阿维菌素废菌渣循环利用的发酵工艺研究.pdf

世 界 农 药Vol.45 No.9World PesticideSep.2023作者简介：刘丽虹(1982)，女，河北赵县人，工程师，研究方向：植物保护。E-mail：。通信作者：程曦(1965)，男，河南博爱县人，高级工程师，研究方向：微生物发酵生产及研发。E-mail：。收稿日期：2023-07-17。30阿维菌素废菌渣循环利用的发酵工艺研究阿维菌素废菌渣循环利用的发酵工艺研究刘丽虹1，程 曦2，杨 柳2，张伟龙2，夏 冰1，寇 娜2(1.石家庄市农业技术推广中心，石家庄 050000;2.河北兴柏农业科技股份有限公司 河北省阿维菌素生物技术重点实验室，石家庄 051530)摘要：为开发废菌渣利用技术，提高阿维菌素发酵效价。摇床试验添加 4、6、8、10、12 g/L 废菌渣对效价的影响；50 L 发酵罐研究添加 8 g/L 废菌渣对起步效价、放罐效价的影响。摇瓶试验结果显示，培养基添加 8 g/L 废菌渣发酵效价最高；50 L 发酵罐试验组平均起步效价(平均值标准差)(47981)g/mL，较对照组增加 24.0%，有显著提高(P单尾=0.007)；试验组平均放罐效价(8 042716)g/mL，较对照组增加 9.0%，有显著提高(P单尾=0.011)。阿维菌素发酵培养基中添加 8 g/L 废菌渣，能够提高发酵效价，该研究对其他菌体生长与产物合成非偶联型次级代谢发酵废菌渣的再利用有借鉴价值。关键词：阿维菌素；废菌渣；循环利用；发酵工艺中图分类号：TQ920.6；TQ453文献标志码：A文章编号：1009-6485(2023)09-0030-06DOI：10.16201/10-1660/tq.2023.09.05Study on fermentation process for recycling of avermectin wastemushroom residueLIU Lihong1,CHENG Xi2,YANG Liu2,ZHANG Weilong2,XIABing1,KOU Na2(1.ShijiazhuangAgricultural Technology Promotion Center,Shijiazhuang 050000,China;2.KeyLaboratory ofAvermectin Biotechnology of Hebei Province,Hebei XingbaiAgricultural TechnologyCo.,Ltd.,Shijiazhuang 051530,China)Abstract:In this paper,we aim to develop the utilization technology of waste mushroom residue and improve thefermentation potency of avermectin,determine the effect of adding 4,6,8,10 and 12 g/L waste mushroom residue on thepotency in table test,study the effect of adding 8 g/L waste mushroom residue on the starting potency and release potencyof 50 L fermentation tank.The results of the shake flask test showed that the highest fermentation potency was achieved byadding 8 g/L waste mushroom residue to the medium.The average starting potency(meanstandard deviation)of the 50 Lfermentation tank test group was(47981)g/mL,which was a 24%increase over the control