阿替利珠单抗修饰二氢丹参酮Ⅰ纳米粒的制备及其抗肿瘤作用研究.pdf

2577中南药学 2023 年 10 月 第 21 卷 第 10 期Central South Pharmacy.October 2023,Vol.21 No.10 阿替利珠单抗修饰二氢丹参酮纳米粒的制备 及其抗肿瘤作用研究王雪，荆紫琪，李妍怡，李楚，闫天月，黄晓滨，张玉杰*，马鹏凯*（北京中医药大学中药学院，北京102488）摘要：目的构建阿替利珠单抗修饰二氢丹参酮纳米粒（ATEZO DHT NP），优化其制备工艺，并进行体内外药效评价。方法采用乳化溶剂扩散法制备载二氢丹参酮聚合物纳米粒（DHT NP），以包封率为评价指标，单因素实验联合正交设计优化制备工艺；阿替利珠单抗巯基化后与 DHT NP表面马来酰亚胺基反应，制备 ATEZO DHT NP，BCA 法测定单抗的偶联率和载药量；粒度仪考察纳米粒粒径和电位，透射电镜观察纳米粒形貌，并考察稳定性和体外释药情况；在胃癌细胞模型上，激光共聚焦显微镜评价细胞摄取情况，MTT法考察细胞毒性，流式细胞术考察细胞凋亡情况；在胃癌裸鼠模型上，通过肿瘤体积变化、HE 和 TUNEL染色法评价药物抗肿瘤药效，生理生化检测和正常组织 HE 染色评价药物安全性。结果ATEZO DHT NP的最佳制备工艺为：有机相浓度为 1.5%，水相为 2%胆酸钠溶液，有机相与水相体积比为 11.8，药物与载体质量比为 12；DHT NP的二氢丹参酮载药量和包封率分别为 11.73%和 54.49%；ATEZO DHT NP的阿替利珠单抗偶联率和载药量分别为 56.93%和14.43%，粒径 246.9 nm，Zeta电位 19.57 mV，形态近似球形，具有良好的稳定性和缓释特性。在胃癌细胞模型上，ATEZO DHT NP有效提高原药细胞增殖抑制能力和诱导细胞凋亡能力；在胃癌裸鼠模型上，ATEZO DHT NP诱导肿瘤细胞凋亡，显著抑制肿瘤生长，给药期间裸鼠体重无明显下降，血浆生化指标均在正常范围，主要器官形态学无变化，没有明显的毒副作用。结论本研究成功构建了 ATEZO DHT NP，能有效增强二氢丹参酮的体内外抗肿瘤作用且安全性良好。关键词：二氢丹参酮；阿替利珠单抗；纳米粒；抗肿瘤中图分类号：R94，R283文献标识码：A文章编号：1672-2981(2023)10-2577-08doi:10.7539/j.issn.1672-2981.2023.10.005Preparation and anti-tumor effect of atezolizumab modified dihydrotanshinone nanoparticlesWANG Xue,JING Zi-qi,LI Yan-yi,LI Chu,YAN Tian-yue,HUANG Xiao-bin,ZHANG Yu-jie*,MA Peng-kai*(School of Chinese Materia Medica,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 102488)Abstract:Objective To construct atezolizumab modified dihydrotanshinone poly(lactic-co-glycolic acid)-polyethylene glycol nanoparticles(ATEZO DHT NP),optimize their preparation,and evaluate their efficacy in vivo and vitro.Methods Dihydrotanshinone polymer nanoparticles(DHT NP)were prepared by emulsion solvent diffusion.The encapsulation rate and drug loading were used as the evaluation indexes,and the preparation was optimized by single-factor investigation combined with orthogonal design.Subsequently,the hihydrated atezolizumab reacted with the maleimide group on the DHT NP surface.Atezolizumab on the DHT NP surface was modified to 基金项目：国家自然科学基金青年基金项目（No.82104404）。作者简介：王雪，女，硕士，主要从事中药纳米靶向制剂研究，email：*通信作者：张玉杰，女，教授，主要从事中药药动学研究，email：；马鹏凯，男，博士，讲师，主要从事中药新剂型开发及抗肿瘤机制研究，email：2578Central South Pharmacy.October 2023,Vol.21 No.10 中南药学 2023 年 10 月 第 21 卷 第 10 期二氢丹参酮（dihydrotanshinone，DHT）是从中国传统植物丹参的根茎中提取出的一种脂溶性菲醌类成分，具有扩张冠状动脉和改善心肌缺血等作用1。