HPLC波长转换法同时测定白芥子饮片中2种活性成分含量.pdf

基金项目：湖南省自然科学基金项目（，）作者简介：包晴，女，生，在读硕士，：收稿日期：波长转换法同时测定白芥子饮片中 种活性成分含量包晴，高元航，谢诗忆，王璐，唐林，黄超文，杨磊（湖南中医药大学第一附属医院药学教研室，长沙 ；通讯作者，：）摘要：目的建立 波长转换法同时测定白芥子饮片中白芥子苷和芥子碱硫氰酸盐含量的方法。方法对建立的高效液相色谱法进行方法学考察，并对收集的 批样品进行白芥子苷和芥子碱硫氰酸盐含量检测。色谱条件采用 柱（，），水（含 磷酸二氢钾，）乙腈（）作为流动相，梯度洗脱，流速为 ；检测波长为 ，以后为 ；柱温；进样量 。结果白芥子苷质量浓度在 （，），芥子碱硫氰酸盐质量浓度在 范围内与峰面积线性关系良好（，）。精密度、稳定性、重复性试验的 ；白芥子苷的平均加样回收率为 ，为 （），芥子碱硫氰酸盐的平均加样回收率为 ，为 （）。结论本研究建立的高效液相色谱法操作简便、结果准确可靠，可用于同时测定白芥子饮片中白芥子苷和芥子碱硫氰酸盐的含量。关键词：白芥子；白芥子苷；芥子碱硫氰酸盐；皮肤发泡；高效液相色谱法中图分类号：文献标志码：文章编号：（）：，（，；，：）：（，）（，）（），（，），（，），（），（），：；白芥子为十字花科植物白芥（）的干燥成熟种子，具有温肺豁痰利气，散结通络止痛的功效 。临床常用于治疗或改善寒性哮喘、鼻炎及阳虚体质、寒湿痹证等疾病 。植物化学研究发现白芥子的主要成分有白芥子苷（）、芥子碱（）、芥子酸（）等 ；芥子碱硫氰酸盐是止咳、平喘、豁痰的药效成分 ；白芥子苷及其降解产物具有镇咳、平喘、抗癌、抗菌等功效 。白芥子最常运用于三伏贴中，但近年来关于三伏贴引起的不良事件常见报道，利用白芥子对患者进行外敷时，使用过量会引起水泡、脓疱 ，易导致皮肤发生过敏反应 。传统经验认为三伏贴的疗效很大程度取决于患者皮肤发泡程度，不及则功效难求，太过则会致皮肤溃烂，因此对于白芥子的用量需要慎重。目前并未有方法能够同时检测白芥子苷的含量以及芥子指标性成分芥子碱硫氰酸盐的含量。因此，为探究白芥子饮片中有效成分的含量，本研究通过实验建立能够同时测定白芥子饮片中白芥子苷及芥子碱硫氰酸盐的高效液相色谱法，以期为白芥子质量评价和相关制剂产品的质量控制提供参考。，仪器与试药 仪器 型 色谱仪，包括 型 检测器，柱温箱，自动进样器，四元泵（美国安捷 伦 科 技 有 限 公 司）；型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司，功率：，频率：）；型十万分之一分析天平（日本 公司）；色谱柱（，）。试剂与药品对照品白芥子苷（成都埃法生物科技有限公司，批号：，质量分数 ）；芥子碱硫氰酸盐（中国食品药品检定研究院，批号：，质量分数 ）；磷酸二氢钾（，国药集团化学试剂有限公司，批号：，含量 ）；甲醇（，国药集团化学试剂有限公司，批号：，含量 ）；乙腈为色谱纯（德国 公司）；水为纯化水。药材分别从不同厂家取得生白芥子饮片及炒白芥子饮片，鉴定为十字花科植物白芥（）的干燥成熟种子。生、炒白芥子饮片样品详细信息见表 和表 。表 生白芥子饮片来源信息及编号 编号品种厂家产地批号 生白芥子 湖南省南国药都中药饮片公司江苏 生白芥子 湖南省南国药都中药饮片公司江苏 生白芥子 安徽药知源中药饮片有限公司四川江油 生白芥子 安徽嘉佑中药饮片有限公司四川德阳 生白芥子 安徽庆春堂药业有限公司河南南召 生白芥子 安徽协和成药业饮片有限公司四川德阳 生白芥子 安徽桐花堂中药饮片科技有限公司四川德阳 表 炒白芥子饮片来源信息及编号 编号品种厂家产地批号 炒白芥子 湖南省南国药都中药饮片公司江苏 炒白芥子 湖南省南国药都中药饮片公司江苏 炒白芥子 安徽药知源中药饮片有限公司四川江油 炒白芥子 安徽嘉佑中药饮片有限公司四川德阳 炒白芥子 亳州市慈济堂中药饮片有限公司四川德阳 炒白芥子 安徽协和成药业饮片有限公司四川德阳 炒白芥子 安徽桐花堂中药饮片科技有限公司安徽安庆 炒白芥子 湖南衡岳中药饮片有限公司河北 方法与结果 色谱条件色谱柱为 柱（，），柱温 ；流动相：水（含 磷酸二氢钾，）乙腈（），梯度洗脱程序：，；，；，；体积流量 ；检测波长 为 ，以后为 ；进样量 。