group.This increase wasstatistically significant(P one-tailed=0.007).The mean release potency of the test group was(8 042716)g/mL,asignificant increase of 9%compared to the control group(P one-tailed=0.011).The addition of 8 g/L waste mushroom技术创新第 9 期刘丽虹等：阿维菌素废菌渣循环利用的发酵工艺研究31residue to the avermectin fermentation medium is able to improve the fermentation potency.This study is valuable for thegrowth of other thalluses and the recycling technology of non-coupled secondary metabolic fermentation waste mushroomresidue synthesized by bacterial products.Keyword:avermectin;waste mushroom residue;recycling;fermentation process阿维菌素是阿维链霉菌深层发酵而得的高效低毒生物农药和医药中间体，在农业、畜牧业和医药领域都有广泛的应用1。21 世纪，随着基因编辑、合成生物学等现代前沿生物技术在微生物育种上的应用，构建出主产阿维菌素 B1a 工程菌的产业化，阿维菌素放罐效价达 78 g/L2-3，同时大量发酵效价增长的统计数据显示，发酵培养的前 4 d，日平均效价增长量仅为其后的 1/2。这是由于阿维链霉菌菌体生长与产物合成非偶联，其发酵培养经过生长繁殖期、稳定期和产素期，由于稳定期的存在，阿维菌素生物合成所需的各种前体物质和酶的积累有个过程，对前期效价增长有一定程度的影响。为此，业界开展了前体物质对效价影响的研究，来缩短稳定期，提高发酵效价。陈海燕等4研究了在发酵培养过程中滴加丙酸钠、乙酸钠对效价的影响。王文亮等5研究了在培养基中添加缬氨酸、亮氨酸作为前体物质对效价增长的影响。程曦等6研究了在发酵前期补入产素期发酵液，诱导处于生长繁殖期的阿维链霉菌生物合成阿维菌素。阿维菌素生物合成本质是阿维链霉菌进行复杂的生物化学反应过程，其生化反应总速度由相对较慢的步骤决定，添加一种或几种前体物质难以保证生化反应速度的整体提高，尝试开展在阿维菌素发酵培养基中添加阿维菌素废菌渣作为前体混合物的工艺研究，在回收利用废菌渣的同时，提高阿维菌素发酵效价。阿维菌素废菌渣是阿维菌素发酵液经过滤、烘干、萃取、干燥后的固体物质(以下通称菌渣)，主要成分为阿维链霉菌菌丝体、助滤剂及其初级代谢产物，阿维菌素 B1a 含量仅为 0.1%0.2%。生态环境部出台的国家危险废物名录(2021 年版)规定，将抗生素菌渣按照危险废物处置和管理，限制其作为肥料和饲料的应用。当前主要的处置方式为焚烧7，既增加碳排放、浪费能源和资源,又有悖于绿色低碳发展的理念。而生态环境部出台的制药工业污染防治技术政策鼓励企业研究、开发、推广发酵菌渣在生产工艺中的再利用技术。笔者就此在摇瓶及50 L 发酵罐上研究了培养基中添加菌渣对发酵效价及培养过程的影响，为循环利用菌渣和进一步提高发酵效价提供思路、方法和相关数据支持。1 1 材料与方法材料与方法1.11.1 材料材料1.1.1 菌种阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)AVX-33由河北兴柏农业科技股份有限公司菌种室提供。1.1.2 设备20 L 种子罐、50 L 发酵罐，配套有补料、DO和 pH 等自动控制系统和具有数据采集及分析功能的软件系统(镇江东方生物工程设备技术公司)；NDJ-1 型旋转式黏度计(上海越平科学仪器有限公司)；TS-211B 卧式恒温摇床(无锡玛瑞特科技有限公司)；Agilent 1260 高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)。