研究表明，DHT对卵巢癌、肝癌、胃癌等多种恶性肿瘤均具有良好的治疗作用2-5。尽管 DHT具有极高的药用价值，但存在水溶性差、靶向性差、副作用大等问题，极大限制了其临床应用和新药开发。聚合物纳米粒是以适当的载体材料与药物结合形成的具有纳米尺度的药物制剂6-7。纳米粒作用优势在于药物可包封于纳米粒中以提高溶解度，通过其纳米尺度特有的肿瘤增强的渗透和滞留效应（EPR 效应）选择性在肿瘤部位聚集，实现被动靶向功能8。并且可通过各类功能分子对聚合物材料进行修饰实现特定功能，如针对肿瘤细胞过表达的受体或抗原，通过氨基酸、糖类、多肽和抗体等对纳米粒进行修饰，利用配体-受体或抗原-抗体的特异性相互作用，进一步提高纳米粒对肿瘤细胞的主动靶向能力，增强肿瘤细胞摄取，增加胞内药物浓度以提高药效9-10。近年来，以免疫检查点阻断（immune check-point blockade，ICB）为代表的免疫疗法逐渐成为肿瘤治疗主流11-13。目前以程序性死亡受体-1（programmed death 1，PD-1）及 其 配 体 1（pro-grammed death 1 ligand 1，PD-L1）14为靶点的免疫检查点阻断疗法最为成熟15。阿替利珠单抗（atezolizumab，ATEZO）是针对 PD-L1 的人源化免疫球蛋白 G1 单克隆抗体，通过作用于肿瘤细胞过表达的 PD-L1，阻止 PD-1 和 PD-L1 相互结合，激活免疫细胞杀伤肿瘤16-19。有研究发现，通过抗 PD-L1 单抗或多肽修饰纳米载体20，可以提高药物对肿瘤组织靶向性，与化疗药物产生协同治疗作用，更好地治疗肿瘤。基于此，本研究以聚乳酸-羟基乙酸-聚乙二醇-马来酰亚胺（PLGA-PEG-Mal）为载体材料，制备载 DHT纳米粒，提高 DHT生物利用度及肿瘤组织靶向性，并在纳米粒表面修饰 ATEZO，制备主动靶向 PD-L1 的 ATEZO DHT NP，进一步提高肿瘤细胞靶向性和胞内药物浓度，提高抗肿瘤药效。1材料1.1动物7 周龄 BALB/c雄性裸鼠 36 只，体重（202）g prepare ATEZO DHT NP,and the atezolizumab coupling rate and loading rate were determined by BCA.The particle size and potential were determined by particle size analyzer.The morphology of nanoparticles was observed by transmission electron microscopy.The stability and drug release in vitro were determined.In the gastric cancer cell model,the cellular uptake was evaluated by laser-based confocal microscopy,cytotoxicity determinated by MTT method,and apoptosis detected by flow cytometry.In the nude mouse model of gastric cancer,the antitumor efficacy was evaluated by tumor volume change,tumor tissue HE and TUNEL staining.Physiological and biochemical tests and normal tissue HE staining was used to evaluate the safety.Results The optimal preparation process of ATEZO DHT NP was as follows:the organic phase concentration was 1.5%,the aqueous phase was 2%sodium cholate solution,organic phase to aqueous volume ratio at 11.8,drug-carrier mass ratio at 12,DHT NP drug loading was 11.73%and the encapsulation rate was 54.49%.The coupling rate and atezolizumab loading of ATEZO DHT NP were 56.93%and 14.43%,respectively.The particle size of ATEZO DHT NP was 246.9 nm,with a Zeta potential of 19.57 mV,with an approximate spherical shape,good stability and sustained release