达而言，与 组比较，组、和 组组显著上升（）；与 组和 组比较，组显著上升（）。就 蛋白表达而言，与 组比较，组、和 组显著上升（）；与 组和 组比较，组显著降低（）；与 组比较，组表达显著上升（）。：；：；讨论本研究结果表明，世居高原人群定量负荷运动单位时间及总体能量消耗低于移居高原人群，且伴随高原移居时间延长，受试者定量负荷运动能耗水平呈下降趋势。队列研究显示，移居高原人群在高海拔地区完成既定运动任务都将以相对较高的运动强度完成，运动强度上升的直接原因是高原低氧诱导的 下降 ，。前期研究证实，当人体暴露于高原环境数天、数周乃至数月后，机体会逐渐习服低氧环境，但并不能完全改善机体的缺氧状态 。短期低氧暴露可能导致线粒体基质代谢应激性反应，同时，骨骼肌的葡萄糖摄取率显著高于平原等效运动任务，游离脂肪酸（）利用效率显著下降，继而诱导亚极量运动期间血浆、骨骼肌乳酸过量堆积。随着高原暴露时间延长，机体通过提高能量利用效率以减少机体定量负荷运动能量消耗。基于此，高原低氧环境中，高原移居人群氧利用效率降低、能量代谢阻滞、代谢产物堆积可能是导致其等效运动能耗上升的重要因素。上述生理指征改善也直接诱导定量负荷运动能耗的降低。中短期高原低氧暴露可能改变骨骼肌线粒体形状结构，诱导机体线粒体呼吸链复合体酶活性下降，进而介导线粒体氧化磷酸化调控障碍并抑制 合成过程 。有研究认为，短期低氧暴露可通过下调复合物、复合物及复合物表达激活线粒体呼吸链中电子漏，从而促进活性氧（，）合成 。随着高原暴露时间延长，机体能量代谢效率逐步适应高原低氧环境，机体也可以通过改变复合物 的组成亚型，进而增强复合物 与 的亲和力并改善 利用效率。同时有研究证实，长期低氧暴露通过诱导复合物 降解并改变其亚型结构使环氧合酶（，）在低氧条件下维持最佳的催化效率 。在逐步习服低氧环境的过程中，机体糖酵解效应及线粒体呼吸效率上升，以减少氧气的需求并维持正常的能量供应，同时抑制活性氧对细胞的损伤，这可能是不同高原移居人群线粒体呼吸链酶活性发生动态变化的因素之一，但仍依赖大样本量的队列研究进行证实。大量研究表明，缺氧是诱导细胞自噬的强刺激剂，可促 ，（）使线粒体大量生成 并激活线粒体自噬信号分子 。本研究显示，高原移居人群 线粒体自噬相关蛋白表达与高原移居时间密切相关，随高原移居时间延长，及 蛋白表达呈下降趋势、及 蛋白表达呈上升趋势。在正常的线粒体内稳态中，锚定于线粒体外膜（，），在线粒体外膜转位蛋白（，）复合物及线粒体内膜转位蛋白（，）复合物的作用下进入线粒体内膜（，）被裂解。初上高原导致的线粒体受损可能诱导 通过外膜转位酶（）在线粒体外膜积累，激活并招募 ，随后线粒体外膜上的电压依赖性阴离子通道 （，）蛋白和线粒体融合素基因（，）被泛素化，诱导线粒体自噬并促进线粒体结构逐渐恢复，这与机体逐步习服高原低氧环境的时程也是基本吻合的。据报道，长期低氧暴露可能通过促进线粒体的生物发生及有丝分裂吞噬清除老化或受损的线粒体，确保在低氧环境中线粒体保持较高的活性和能量代谢效率 。尽管已有证据显示低氧诱导的自噬参与长期低氧暴露进程中线粒体更新的调控，但其潜在的分子机制仍有待探索。此外，本研究结果表明，低氧诱导 线粒体自噬通过影响线粒体代谢酶活性以调控高原移居人群运动能耗水平。生理状态下，线粒体自噬在衰老线粒体清除及线粒体稳态中发挥重要作用，线粒体可通过自噬改变自身形态和数量以应对低氧环境的能量需求并发生适应性变化 。在本研究也发现移居高原 年后，线粒体自噬水平远高于长期高原移居者，其可能机制为机体能量消耗受低氧条件影响而显著上升，低氧应激可导致一部分线粒体形态和结构遭到破坏，并产生大量活性氧，导致 生成减少，使组织细胞处于“饥饿状态”。通过上调线粒体自噬水平可及时清除该类受损线粒体，保证正常线粒体数量的充足性和功能的完整性，由此代偿性增加 合成，使细胞能量需求与供给恢复动态平衡，并降低“饥饿”组织细胞的损伤风险。因此，本课题组推测，伴随高原移居时间延长，线粒体自噬水平回落，其可能机制在于先前的低氧应激效应消退，能量代谢障碍现象缓解，定量负荷运动能耗降低。综上所述，中短期高原移居人群可能通过提高 线粒体自噬水平维持移居初期线粒体功能并诱导定量负荷运动能耗上升；随着高原移居时间延长，线粒体自噬水平逐渐消退，线粒体呼吸链酶活性逐渐趋向“高原化”，最终呈现高原定量负荷运动“能量节省化”现象。研究结果可为高原地区不同人群运动健身和运动机能监测提供科学指导，同时为高原人群运动能耗适应机制的研究提供实验依据。