多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1调控β-1,4-甘露糖基转移酶介导甲状腺癌细胞增殖机制.pdf

对甲状腺癌（TC）细胞增殖/调亡的影响及其潜在机制。方法采用慢病毒表达载体（p LV）构建pLV-EGFP空载与pLV-ALG过表达8 30 5C细胞系，采用蛋白质免疫印迹法（Westernblot）检测细胞蛋白水平表达，使用Kaplan-Meier数据库分析TC患者总生存期（OS）；采用细胞计数试剂盒（CCK）-8 和集落形成实验检测细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞调亡情况。从TCGA数据库中筛选出TC患者中与PARP1表达呈显著相关的前10 0 0 个差异基因，富集相关信号通路，比较这些通路的差异表达状况,并在过表达细胞系中进行相应验证。结果PARP1在TC 细胞系中表达显著增加,且与患者OS呈负相关（P0.05）。PA RP1抑制剂（NMS-P118）显著抑制8 30 5C细胞的增殖，促进细胞调亡（P0.05）。T CG A 数据库筛选并富集分析发现，N-糖基化修饰信号通路显著富集,NMS-P118显著抑制了-1,4-甘露糖基转移酶（ALG1）的表达水平（P0.05）。生物素标记的甘露糖结合凝集素（MBL）检测发现NMS-P118显著下调了8 30 5C细胞的甘露糖修饰水平（P0.05）。K a p l a n-M e i e r 数据库分析发现TC中ALG1高表达的患者OS具有降低倾向（P0.05）。过表达ALG1可逆转NMS-P118对8 30 5C细胞增殖的抑制，减少细胞凋亡(P0.05）。结论PARP1可通过促进糖基转移酶ALG1的表达介导TC的增殖并抑制其调亡,PARP1可能是治疗TC的重要新靶点关键词多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1；甲状腺癌；-1,4-甘露糖基转移酶；增殖；靶点中图分类号R581.9文献标识码AIechanism of poly ADP-ribose polymerase 1 promotes the IregulatingB-l.4-mannosyltransferaseLiuMei*Mechanism of poly ADP-ribose polymerase 1 promotes the proliferation of thyroid carcinoma cellsMechanism of poly ADP-ribose polymerase 1 promotes the proliferation of thyroid carcinoma cellsby regulating-1,4-mannosyltransferaseLiu Mei*,Huang Jing,Zhang Yanni,Li Shan,HuTegulatigLUuuangJing,ZangTannt,LtSnan,uShaobo,Liu Fang,Hu Yuhai,Sun Wenzao.*Department of Clinical Laboratory,Wuhan Hankou Hospital,Wuhan 430013,ChinaAbstractObjective To investigate the effect of poly ADP-ribose polymerase 1(PARP1)onproliferation/apoptosis of thyroid carcinoma(TC)cells by-1,4-mannosyltransferase(ALG1)and itspotential mechanism.Methods Lentiviral expression vector(pLV)was used to construct PLV-EGFPempty vector and PLV-ALG1 overexpression 8305C cell lines.Cell protein levels were detected by westernblotting.Overall survival(OS)of TC patients was analyzed by Kaplan-Meier database.Cell proliferationwas detected by cell counting kit 8(CCK-8)and colony formation assay,and flow cytometry was used todetect cell apoptosis.The top 1000 differentially expressed genes significantly related to PARP1 expressionin TC patients were screened from TCGA database,and the related signaling pathways were enriched toexplore the downstream signaling pathways that PARPI may regulate.Results The expression of PARP1was significantly increased in TC cell lines,and negatively correlated with OS of patients(P0.05).PARP1 inhibitors NMS-P118 significantly inhibited the proliferation of 8305C cells and promotedapoptosis(P 0.05).TCGA database screening and enrichment analysis showed that N-glycosylatedsignaling pathwaysweressignificantly enriched,NMS-P118 significantly inhibited the activation of基金项目：湖北省卫生健康委员会联合基金重点项目（WJ2018H183）；武汉市卫生健康委员会科研项目（WZ2 2 Q 0 8）；仙桃市科技局科技研究与开发计划项目（XKW202105）作者单位：430 0 13武汉市汉口医院检验科（刘梅、张燕妮、胡玉海）；长江大学附属仙桃市第一人民医院内分泌科（黄晶、李珊、胡绍波、刘芳、孙文早）通讯作者：孙文早，E-mail：s u n w e n z a o s i n a.c nJ Clin Intern Med,June 2023,Vol.40,No.6411临床内科杂志2 0 2 3年6 月第40 卷第6 期glycosylated modifying enzymes ALGl（P 0.0 5).Biotin-labeled mannose-binding lectin(MBL)assay showed that NMS-P118 significantly