不同浓度谷胱甘肽对储存红细胞内氧化应激反应的影响.pdf

实验研究不同浓度谷胱甘肽对储存红细胞内氧化应激反应的影响李莲莲 成问 苟大明 ：基金项目：国家自然科学基金（）作者单位：遵义医科大学附属医院麻醉科李莲莲（现在重庆市巴南区人民医院麻醉科）；遵义医科大学第二附属医院麻醉科（成问）；贵州茅台医院麻醉科（苟大明）通信作者：苟大明，：【摘要】目的 探讨不同浓度谷胱甘肽（）对储存红细胞（）内氧化应激反应的影响。方法 选择 份新鲜制备的 各取 ，平均分为四组：枸橼酸葡萄糖（）组、组、组和 组，每组 。组中加入 保存液 ，再加入生理盐水 ，、和 三组均加入 保存液 ，再分别加入 、的 溶液 。四组均置于 冰箱密封保存。在保存的第、天，分别采用酶联免疫吸附试验（）测定 内 含量和 酶活性，采用黄嘌呤氧化酶法测定 内超氧化物歧化酶（）活性，采用硫代巴比妥酸比色法测定 内丙二醛（）含量。结果 与 组比较，第、天 组和 组的 含量和 酶活性明显升高（）；与 组比较，组和 组 含量和 酶活性明显升高（）。与 组比较，第、天 组 酶活性明显升高（），第、天 组 酶活性明显升高（）；与 组比较，第 天 组和 组 酶活性明显升高（）。与 组比较，第、天 和 组 含量明显降低（）；与 组比较，第、天 组和 组 含量明显降低（）。结论 内加入 、的谷胱甘肽具有一定的抗氧化应激作用，可降低 的储存性损伤。【关键词】储存红细胞；谷胱甘肽；三磷酸腺苷；超氧化物歧化酶；丙二醛；氧化应激 ，：，：【】（）（），：，（），（），（），（），（），（），（），临床麻醉学杂志 年 月第 卷第 期 ，（），【】；储存红细胞（，）在储存过程中，会随着储存时间延长发生逐渐加重的储存损伤。储存损伤的变化不仅体现在代谢水平的改变，最重要的是氧化还原稳态的失衡以及细胞骨架的改变。在减轻储存损伤的研究中，本研究团队已经对增加能量供给等方面进行了较为深入的研究。谷胱甘肽（，）减少可能是导致 储存损伤的重要机制之一。可能减轻 的氧化应激反应，降低 损伤。本实验研究在 中加入不同浓度的，观察储存不同时间后 相关指标的变化，探讨 在 储存过程中的抗氧化应激作用。材料与方法实验细胞本实验研究经医院伦理委员会批准（）。由输血科提供从制备到临床应用的新鲜去白红细胞 份（每份 ），每份抽取 ，余下继续保存备用。实验分组及处理在无菌操作台内将 平均分为四组：枸橼酸葡萄糖（，）组、组、组和 组，每组 。本实验参照文献方法分别配置 溶液浓度梯度 、。组加入 保存液 ，再加入生理盐水 ，组、组和 组 均加入 保存液 ，再分别加入浓度为 、和 的 溶液 ，轻轻混匀，使药物均匀分布。四组 均置于 冰箱密封保存。法分别在保存的第、天取 置于无菌离心管中，轻微摇晃振荡混匀，下 离心 ，取上清，按照试剂盒说明书（批号：）操作，检测 内三磷酸腺苷（，）含量。分别在保存的第、天取 ，加入 蒸馏水稀释成 的溶血液，轻微摇晃振荡混匀，放置 直至溶血液对光呈完全透明状，严格按照试剂盒说明书（批号：）操作，检测 内谷胱甘肽过氧化物酶（，）活性。所有样本只经过 次解冻，每个样本重复测量 次，取平均值。黄嘌呤氧化酶法 分别在保存的第、天取 ，加入生理盐水 ，离心 ，用微量移液器吸去上清液留沉淀的。