1.1.3 菌渣来源于本公司提取车间(F622-20221127)，黑褐色粉末或颗粒状，过 40 目筛筛选。主要成分为粗蛋世 界 农 药第 45 卷32白、粗纤维和无氮浸出物(表 1)及 17 种氨基酸，其中谷氨酸 1.61%、亮氨酸 1.32%、甘氨酸 1.22%、丙氨酸 1.06%、脯氨酸 1.03%、天门冬氨酸 0.94%、缬氨酸 0.90%等，含量最低的蛋氨酸 0.050%。表 1菌渣主要成分及含量(%)粗蛋白粗纤维粗脂肪粗灰分总磷钙无氮浸出物10.9915.200.6024.900.470.5851.32注：资料来源于北方未来检验检测(山东)有限公司。1.21.2 培养基及培养条件培养基及培养条件1.2.1 摇瓶种子培养基质量浓度分别为玉米淀粉 25 g/L，热轧黄豆饼粉8g/L，花生饼粉10g/L，酵母膏4g/L，酵母粉5g/L，氯化钴 10 mg/L，消前 pH 8.08.5。培养条件：摇床转速 220 r/min，温度 2829，培养时间 23 d。1.2.2 摇瓶发酵培养基质量浓度分别为淀粉140g/L，热轧黄豆饼粉21g/L，酵母粉 8 g/L，菌渣 8 g/L，轻质碳酸钙 1.6 g/L，淀粉酶质量分数 0.025%；消前 pH 7.58.0，摇瓶装量50 mL/250mL，接种量 5 mL。培养条件：温度2728，转速220 r/min，培养时间 1012 d。1.2.3 种子罐(20 L)原材料质量浓度分别为淀粉 22 g/L，热轧黄豆饼粉 6 g/L，酵母粉 3g/L，花生粉 6 g/L，酵母膏 3 g/L，氯化钴 10 mg/L；计料体积 12 L，消前 pH 9.09.5、消后 pH 7.37.8。培养条件：温度2829，空气流量1025L/min，搅拌转速 200600 r/min，培养时间 23 d。1.2.4 发酵罐(50 L)按接后体积计算投料量，原材料质量浓度分别为淀粉 140 g/L，热轧黄豆饼粉 21 g/L，酵母粉 8 g/L，菌渣 8 g/L，轻质碳酸钙 1.6 g/L，淀粉酶质量分数0.025%；消后体积 3335 L，接种量 8%10%。培养条件：温度 2728，搅拌转速 600 r/min，空气流量 3045 L/min，培养时间 1012 d。1.31.3 测定方法测定方法1.3.1 黏度测定取发酵液适量，选 2#转子，将黏度计的转子没于发酵液中，并使液面淹没于转子的凹槽刻度处，开启黏度计，旋转稳定后读取黏度值。1.3.2 生物量测定准确量取 50 mL 发酵液置于 250 mL 三角瓶中，添加适量助滤剂。于水浴锅中升温至约 95，维持35 min，抽滤得滤饼，适量热水洗，102 烘干至恒重，降温称量(W2)，计算生物量。生物量(g/L)=(W2-W0-W1)20式中：20 为换算系数，W1为助滤剂质量，W0为滤布质量。1.3.3 B1a 效价测定精确称取 2 mL 发酵液，加入 50 mL 容量瓶中，再添加适量甲醇至规定位置，超声浸取 1020 min，甲醇定容、过滤待用。HPLC 系统：色谱柱 C18、4.6 mm250 mm，柱温 30，流动相甲醇水=91(体积比)，流量1.0 mL/min、测量用波长 246 nm，进样量 20 L，记录测量的峰面积，外标法计算 B1a 效价。B1a 效价(g/mL)=标准品浓度样品峰面积稀释倍数/标准品峰面积2 2 结果与分析结果与分析2.12.1 不同不同质量质量浓度菌渣对效价的影响浓度菌渣对效价的影响为考察菌渣对发酵效价的影响情况，对其设计了 5 个质量浓度：4、6、8、10、12 g/L。其中，每个质量浓度接 3 支三角瓶进行摇瓶试验，图 1 数据(平均值标准差)显示，随着菌渣质量浓度的增第 9 期刘丽虹等：阿维菌素废菌渣循环利用的发酵工艺研究33加，放瓶效价逐渐提高，当菌渣质量浓度达 8 g/L时，放瓶效价最高，达到 8 053 g/mL，这是由于培养基中添加菌渣后，等效于发酵液中提前积累了阿维链霉菌的初级代谢产物，缩短了稳定期，相对延长了产素期，提高放瓶效价。