样品制备 对照品溶液的制备对照品储备液的制备：取白芥子苷对照品，精密称定，置 量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得 的白芥子苷对照品储备液。取芥子碱硫氰酸盐对照品，置 量瓶中，乙腈 磷酸二氢钾溶液按 的比例配置溶解芥子碱硫氰酸盐的溶液，用此溶液溶解芥子碱硫氰酸盐对照品并稀释至刻度，摇匀，得 的芥子碱硫氰酸盐对照品储备液。置于冰箱中保存。混合对照品溶液的制备：分别精密吸取上述对照品储备液，的白芥子苷储备液以及 的芥子碱硫氰酸盐储备液置于同一 量瓶中，用山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期甲醇稀释至刻度并摇匀，制成混合对照品溶液。混合对照品溶液中各组分的质量浓度分别为 白芥子苷，芥子碱硫氰酸盐。供试品溶液的制备将白芥子饮片打粉，取 细粉，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加甲醇 ，超声（功率：，频率：）处理 ，滤过，滤渣再用甲醇同法提取两次，滤液合并。将滤液置于水浴锅上蒸干，残渣以乙腈 磷酸二氢钾溶液按 的比例的溶液溶解，转移至 量瓶中，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。方法学验证 专属性试验取空白溶剂甲醇以及“”项下制备的混合对照品溶液，取 白芥子饮片（编号 ），自“”项下精密称定开始按步骤制备的供试品溶液，按照“”项下色谱条件进样检测。对照品与供试品溶液 种成分色谱峰保留时间一致（见图 ），种成分色谱峰分离度良好，空白对照及饮片中其他组分对测定无干扰，表明方法专属性良好。白芥子苷；芥子碱硫氰酸盐图 对照品与供试品色谱图 ，线性关系考察与检测限精密吸取“”项下制备的对照品溶液，取 的白芥子苷溶液以及 的芥子碱硫氰酸盐溶液，并定容至 ，得到含 的白芥子苷和 的芥子碱硫氰酸盐的混合溶液，分别取 ，置于 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，剩余量不稀释作为最终浓度的标准曲线溶液。按照“”项下色谱条件进行进样分析。以各成分进样质量浓度为横坐标（）、峰面积为纵坐标（），用最小二乘法进行线性回归，得回归方程及线性范围，白芥子苷的回归方程为 ，线性范围 ；芥子碱硫氰酸盐的回归方程为 ，线性范围 （见表 ）。结果显示，种成分在相应范围内线性关系良好。表 线性关系考察与检测限定量限结果 成分回归方程线性范围（）检出限（）定量限（）白芥子苷 芥子碱硫氰酸盐 精密度试验取按照“”项下方法制备的混合对照品溶液，按照“”项下色谱条件连续进样 次，计算 种成分峰面积的 值，结果显示白芥子苷、芥子碱硫氰酸盐峰面积的 分别为 和 。表明仪器精密度良好。稳定性试验取白芥子饮片（编号 ），按照“”项下方法制备供试品溶液，置于自动进样室中，按照“”项下色谱条件，分别于 ，进行进样测定，计算种成分峰面积的 值，结果显示，白芥子苷、芥子碱硫氰酸盐峰面积的 值分别为 和 。表明供试品溶液在自动进样室放置 内的稳定性良好。