取离心后沉淀的 加入所取 体积 倍的蒸馏水（），在涡旋混匀器上混匀 将细胞充分裂解。在 裂解产物中加入无水乙醇 置涡旋混匀器上充分混匀 ，再加入三氯甲烷 置涡旋混匀器上混匀 ，离心 ，此时液体分为 层，上层为超氧化物歧化酶（，）抽提液用于检测。检测过程按试剂盒（批号：）操作说明进行。每个样本重复测量 次，取平均值。硫代巴比妥酸比色法分别在保存的第、天取 ，加入生理盐水 ，离心 ，用微量移液器吸去上清液留沉淀的。取离心后沉淀的 加入所取 体积 倍的蒸馏水（），在涡旋混匀器上混匀 将细胞充分裂解。在 裂解产物中加入无水乙醇 置涡旋混匀器上充分混匀，再加入三氯甲烷 置涡旋混匀器上混匀，离心 ，此时液体分为 层，上层为丙二醛（，）抽提液用于检测。检测过程按试剂盒（批号：）操作说明进行。每个样本重复测量 次，取平均值。统计分析采用 软件进行统计分析，采用 软件绘图。正态分布计量资料以均数标准差（）表示，组间比较采用两因素重复测量方差分析。为差异有统计学意义。结 果 含量与 组比较，第、天 组和 组的 含量明显升高（）。与 组比较，组和 组 含量明显升高（）（表）。活性与 组比较，第、天 组和 组 活性明显升高（）。与 组比较，组 和 组 活性明显升高（）（表）。活性与 组比较，第、天临床麻醉学杂志 年 月第 卷第 期 ，组 活性明显升高（），第、天 组 活性明显升高（）。与 组比较，第 天 组和 组 活性明显升高（）（表）。表 四组 不同时点 含量的比较（，）组别份数第 天第 天第 天第 天 组 组 组 组 注：与 组比较，；与 组比较，表 四组 不同时点 活性的比较（活力单位，）组别份数第 天第 天第 天第 天 组 组 组 组 注：与 组比较，；与 组比较，表 四组 不同时点 活性的比较（，）组别份数第 天第 天第 天第 天 组 组 组 组 注：与 组比较，；与 组比较，含量与 组比较，第、天 组和 组 含量明显降低（）。与 组比较，第、天 组和 组 含量明显降低（）（表）。讨 论 是临床使用最多的血液制品，的质量与多种输注并发症密切相关。保存液质量一直在改进和提升，目前临床上常用的 保存液 的作用主要是维持 的结构和功能，但仍然不能避免 在储存期间发生代谢紊乱、氧化应激等反应导致 存储性损伤。氧化应激是导致红细胞储存损伤的重要原因。在健康的红细胞中，抗氧化系统可以在一定程度上减轻细胞的氧化损伤，该系统由抗氧化化合物如、维生素、维生素 和酶（、过氧化氢酶和）组成。其中，还原型 是人类细胞中存在的最丰富的天然抗氧化剂。是一种三肽（谷氨酰半胱氨酸甘氨酸），在体内有还原型 和氧化型（）两种形式，在生理条件下以还原型 占绝大多数。其中还原型 既能直接与过氧化氢等氧化剂结合，生成水和氧化型，也能够将高铁血红蛋白还原为血红蛋白，维持红细胞膜的稳定，含量越高的红细胞，在储存期间受到氧化应激的损伤越小。因此在 保存液 中加入 可能有助于减轻 的存储损伤。本实验中 液的浓度及体积严格按照血库保存 的标准执行，溶液的配制参照文献方法分别配置浓度梯度 、的 溶液。临床麻醉学杂志 年 月第 卷第 期 ，表 四组 不同时点 含量的比较（，）组别份数第 天第 天第 天第 天 组 组 组 组 注：与 组比较，；与 组比较，典型的 储存损伤是细胞内 水平下降、减少、增加。