characteristics.In the gastric cancer cell model,ATEZO DHT NP significantly improved the ability of original drug to inhibit the cell proliferation and induced cells apoptosis.In the nude mouse model of gastric cancer,ATEZO DHT NP significantly inhibited the tumor growth,causing tumor cell apoptosis.During the administration,nude mice had no significant decrease in the body weight,and the plasma biochemical indexes were in the normal range.No changes in the main organ morphology and no obvious toxic side effects were found.Conclusion ATEZO DHT NP is successfully constructed,which can effectively enhance the anti-tumor effect of dihydrotanshinone in vitro and in vivo safely.Key words:dihydrotanshinone;atezolizumab;nanoparticles;antitumor2579中南药学 2023 年 10 月 第 21 卷 第 10 期Central South Pharmacy.October 2023,Vol.21 No.10 北京维通利华生物技术有限公司，合格许可证号：SCXK（京）2021-0006。饲养期间自由进水进食，实验流程符合实验动物管理和保护的相关规定。1.2试药二氢丹参酮（纯度：98%，成都植标化纯生物技术有限公司，批号：210409）；甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸（mPEG-PLGA，批号：RM0212213）、PLGA-PEG-Mal（批号：RA0220627）（西安瑞禧生物科技有限公司）；阿替利珠单抗注射液（上海罗氏制药公司，批号：H0228801）；Sephadex G-50 medium（北京索莱宝科技有限公司，批号：20210930）；2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐（Traut s试剂，纯度：98%，上海源叶生物科技有限公司，批号：J28GS156194）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号：090321220106）；人胃癌细胞 HGC-27（北京北纳创联生物科技有限公司）；IR808（纯度：99%，上海凯瑜琳医药科技有限公司，批号：IR808-202001）；Annexin-V-FITC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒（北京百瑞极生物技术有限公司，批号：273D0101）；注射用紫杉醇脂质体（南京绿叶制药有限公司，批号：221120921）。1.3仪器RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；LGJ-10 真空冷冻干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司）；ZEN3600 Nano微射流均质机（上海诺泽流体科技有限公司）；T10 basic S025高速分散机（德国 IKA）；1290 Infinity 超高效液相色谱仪 安捷伦科技（中国）有限公司；Malvern Zetasizer Nano-ZS动态光散射粒度仪（英国 Malvern Instruments）；TCS-SP8 激光共聚焦显微镜（德国 Leica）；SRSPECTROstar Nano多功能酶标仪（德国 BMG）；A00-1-1102 流式细胞仪 贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司。2方法与结果2.1DHT NP的制备采用乳化溶剂扩散法制备 DHT NP。称取处方量 mPEG-PLGA和 DHT 溶解在丙酮中，作为有机相，乳化剂溶于去离子水中作为水相，将有机相逐滴滴入水相后在高速分散机作用下分散 30 min，形成粗乳液，粗乳液经微射流均质机整粒形成细乳液，将细乳液滴入 5 倍体积的 4冷水中，固化形成纳米粒混悬液。旋转蒸发仪去除丙酮后，纳米粒溶液经 50 kDa超滤离心管 4离心3 次（3000 g，15 min），去除游离药物，收集超滤离心管上部溶液，冻干，得到 DHT NP。2.2载药量和包封率的测定采用超高效液相色谱法对 DHT进行含量测定。