而后又逐步下降，当菌渣质量浓度增至 12 g/L，放瓶效价下降至 7 432 g/mL，是由于菌渣中存在的某些限制性物质过量，抑制了阿维菌素的生物合成。故以菌渣质量浓度 8 g/L，在50 L 发酵罐研究其对发酵效价、生物量和黏度等指标的影响情况。70007200740076007800800082008400345678910111213效价/(g/mL)菌渣质量浓度/(g/L)效价图 1菌渣质量浓度对效价的影响2.22.2 菌渣对发酵效价的影响菌渣对发酵效价的影响将培养好的种子液按10%接种量分别转入相同培养条件的试验组和对照组。图 2 为 11 批次起步效价对比数据，培养基添加菌渣罐批平均起步效价(平均值标准差)(47981)g/mL，较对照组(38582)g/mL 高94 g/mL，增加 24.0%，有显著提高(P单尾=0.007)。抗生素作为次级代谢产物，是由于初级代谢产物的过量积累和外界环境胁迫所产生的有利于其生产的代谢活动8，在阿维菌素发酵培养基中加入适量菌渣相当于提前积累了阿维链霉菌的初级代谢产物和添加合成阿维菌素所需的前体物质，有利于初级代谢向次级代谢的转化，缩短稳定期，提高发酵起步效价。图 3 为11 批次放罐效价对比数据，试验组平均放罐效价(平均值标准差)(8 042716)g/mL，较对照组(7 366563)g/mL 高 676 g/mL，增加 9.0%，有显著提高(P单尾=0.011)。这是由于试验组添加菌渣后，有利于初级代谢向次级代谢的转化，缩短了稳定期，相对延长了产素期，即增加了阿维链霉菌生物合成阿维菌素的时间，提高了放罐效价；试验组标准差 716 g/mL，较对照组 563 g/mL 高 153 g/mL，无显著差异(P=0.46)。1002003004005006007001234567891011效价/(g/mL)试验数/批试验组对照组图 2菌渣对起步效价的影响50006000700080009000100001234567891011效价/(g/mL)试验数/批试验组对照组图 3菌渣对放罐效价的影响2.32.3 菌渣对生物量、黏度的影响菌渣对生物量、黏度的影响生物量表示单位体积发酵液中菌丝体的数量，与其他理化指标一样对发酵效价有重要影响，其浓度大小与培养基特别是其中氮源含量密切相关9。将培养好的种子液依次接入试验罐和对照罐，29 h世 界 农 药第 45 卷34开始取样检测试验罐和对照罐的生物量(图 4)。结果表明：29 h 生物量分别快速达到 36.3、28.8 g/L，这期间主要表现为阿维链霉菌的生长繁殖期，随后生物量的增加相对较慢，增加机理主要表现为发酵液的蒸发作用，至 281 h 放罐生物量分别为 52.8、42.3 g/L，且全程表现为试验罐生物量高于对照罐，原因在于试验罐培养基加入了 8 g/L 的菌渣。但在发酵培养的后期增加的更多，是由于随着发酵的进行，阿维链霉菌自身产生了某些蛋白酶，酶解并利用菌渣中的粗蛋白引起一定程度的二次生长繁殖，但此时的阿维链霉菌已经具有次级代谢能力，表现出菌体生长繁殖与产物合成同时进行的混合型发酵特征，所以并未对效价增长造成影响。此现象有别于传统的阿维链霉菌菌体生长与产物合成非偶联特征。20253035404550552060100140180220260300生物量/(g/L)培养时间/h试验对照图 4菌渣对生物量的影响黏度作为发酵控制的重要指标，对发酵液中氧的传递有重大影响。其高低除了与生物量有关外，还与菌丝形态、代谢过程密切相关。图 5 表明：发酵培养 29、41 h 试验罐生物量明显高于对照罐，但黏度(69.6、74.2mPas)与对照罐(71.4、73.8mPas)相当，这是由于试验罐生物量高，与加入了质量浓度 8 g/L菌渣有关。但随着发酵培养的深度进行，发酵后期试验罐(88.4 mPas)黏度明显高于对照罐(81.7 mPas)，这是由于发酵后期，试验罐菌渣中粗蛋白的酶解导致菌体二次生长繁殖，菌体细胞原生质饱满，菌丝刚性增加所致10，且以后的多次试验，重复了这一现象。