是细胞内能量的供应者，其含量下降将严重影响红细胞的正常活性和功能，通过对 添加不同浓度的，结果显示，在同一时刻，加入浓度 为 、的 比加入浓度为 的 的 含量更高，提示在 保存液中加入、的 可以延缓 下降的趋势，增加 的抗氧化能力，减轻细胞的氧化应激反应，降低红细胞的储存损伤。是体内重要的抗氧化剂之一，能够阻断活性氧自由基对机体的进一步损伤，以硒代半胱氨酸的形式发挥作用，以 为还原剂分解体内的脂质过氧化物，防止细胞膜和其他生物组织免受过氧化损伤。本实验研究结果显示，在同一时刻，加入浓度为 、的 比加入浓度为 的 中、活性更高。在 保存液中加入浓度为 、的，、等指标均有明显的改善作用，提示在 保存液中加入一定浓度的 可以减轻细胞膜的过氧化损伤，进一步证实了 在红细胞保存期间发挥了抗氧化作用。在人体内，自由基作用于脂质发生过氧化反应，氧化终产物为，通过对 添加不同浓度的，结果显示，在同一时刻，加入浓度为 、的 比加入浓度为 的 的 含量更低，提示在 保存液中加入浓度为 、的 可以延缓 上升的趋势，提高 清除自由基的能力。本实验研究结果显示，在 保存液中加入一定浓度（、）的 可降低 的存储性损伤，但本实验研究只比较了三种浓度的 对 的影响，保存 的 最优浓度还需要进一步的探讨。此外，本实验研究未观察 对 的形态和功能的影响，这些都需要进一步研究。综上所述，由 保存液保存的 在储存期间，随着时间逐渐延长，内 含量、和 酶活性逐渐下降，水平逐渐上升。在 保存液中添加适宜浓度的抗氧化物能够提高红细胞保存质量，降低 的存储性损伤。参考文献 ，：，（）：，（）：，：（），（）：，（），：，（）：杨琨，王红，桑培培，等 维生素 和氮乙酰半胱氨酸抑制悬浮红细胞氧化应激损伤量效关系的初步比较 中国输血杂志，（）：，：，：，（）：，临床麻醉学杂志 年 月第 卷第 期 ，（）：，：，（）：，（）：，（）：，：，：，：（），（）：（收稿日期：）读者作者编者临床麻醉学杂志可直接使用缩略语的词汇美国麻醉医师学会（）聚合酶链反应（）美国纽约心脏病协会（）酶联免疫吸附试验（）甲基天冬氨酸（）吸入氧浓度（）氨基丁酸（）血浆靶浓度（）白细胞介素（）效应室靶浓度（）肿瘤坏死因子（）心率（）血红蛋白（）血压（）血小板（）收缩压（）红细胞压积（）舒张压（）红细胞计数（）心率与收缩压乘积（）白细胞计数（）平均动脉压（）体重指数（）中心静脉压（）心肺转流（）脉搏血氧饱和度（）靶控输注（）潮气量（）患者自控静脉镇痛（）呼吸频率（）患者自控硬膜外镇痛（）呼气末二氧化碳分压（）患者自控镇痛（）动脉血二氧化碳分压（）呼气末正压（）动脉血氧分压（）间歇正压通气（）静脉血氧分压（）最低肺泡有效浓度（）静脉血二氧化碳分压（）脑电双频指数（）视觉模拟评分法（）听觉诱发电位指数（）重症监护病房（）麻醉后恢复室（）四个成串刺激（）天门冬氨酸氨基转移酶（）心电图（）丙氨酸氨基转移酶（）警觉 镇静状态评定（）核因子（）磁共振成像（）羟乙基淀粉（）计算机断层扫描（）伊红染色（）术后认知功能障碍（）急性呼吸窘迫综合征（）临床麻醉学杂志 年 月第 卷第 期 ，