重复性试验取白芥子饮片（编号 ），按照“”项下方法平行制备 份供试品溶液，按照“”项下色谱条件进行进样测定，计算含量并记录峰面积。结果显示白芥子苷、芥子碱硫氰酸盐的平均含量分别为 和 ；峰面积的 值分别为 和 ，表明该方法重复性良好。加样回收率试验取已知含量的白芥子饮片份，每份约 ，按照 的比例加入对照品，再按照“”项下方法制备供试品溶液，进行测定并计算回收率。结果显示，白芥子苷以及芥子碱硫氰酸盐的平均加样回收率分别为 和 ，值分别为 和 （见表），表明所建立的方法可行。表 加样回收实验结果（）（）成分取样量（）已知量（）加入量（）测得量（）回收率（）平均回收率（）（）白芥子苷 芥子碱硫氰酸盐 样品含量测定取“”项下不同厂家的生、炒白芥子饮片，按照“”项下方法制备供试品溶液，每批平行制备 份，再按照“”项下色谱条件进样分析，并计算平均含量，具体结果见表 。山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期表 批样品中白芥子苷及芥子碱硫氰酸盐的含量测定结果（，）（，）编号白芥子苷（）芥子碱硫氰酸盐（）编号白芥子苷（）芥子碱硫氰酸盐（）提取方法的选择和优化根据实验内容设计考察提取方式、提取时间、提取次数对实验结果的影响，对此 种因素进行单因素考察。提取方式单因素考察取同一样品（）两份白芥子细粉 ，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加甲醇 ，一份超声处理 ，另一份回流提取 ，滤过，滤渣再用甲醇同法提取 次，滤液合并。将滤液置于水浴锅上蒸干，残渣加流动相溶解，转移至 量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得，结果见表，均 。表 不同提取方式对样品含量的影响（）（）提取方式白芥子苷芥子碱硫氰酸盐含量（）（）含量（）（）超声提取 回流提取 由表 可见超声提取方式要优于回流提取，因此选择超声提取进行接下来的实验。提取时间单因素考察取同一样品（）份白芥子细粉 ，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加甲醇 ，分别超声 ，滤过，滤渣再用甲醇同法提取 次，滤液合并。将滤液置于水浴锅上蒸干，残渣加流动相溶解，转移至 量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得，结果见图 。图 不同超声时间对样品中白芥子苷及芥子碱硫氰酸盐含量的影响（，）（，）由图 结果可知，随着超声时间的增加，种成分的提取率增高，在超声 时达到最大，但是在超声时间达到 后，种成分的含量会随着超声时间的增加而呈现下降趋势，因此选择 作为最终提取时间。提取次数单因素考察取 份白芥子细粉 ，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加甲醇 ，超声 ，滤过，滤渣再用甲醇超声提取，用此方法分别对白芥子进行提取 ，次，滤液合并。将滤液置于水浴锅上蒸干，残渣加流动相溶解，转移至 量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得，结果见图 。图 不同超声次数对样品中白芥子苷及芥子碱硫氰酸盐含量的影响（，）（，）由图 结果可知 种成分的含量会随着超声次数的增加而增加，在超声 次时达到最大，但当提取次数达到 次之后，两种成分的含量变化不明显，从优化实验步骤角度考虑，故选择超声 次作为最终提取次数。经过单因素考察分析，最终确定供试品制备方法为超声提取 次，每次 。不同检测波长色谱图对比经查阅文献，白芥子苷的检测波长为 ，芥子碱硫氰酸盐的检测波长为 。