色谱条件：流动相为甲醇和水（8020），色谱柱为 Akzo Nobel Kromasil C18（4.6 mm150 mm，5 m），检测波长为 280 nm，流速为 0.8 mLmin 1，柱温为 25。经方法学验证符合药典要求。将 DHT NP完全溶解在甲醇中，定容后测定DHT含量，计为 W总；取等量 DHT NP溶液超滤离心去除游离药物，纯化后的 DHT NP溶液溶解在甲醇中，测定 DHT NP中封装的 DHT含量，计为 WD；将等量纯化后的 DHT NP溶液冻干得到DHT NP，称重计为 WNP，载药量和包封率计算如下：包封率（%）WD/W总100%；载药量（%）WD/WNP100%。2.3正交试验优化 DHT NP制备工艺以有机相浓度（A）、药物与载体质量比（B）、有机相与水相体积比（C）为影响因素（见表 1），以包封率为指标，利用 SPSS 20.0 软件进行正交试验设计，结果见表 2 和 3，方差分析结果表明，整体模型未达到显著水平（P 0.05），可通过直观分析进行判断。由直观分析可知，3 个因素对DHT NP的影响程度依次为 A C B，最优工艺条件确定为 A2B1C2，即有机相浓度为 1.5%，药物与载体质量比 1 2，有机相与水相体积比为1 1.8。在此条件下，DHT NP 的二氢丹参酮载药量和包封率分别为 11.73%和 54.49%。表 1因素水平 Tab 1Factor and level水平因素有机相浓度（A）/%药物与载体质量比（B）有机相与水相体积比（C）1 1 1211021.51.1111.83 2 2111DHT NP的制备工艺如下：精密称取 DHT 5 mg、mPEG-PLGA 10 mg于反应瓶中，加入 1 mL丙酮，超声溶解形成有机相；精密称取胆酸钠 36 mg溶于 1.8 mL去离子水中形成水相；高速分散作用下形成粗乳液，经微射流均质机整粒，均质强度 10 000 psi，均质 15 min形成细乳液；将细乳液滴入 5 倍体积的 4去离子水中固化形成纳米粒混悬液。采用旋转蒸发的方法去除纳米粒混悬液中的有机溶剂，超滤离心管离心除去未包封的药物。上述制备条件下，预冻后冷冻干燥 48 h，即得 DHT NP。在此条件下进行试验验证，3 次2580Central South Pharmacy.October 2023,Vol.21 No.10 中南药学 2023 年 10 月 第 21 卷 第 10 期试验得到 DHT NP包封率的平均值为 54%，与理论值接近，说明模型可靠。表 2正交试验结果 Tab 2Orthogonal experimental试验号ABC包封率/%111115.20212236.09313344.41421254.49522134.48621314.51731215.69832329.39933130.55K1 95.7099.89 80.23K2103.4899.96106.27K3 75.6374.96 88.31R 27.8525.00 26.04表 3误差分析 Tab 3Error analysis方差来源平方和df均方FSig.校正模型1468.4166244.7368.4380.110截距8391.17118391.171289.2950.003A137.662268.8312.3730.296B1212.3172606.15920.8980.046C118.437259.2182.0420.329误差58.011229.006总计9917.5989校正的总计1526.42782.4ATEZO DHT NP 的制备取 1 mL 阿替利珠单抗注射液（60 mgmL 1）置 10 kDa超滤离心管中，加 4 mL pH 8.0 PBS，4超滤离心（3000 g，15 min）至液体量剩余 1/2，再补加等体积 PBS，重复 5 次后，得到 ATEZO磷酸盐缓冲溶液。通过 Traut s试剂对抗体进行巯基化修饰，BCA法和 DTNB法分别测定蛋白和巯基含量，计算每个抗体修饰巯基个数。ATEZO溶液与Traut s试剂反应比例为 120 时，单位抗体修饰的巯基为 7.7 个，为最佳反应比例，ATEZO溶液与 Traut s试剂反应时间为 1 h时，溶液浑浊，所以ATEZO溶液巯基化的反应时间不宜过长。将巯基化ATEZO与马来酰亚胺基封端的 DHT NP混合，在黑暗中搅拌 12 h，反应后的混合物在 12 000 rmin 1、4下离心 40 min，收集含有游离巯基化 ATEZO的上清液，采用 BCA法测定上清液中游离的单抗含量。同时收集离心后沉淀进行冻干，获得 ATEZO DHT NP，ATEZO偶联率和载药量计算公式如下，ATEZO DHT NP的 ATEZO偶联率为 56.93%，载药量为 14.43%。偶联率（%）（ATEZO投入量上清中 ATEZO的量）/ATEZO投入量 100%；载药量（%）（ATEZO投入量上清液中 ATEZO的量）/ATEZO DHT NP的质量 100%。2.5纳米粒的表征将冻干的纳米粒分别分散于超纯水和含 10%FBS的 PBS（10 molL 1，pH 7.4）溶液中，并且分别取静置 2、4、8、12、24、48、72 h后的纳米粒溶液，用马尔文粒度仪进行粒径的测定，观察粒径变化，同时测量纳米粒电位。