【参考文献】阳盛洪，李彬，高亮，等帕米尔高原慢性高山病患病调查分析 中国应用生理学杂志，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：陈郁，高亮，龚亮，等线粒体 单倍群：中国塔吉克族高原原发性高血压的遗传易感因素 中国应用生理学杂志，（）：，（）：王道，刘欣，江崇民，等 加速度计测量走、跑运动时基本参数特征及与能耗的相关性研究 体育科学，（）：杨世军佩戴部位、活动类型影响加速度计能耗监测准确性的研究 四川师范大学，（）：孔海军，周霞，李新龙，等世居高原健康成人逐级递增负荷运动测试心率拐点与乳酸恢复能力、肺功能的相关性 中国应用生理学杂志，（）：李雪，李文斌，封士兰，等血红蛋白在高原低氧适应中的机制研究进展 浙江大学学报（医学版），（）：张欣，王瑞元大负荷运动诱导大鼠骨骼肌损伤对其自噬超微结构及 和 的影响 中国应用生理学杂志，（）：周文婷，胡扬，徐飞急性低氧暴露与低氧运动习服的血液学评价指标 中国应用生理学杂志，（）：王林佳，魏昊，严露，等低氧预适应对小鼠骨骼肌 和线粒体呼吸链复合物蛋白表达及运动能力的影响 北京体育大学学报，（）：中国应用生理学杂志，（），（）：旦增诺扬，格日力线粒体在低氧适应中的改变及机制 中国高原医学与生物学杂志，（）：张子怡，舒田，薄海，等低氧和低氧复合运动通过 途径调控骨骼肌线粒体生物合成 中国运动医学杂志，（）：，（）：人参复方对急性低氧环境中小鼠抗疲劳的作用赵丽，李萌，马博华，是文辉，王瑞，尹东锋（解放军总医院京南医疗区新兴桥门诊部，北京 ；中国人民解放军新疆军区总医院，新疆 乌鲁木齐 ；石河子大学药学院，新疆 石河子 ）【摘要】目的：在模拟海拔 高原低氧环境中观察人参复方对急性低氧小鼠抗疲劳的作用。方法：将 级昆明小鼠分为正常组、缺氧模型组、阳性对照组（红景天）、人参复方低剂量组（）、中剂量组（）、高剂量组（），正常组和缺氧模型组灌等量生理盐水，按 体质量每天灌胃一次，连续灌胃给药 ，利用特殊环境人工低压氧舱模拟海拔 建立小鼠急性低氧模型，除正常组外，其余组小鼠均置于人工低压氧舱中，历时 ，然后进行负重游泳，记录小鼠负重游泳力竭时间，检测超氧化物歧化酶（）、丙二醛（）、谷胱甘肽过氧化物酶（）、三磷酸腺苷（）、尿素氮（）、肌糖原（）、肝糖原（）、乳酸（）、乳酸脱氢酶（）含量。结果：与缺氧模型组相比，人参复方对小鼠负重游泳力竭时间显著延长（）；与正常组相比，人参复方低、中、高剂量组血清中 、含量均显著升高（）；与阳性对照组相比，人参复方高剂量组血清中 含量显著升高（）；与缺氧模型组相比，人参复方低、中、高剂量组血清中 、含量显著降低（），肝糖原中 含量显著升高（），人参复方中、高剂量组血清中 、含量、肌糖原中 含量显著升高（），含量显著降低（），人参复方高剂量组 含量显著升高（）。结论：人参复方可显著提高急性低氧环境中小鼠抗疲劳作用。【关键词】高原；急性低氧；抗疲劳【】；【中图分类号】【文献标识码】【文章编号】（）【】【基金项目】新疆维吾尔自治区区域协同创新专项（科技援疆计划）【收稿日期】【修回日期】【通讯作者】：；：我国高原面积广阔，海拔在 以上的地区占国土面积的 ，自然环境恶劣，具有低压、低氧、紫外线强等特点，其中，低压低氧是高原环境的主要特征之一，当世居平原的人群急性暴露在低氧环境中时，因空气中的氧分压下降，导致动脉血氧饱和度降低 ，引起一系列缺氧性疲劳等问题。有研究表明，在海拔 处其劳动效率相比于平原降低 ，可能与机体内代谢物积累、氧化应激水平失衡、能量物质消耗等相关 。研究显示，复方中药具有温补肾阳、益气养阴、宁神益智、滋补强壮、豁痰开窍等功效，其疗效稳定、毒副作用少，在抗缺氧及提高机体耐缺氧能力方面具有明显的优势，但是，目前有关复方中药对急进低氧环境中抗疲劳作用研究的报道相对较少。人参皂苷作为人参的主要活性成分，能减少脑缺血性损伤，抑制骨骼肌氧化刺激和改善能量代谢，增强细胞抗氧化作用，增强耐受性 。丹参提取物可调节糖脂代谢、清除自由基、保护细胞免受氧化应激的损伤，降低丙二醛含量，提高超氧化物歧化酶活力，修复已受损的肝细胞 。欧白及（又名苏来甫），具有温肾壮阳，填精肥体，滋补支配器官（脑、心、肝），强筋健肌，补血养发等药理作用 。肉苁蓉历来用于补肾阳、益血精髓等功能 ，主要有效成分苯乙醇苷具有抗氧化、抗炎、抗疲劳等药理作用，抑制脂质过氧化、清除自由基、增强机体抗氧化能力 。因此，本研究是在课题组前期对复方双参合剂抗疲劳作用的研究 、以及复方双参欧白及提取物对低氧致雄性 大鼠生殖功能损伤的影响研究的基础上 ，添加具有很高药用价值且具有明显抗缺氧抗疲劳作用的中国传统中药肉苁蓉，以人参、丹参为君药，肉苁蓉为臣药，欧白及为佐药，组成人参复方，观察其对小鼠在急性低氧环境中抗疲劳作用进行研究，以期为人参复方作为高原低氧中抗疲劳药物提供实验依据。，（）