606570758085902060100140180220260300黏度/(mPas)培养时间/h试验对照图 5菌渣对黏度的影响3 3 结结论论长期以来，抗生素菌渣的处置技术限于政策困境，一方面严格限制其作为肥料、饲料的使用，而采取焚烧的处置方式，又有悖于低碳经济和科学发展观，使菌渣的处置进入两难境地。开展菌渣无害化处理或循环利用菌渣的研究成为必然，以消除或减轻菌渣对环境污染的影响。张广志等11在菌渣中分离出嗜热脂肪芽孢杆菌，并进行堆料发酵，以降解其中的阿维菌素，减轻菌渣中残留阿维菌素对环境影响。刘小鹏等12研究了阿维菌素菌渣经微生物发酵改性后替代其他氮源在阿维菌素发酵培养中的应用技术，以降低阿维菌素生产费用。由于阿维菌素是阿维链霉菌生长繁殖到一定阶段开始生物合成，本研究基于菌渣混合物的初级代谢产物特性，加入培养基后，等效于提前积累初级代谢产物和合成阿维菌素所需的基质、前体和诱导物，有利于加第 9 期刘丽虹等：阿维菌素废菌渣循环利用的发酵工艺研究35快初级代谢向次级代谢的转化进程，提高起步效价；缩短稳定期，即相对延长产素期，提高放罐效价。研究结果表明：在培养基中添加 8 g/L 菌渣，能够加快阿维链霉菌由初级代谢向次级代谢的转化进程，缩短阿维菌素发酵培养的稳定期，提高发酵效价。其中，阿维菌素发酵起步效价增加 24.0%、放罐效价增加 9.0%，为进一步工业化应用提供数据和理论支撑。同时，该研究对其他菌体生长繁殖与产物合成非偶联型次级代谢发酵菌渣的再利用有借鉴价值。参考文献1缑仲轩,和凤,李紫萱,等.阿维菌素研究进展与产业综述J.中国抗生素杂志,2022,47(11):1139-1148.2刘进峰,程曦,刘丽虹,等.基于高密度培养的阿维菌素发酵工艺优化J.世界农药,2022,44(12):32-36,45.3程曦,高亚琪,刘进峰,等.优化半连续发酵工艺在阿维菌素工业化生产中的应用J.化学与生物工程,2022,39(10):60-64.4陈海燕,郭鸿雁.添加前体物质对阿维菌素发酵效价提高的试验研究J.价值工程,2013,32(27):292-293.5王文亮,郭佳.氨基酸对阿维菌素生物合成的影响J.化工管理,2021(30):97-98.6程曦,刘丽虹,刘进峰,等.一种基于诱导效应的阿维菌素发酵方法:CN114934085AP.2022-08-23.7赵卫凤,鲍晓磊,张媛,等.河北省发酵类抗生素菌渣处置现状及存在的问题J.安徽农业科学,2013,41(31):12417-12421.8蒋新龙,李加友,陈宜涛,等.发酵工程M.杭州:浙江大学出版社,2011:23.9程曦,刘进峰,刘丽虹,等.玉米浆在阿维菌素发酵配方经济性优化中的应用J.发酵科技通讯,2020,49(2):85-89.10张嗣良,储炬.多尺度微生物过程优化M.北京:化学工业出版社,2003:91.11张广志,李纪顺,杨合同,等.阿维菌素发酵废弃物无害化处理的研究J.山东科学,2012,25(5):104-108.12刘小朋,凌爽,刘忠艳,等.阿维菌渣的生物改性方法及再利用研究J.安徽农业科学,2010,38(30):16924-16925.行业资讯爱尔兰已经实现 2030 年农药削减目标来自欧盟卫生和食品安全部的 Andrew Owen-Griffiths 在最近举行的某作物论坛上宣称，爱尔兰是已经实现了欧盟从农场到餐桌战略设定的到 2030 年农药用量减半的目标的 3 个成员国之一。Owen-Griffiths 指出，从农场到餐桌农药削减目标不仅限于农业，还包括林业以及公路和铁路维护部门；它的目标是将化学农药的总用量和风险减少 50%，并将高危险农药的用量减少 50%。爱尔兰几乎已经达到了整个欧盟为 2030 年设定的目标，从现在到 2030 年，化学农药的用量只需要削减 17%。在 4 年（20172021 年）的时间里，已完成了 33%的削减。针对欧盟削减高危险物质的目标，这些产品的削减已经开始了，但需要采取进一步的措施来激励。如果有其他危害较小的物质可供选择，则应完成比较评估，如果有，则不应批准高危险物质，随后应将其从市场上移除。有助于欧盟层面削减的因素包括不更新高风险物质，精准农业等技术进步，非化学替代品，有机农业的增加，新的抗性品种，以及改良的病虫害综合管理。