如图 1 所示，DHT NP粒径为 184.9 nm，Zeta电位为 18.55 mV；ATEZO DHT NP粒径为 246.9 nm，Zeta电位为 19.57 mV，72 h内两种纳米粒在水溶液和含 10%FBS的 PBS溶液中粒径变化不大，表明其具有良好的稳定性。将DHT NP和 ATEZO DHT NP分散于超纯水中，选择合适的浓度，吸取 500 L样品，多次滴加于电镜专用铜网表面，待自然干燥后，通过透射电子显微镜拍摄到 DHT NP和 ATEZO DHT NP都近似球形，分布均匀，结果见图 2。图 1不同纳米粒的粒径变化Fig 1Change of particle sizes in different nanoparticles图 2DHT NP和 ATEZO DHT NP的透射电镜图（30 000）Fig 2Morphology image of DHT NP and ATEZO DHT NP（30 000）2.6纳米粒体外释药特性采用透析法对体外释药特性进行考察。精密称取纳米粒分散于 PBS溶液中，得 1 mgmL 1的含药溶液（以 DHT计）。精密移取 1.0 mL纳米粒溶液于透析袋中（MWCO：7 kDa），置于 50 mL的释放介质中（含 0.2%吐温 80 的 PBS溶液），在温2581中南药学 2023 年 10 月 第 21 卷 第 10 期Central South Pharmacy.October 2023,Vol.21 No.10 度为 37、转速为 100 rmin 1的恒温振荡水浴培养箱摇床中振荡。分别于 0、1、2、4、8、12、24、48、72 h后取 1.0 mL释放介质，测定 DHT浓度 Cd，与此同时补加 1.0 mL新鲜的释放介质至原释放介质中。按下式计算校正浓度 Cc，其中 Wt为纳米粒中 DHT的含量，每组设 3 个平行样品，计算累积释放率（F，%）：Cc Cd 1/50n 1i 1Cd；F（Cc50）/Wt100%。结果如图 3 所示，DHT NP 和 ATEZO DHT NP 在前 10 h的累积释放不超过 60%，然后在接下来的 62 h内观察到药物释放缓慢，表明纳米颗粒具有持续释药的特性。图 3不同样品的体外释药曲线Fig 3Drug release profiles of different sample2.7激光共聚焦显微镜评价药物体外细胞摄取情况将 HGC-27 细胞以 1106个/孔接种于玻璃底激光共聚焦细胞培养皿中，细胞培养 12 h 后，加入荧光标记的纳米颗粒 IR808 NP和 ATEZO IR808 NP（以 IR808 计，终浓度为 4 molL 1），与细胞共孵育 3 h后，除去含药培养基，细胞核 用 Hoechst 33342 染 色 15 min后，用 激 光 共聚焦激光扫描显微镜观察细胞。为了进一步证实 PD-L1 受体介导的特异性细胞摄取，HGC-27细胞用 ATEZO预处理 30 min后，加入 ATEZO IR808 NP，观察荧光强度变化。如图 4 所示，游离的 IR808、IR808 NP和 ATEZO IR808 NP都能被肿瘤细胞有效摄取，经 ATEZO修饰后，细胞对 ATEZO IR808 NP的摄取进一步增强。此外，当 ATEZO预处理 30 min时，由于 ATEZO的阻断作用，ATEZO IR808 NP的荧光强度下降。2.8体外药效学评价采用 MTT法评价细胞毒性。HGC-27 细胞以1104个/孔的密度接种于 96 孔板中。当细胞达到对数生长期时，用 100 L的药物与细胞共孵育，浓度梯度分别为 0.5、1、2、4、8、16、32 和 64 molL 1（以 DHT计），48 h后小心移去含药培养基，每孔加入 100 L的 MTT（0.5 mgmL 1）溶液，放入培养箱中继续孵育 4 h，去除各孔内溶液，加入 150 L DMSO，振荡后，用酶标仪测定 570 nm处各孔吸光度，计算细胞存活率，结果如图5所示。图 5DHT 和 DHT ATEZO，DHT NP 和 ATEZO DHT NP 的细胞毒性（n 6）Fig 5Cell viability of DHT，DHT ATEZO，DHT NP and ATEZO DHT NP（n 6）采用流式细胞仪和 Annexin-V-FITC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡情况。HGC-27 细胞以1106个/孔的密度接种于 6 孔板中，各给药组处理细胞（以 DHT计，浓度为 8 molL 1）。孵育 48 h后，用胰蛋白酶消化细胞，以 1800 rmin 1离心 5 min，然后分散在 100 L预冷的 PBS中。在黑暗中分别加入 5 L的 Annexin-V-FITC/7 和 PI染色液，孵育 15 min。用 400 L PBS稀释细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡水平，以未加药液处理孔为对照组，对照组与各给药组均设有 3 个复孔。