将样品（）于双波长条件下进行分析，分别对 和 波长的色谱图进行对比分析考察，以选取合适的波长进行实验。双波长考察分析结果显示，在 下白芥子苷无峰显示，在 下芥子碱硫氰酸盐峰型极小（见图 ），因此选择以变换波长进行实验，具体条件为：前使用 ，后使用 作为检测波长。白芥子苷；芥子碱硫氰酸盐图 白芥子饮片（）双波长色谱图 （）不同方法的对比取白芥子饮片（编号 ），按照“”项下方法制备供试品溶液，分别按照“”项下色谱条件及 版 中国药典 中芥子含量测定方法进行进样测定，记录色谱图，结果见图 。本试验方法与 版 中国药典 中对芥子的含量检测方法对比，不仅能够同时检测白芥子苷这一指标，且利用本方法检测出来的色谱图相较于 版 中国药典 方法检测出来的色谱图峰形完整，不拖尾，保留时间相对提前。山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期 白芥子苷；芥子碱硫氰酸盐图 不同方法测同一样品对比色谱图 讨论实验初期尝试用乙腈 磷酸溶液做流动相，结果不理想，后又尝试使用氨基柱，也未能很好测出 种成分的含量，通过查阅文献，发现莱菔子中有萝卜苷和芥子碱硫氰酸盐，而萝卜苷与白芥子苷同属硫苷，因此尝试按照高世杰等 测定莱菔子中萝卜苷和芥子碱硫氰酸盐的色谱条件进行本实验，通过改变流动相比例调整出峰时间。白芥子苷在乙腈 磷酸二氢钾为 ，波长 时峰型合适，芥子碱硫氰酸盐在乙腈 磷酸二氢钾为 ，波长 时峰型合适。因此选用的色谱条件为“”项下的色谱条件。本实验以白芥子苷和芥子碱硫氰酸盐这 个成分为指标，运用 波长转换法建立了白芥子中种活性成分的含量测定方法，结果显示，不同地区的白芥子苷的含量差异显著，芥子碱硫氰酸盐的含量差异则较小且均符合 年版 中国药典 对白芥子的质量评价标准，其中河北、江苏、河南南召产的白芥子所含白芥子苷量较高。有文献称，白芥子中白芥子苷被酶解产生具有刺激性的芥子油 ，芥子油具有“引赤发泡”的作用，能够透过皮肤、深入人体 ，起到透皮吸收的作用。三伏贴发泡反应有所差别不仅因为人体皮肤敏感性的不同，也有可能是因为各地区白芥子苷的含量差异较大所导致的，因此可以利用本方法对白芥子苷及白芥子指标成分芥子碱硫氰酸盐进行测定，以此来斟酌白芥子在外用制剂三伏贴中的用量。本文通过试验探索所建立的方法简单快速、定量准确，可为白芥子的质量评价以及相关制剂产品的质量控制提供参考。参考文献：国家药典委员会 中华人民共和国药典：一部 年版 北京：中国医药科技出版社，：陈燕清，李雪，肖凯文，等 三伏贴主要药物白芥子考 中国民间疗法，（）：范雅琼 小青龙汤联合寒哮贴贴穴治疗小儿寒性哮喘的临床疗效研究 济南：山东中医药大学，：朱永政 基于数据挖掘技术的穴位贴敷治疗呼吸系统优势病症选穴用药规律和哮喘网络药理学研究 济南：山东中医药大学，：李文婷 三伏贴与三九贴结合干预阳虚体质的临床研究 晋中：山西中医药大学，：冯宝民，余正江，段礼新，等 炒白芥子中化学成分的研究 中草药，（）：刘菊燕，巢建国，谷巍，等 泻肺平喘灵的血清药物化学成分 中国实验方剂学杂志，（）：张青山，王卓，孔铭，等 芥子中芥子碱类和硫代葡萄糖苷类成分化学稳定性和质量评价研究进展 中草药，（）：张廷模 临床中药学 上海：上海科学技术出版社，：陈润林，冉涛声，王天怀，等 试论三伏贴配方中白芥子的最佳炮制方法与剂量的研究 当代医药论丛，（）：徐敏，叶凡，赖先荣，等 法测定白芥子饮片中白芥子苷的含量 中国药房，（）：高世杰，乔利，田振华，等 莱菔子水煎液中芥子碱硫氰酸盐与萝卜硫苷含量测定 山东中医药大学学报，（）：阮世发，乡世健，安佰超，等 白芥子挥发油促进冬病夏治方经皮渗透研究 中药新药与临床药理，（）：高远，李冀，韩东卫 从白芥子古今外治研究探寻中药“内病外治”机理的新思路 中成药，（）：，