结果如图 6 所示，游离 DHT、游 离 DHT ATEZO、DHT NP和 ATEZO DHT NP组的细胞凋亡率分别为（12.60.213）%、图 4HGC-27 细胞对不同载药纳米粒的摄取Fig 4Uptake of different drug-loaded nanoparticles by HGC-27 cells2582Central South Pharmacy.October 2023,Vol.21 No.10 中南药学 2023 年 10 月 第 21 卷 第 10 期（13.20.145）%、（39.60.243）%、（44.20.318）%，与其他各组相比，ATEZO DHT NP的细胞凋亡率最高，与细胞摄取实验和细胞毒性实验结果一致，表明ATEZO DHT NP可以增强 DHT诱导细胞凋亡的能力。图 6对照组及各给药组的细胞凋亡情况Fig 6Cells apoptosis of the control group and different administration groups2.9体内药效学评价HGC-27 肿瘤移植 BALB/c裸鼠模型的建立。用4的 PBS将 HGC-27 细胞稀释为 2108 个 mL 1的细胞悬液，取 0.1 mL细胞悬液，裸鼠用戊巴比妥钠（50 mgkg 1）麻醉后，在裸鼠右腋窝皮下注射接种进行造模，肿瘤体积达到 100 mm3时进行给药。将 36 只荷瘤裸鼠随机分为 6 组：生理盐水组，游离 DHT组，游 离 DHT ATEZO组，DHT NP组，ATEZO DHT NP组，紫杉醇脂质体（Lps-P）阳性对照组，每组 6 只。给药方案为：DHT 15 mg/（kgd），ATEZO 10 mg/（kgd），Lps-P 10 mg/（kgd），2 d给药一次，给药周期 14 d。在给药期间，2 d记录一次裸鼠体重，并使用游标卡尺测量肿瘤体积，结果如图 7 所示。给药结束后第 2 日，所有裸鼠脱颈椎处死，剥离肿瘤组织称重，计算抑瘤率。抑瘤率（生理盐水组肿瘤重量给药组肿瘤重量）/生理盐水组肿瘤重量 100%。图 7不同给药组荷瘤裸鼠肿瘤体积的变化曲线（n 6）Fig 7Tumor volume of nude mice in different administration groups（n 6）结果如图 8 所示，与生理盐水组相比，所有给药组均可抑制 HGC-27 肿瘤裸鼠的肿瘤生长，ATEZO DHT NP组肿瘤抑制率是原药 DHT组 1.90倍，约为 DHT NP组的 1.75 倍。切取部分肿瘤组织用 4%多聚甲醛固定，肿瘤组织切片用 HE染色和 TUNEL染色评估药物对肿瘤细胞的作用，如图9 所示，相比于 DHT NP组，ATEZO DHT NP组肿瘤组织大片坏死，肿瘤细胞凋亡增强，证实了修饰 ATEZO以后可增强 DHT NP的抗肿瘤疗效。图 8不同给药组荷瘤裸鼠的肿瘤抑制率（n 6，*P 0.05，*P 0.01）Fig 8Tumor suppression rate of different administration group in nude mice（n 6，*P 0.05，*P 0.01）2.10体内药物安全性评价在整个给药期间，各组荷瘤裸鼠体重基本保持不变，表明 ATEZO DHT NP没有明显的全身毒性。给药结束后第 2 日，所有裸鼠脱颈椎处死，取血及心、肝、脾、肺、肾脏组织。血液于 4、3500 rmin 1离 心 15 min，收 集 血 浆，并 通 过生理生化测定试剂盒 丙氨酸氨基转移酶 ALT 测定试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶 AST测定试剂盒、尿素氮 BUN 测定试剂盒、肌酐 CRE 测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）分析谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、肌酐（CRE）和尿素氮（BUN）生化指标，ATEZO DHT NP给药组ALT的含量为（119.732.989）UL 1，AST的含量为（146.218.423）UL 1，CRE的含量为（26.064 2.756）molL 1，BUN的 含 量 为（7.8130.139）mgdL 1，均在正常范围内，表明 ATEZO DHT NP无肝肾毒性。心、肝、脾、肺、肾脏组织用 4%多聚甲醛固定，组织切片后用 HE染色评估组织的形态学变化，结果如图 10 所示，显示各治疗组组织形态没有明显变化，进一步确证纳米粒具有良好的安全性。2583中南药学 2023 年 10 月 第 21 卷 第 10 期Central South Pharmacy.October 2023,Vol.21 No.10 图 10裸鼠心、肝、脾、肺、肾脏各脏器的 HE染色结果（100）Fig 10HE stained micrographs of heart、liver、spleen、lung、kidney organ sections（100）图 9肿瘤组织 HE染色（30）（A）和 TUNEL染色（30，300）（B）Fig 9HE staining（30）（A）and TUNEL staining（30，300）of tumor tissue sections（B）2.11统计学分析采用 SPSS 20.0 统计学软件进行分析，数据以平均值 标准差（xs）表示。采用 t检验和单因素方差分析（ANOVA）来比较两组或两组以上之间的数据差异。P 0.05 为差异有统计学意义。3讨论DHT 是中药丹参的活性成分，具有抗肿瘤作用，作为极具开发潜力的药物分子，如何提高DHT 生物利用度和肿瘤靶向性是其临床转化面临的关键问题。纳米药物递送系统可以改善药物理化性质，增强药物肿瘤靶向能力和降低药物毒性。免疫治疗联合化疗是目前癌症治疗的研究热点，本研究选择 ATEZO作为靶头，对 DHT NP进行表面修饰，不仅可以通过纳米粒的被动靶向作用提高药物在肿瘤部位的分布，而且可以借助ATEZO对肿瘤细胞表面过表达 PD-L1 的靶向作用提高药物的胞内浓度，增强药物抗肿瘤作用。本研究通过乳化溶剂扩散法制备 DHT NP，正交试验考察有机相浓度、药物与载体质量比和有机相与水相体积比对包封率的影响，优化得到最佳制备工艺，制得的 DHT NP的载药量为 11.73%，包封率为 54.49%。将巯基化的阿替利珠单抗修饰在DHT NP表面，通过 BCA法测定蛋白偶联率和载药量分别为 56.93%和 14.43%。粒度仪测量 DHT NP粒径为 184.9 nm，粒径合适；修饰 ATEZO后ATEZO DHT NP的粒径有所增加，电位降低；72 h2584Central South Pharmacy.October 2023,Vol.21 No.10 中南药学 2023 年 10 月 第 21 卷 第 10 期内 ATEZO DHT NP在水溶液和含 10%FBS的 PBS溶液中粒径变化不明显，表现出较好的稳定性；透射电镜观测到 DHT NP和 ATEZO DHT NP形貌为球形；纳米粒体外释药情况良好。细胞实验结果显示，ATEZO DHT NP可显著抑制 HGC-27 细胞的增殖；促进 HGC-27 细胞的凋亡。体内抗肿瘤药效评价结果显示，ATEZO DHT NP在动物模型上具有良好的抑制肿瘤生长的能力，肿瘤坏死情况明显。在整个给药周期内，ATEZO DHT NP组动物体重无明显变化，血浆 ALT、AST、CRE和 BUN水平均在正常范围内，未见明显毒性作用；HE染色结果显示各主要脏器未见明显异常，说明 ATEZO DHT NP具有较好的生物安全性。ATEZO DHT NP在提高抗肿瘤效果方面具有巨大的潜力，后续实验可以进一步验证药物具有激活体内 T淋巴细胞免疫从而杀伤肿瘤的作用，为深入开发提供研究基础。参考文献1 林肖惠，徐为人，刘鹏，等.二氢丹参酮的降血脂作用研究J.中草药，2008，39（9）：1378-1380.2 Sun CT，Han B，Zhai YF，et al.Dihydrotanshinone inhibits ovarian tumor growth by activating oxidative stress through Keap1-mediated Nrf2 ubiquitination degradation J.Free Radic Biol Med，2022，180：220-235.3 Han SL，Bi SN，Guo TT，et al.Nano co-delivery of plumbagin and dihydrotanshinone reverses immunosup-pressive TME of liver cancer J.J Control Release，2022，348：250-263.4 钟雄东.丹参有效成分二氢丹参酮抑制胃癌的作用研究J.广州医药，2020，51（6）：11-18.5 Wang XQ，Xu X，Jiang GQ，et al.Dihydrotanshinone inhibits ovarian cancer cell proliferation and migration by transcriptional repression of PIK3CA gene J.J Cell Mol Med，2020，24（19）：11177-11187.6 Chen JH，Ning E，Wang ZJ，et al.Docetaxel loaded mPEG-PLA nanoparticles for sarcoma therapy：prepara-tion，characterization，pharmacokinetics，and anti-tumor efficacy J.Drug Deliv，2021，28（1）：1389-1396.7 Yang JY，Sun B，Wei XL，et al.Arenobufagin-loaded PEG-PLA nanoparticles for reducing toxicity and enhancing cancer therapy J.Drug Deliv，2023，30（1）：2177362.8 Yang ST，Liu Y，Wang YW，et al.Biosafety and