down-regulatedthe levels of mannose modification in 8305C cells(P0.05).Kaplan-Meier database analysis showed thatpatients with high expression of ALGI in TC had a tendency to decrease OS(P0.05).Overexpression ofALG1 could reverse the inhibition of NMS-P118 on proliferation of 8305C cells and reduce cell apoptosis(P0.05).Conclusion PARP1 can mediate the proliferation and inhibit the apoptosis of TC cells bypromoting the expression of glycosyltransferases ALG1,suggesting that PARP1 may be an important newtarget for the treatment of TC.Key wordsPoly ADP-ribose polymerase l;Thyroid cancer;-1,4-mannosyltransferase;Proliferation;Target甲状腺癌（TC)的发病率逐年上升,已成为最常见的内分泌相关恶性肿瘤1。大多数甲状腺未分化癌（A T C）患者首次就诊时即发生远处转移，经传统治疗并不能明显提高ATC患者的生存率2 。目前TC的发病机制尚未阐明3。但近年随着对TC分子生物学发病机制的深人研究,发现多种基因与TC的发病密切相关4,这些基因的多靶点多激酶抑制剂已被开发并应用于TC 的临床治疗,但部分患者疗效仍不理想5因此,进一步发掘新型介导TC发病及进展的关键分子将为其治疗提供新方向。-1,4-甘露糖基转移酶（A LG 1）主要参与蛋白质糖基化修饰的初始阶段，前期在肝癌的研究中显示高表达的ALG1具有抑制肝癌细胞迁移的作用6 。然而,ALG1在TC中的具体研究尚少。多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)1在DNA损伤修复过程中发挥关键作用7 。研究表明,PARP1（Va l 7 6 2 A l a）因缺乏多聚腺苷二磷酸（ADP)RNA酶活性而无法进行碱基切除修复，从而增加TC患病风险8 ，但PARP1对TC发生发展的具体作用机制尚不明确。前期我们的研究表明,PARP1表达活化可能在TC的发展过程中发挥重要作用9,本研究拟在此基础上,进一步探讨PARP1对TC细胞增殖、凋亡的影响，筛选出介导PARP1促进TC进展的关键糖基转移酶，从而为TC的靶向治疗提供理论依据。材料与方法1.材料：人正常甲状腺滤泡上皮细胞系（Nthy-ori3-1，上海舜冉）;TC细胞系（SW579及8 30 5C）、人胚胎肾细胞（HEK293T,中国科学院细胞库）；慢病毒表达载体（pLV）-ECFP/A LG 1（武汉擎科）；细胞培养基（RPM I16 40）、细胞培养基（DMEM）、胎牛血清（美国Gibco）；T r i z o l（美国Invitrogen）；逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒（日本Takara）；蛋白酶抑制剂、细胞计数试剂盒8（CCK-8）和二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天）；PARP1、磷酸化蛋白激酶R样内质网激酶（pERK）、磷酸化丝裂原活化蛋白激酶p38（p p 38）、磷酸化氨基未端蛋白激酶（pJNK）、磷脂酰肌醇3-激酶PI3K（p 110）、大鼠样肉瘤病毒癌基因（Kras）、A LG 1和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）多克隆抗体（武汉Proteintech）；NM S-P118（美国Sigma-Aldrich）。全自动酶标仪（英国Biochrom）；微量离心机（德国Eppendorf）；流式细胞仪（美国BD）；荧光显微镜（日本Olympus）；凝胶成像系统（美国UVP）2.方法（1）细胞培养：Nthy-0ori3-1细胞系培养采用含10%胎牛血清和1%双抗（青霉素/链霉素）的RPMI1640培养基,TC细胞系培养采用含10%胎牛血清和1%双抗（青霉素/链霉素）的DMEM培养基，传代消化采用0.25%胰蛋白酶进行，培养环境为37、5%CO2。（2)基因表达数据：下载肿瘤基因组图谱（TCGA）ThyroidCancer(THCA)数据库的数据，采用BRB-ArrayTools进行数据分析。共包含50 2 例标本,其中甲状腺乳头状癌490 例,其他病理类型12 例。使用Kaplan-Meier数据库（http：/k mp l o t.c o m）分析PARP1表达与总生存(OS)率之间的关系。采用R2：基因组学分析与可视化平台（http：/r 2.a mc.n l）对TCGATC数据集中与PARP1表达相关的前10 0 0 个差异基因进行筛选分析,并对差异基因控制的前19个生物学过程的通路富集分析。（3）蛋白质免疫印迹法（Westernblot）检测蛋白表达水平：冰上裂解细胞样本，采用BCA法测定蛋白浓度。采用SDS-PAGE法经电泳、转膜后，与相应的一抗、二抗进行孵育，加人增强型化学发光试剂（ECL)发光剂,经UVP凝胶成像仪成像显影。在检测AGL1糖基化修饰实验中,转膜后用BSA封闭,生物素标记的MBL孵育后,加人辣根过氧化物酶（HRP)标记的链霉亲和素进行显影（4)CCK-8 法检测细胞增殖情况：将对数期8 30 5C细胞以110 3个/孔的密度接种到96 孔板，相应处理后,加人10 l/孔CCK-8后，避光再孵育4h，用酶标仪检测450 nm处的吸光度值,其与活细胞数量成正比。（5)8 30 5C细胞过表达的构建：将人ALG1的cDNA克隆到pLV-ECFP过表达慢病毒载体构建pLV-ALG1J Clin Intern Med,June 2023,Vol.40,No.6412临床内科杂志2 0 2 3年6 月第40 卷第6 期过表达载体，引物序列：ALG1上游引物为5-ATAC-CGGTAGCCAAGATGGCGGCCTCATG-3，下游引物为5-GCGTCGACTTCATCTCAAAACAAAATTTA-3。阳性克隆经测序验证正确后，进行高纯度目的基因质粒抽提。将构建好的目的基因质粒和慢病毒共转染293T细胞，获得高质量浓缩慢病毒。取对数生长期的8305C细胞，按2 10 个/孔接种于6 孔板培养。对照组(pLV-ECFP组）与实验组（pLV-ALG1组）各加人4l浓缩慢病毒（滴度510 TU/ml）,经嘌呤霉素抗性筛选2 天后扩增。荧光显微镜下观察感染后细胞状态及感染率，Westernblot验证ALGl过表达效果（6)流式细胞术检测细胞调亡情况：使用AccuriC6流式细胞仪进行检测。收集分别经DMSO和NMS-P118(1M)处理2 4h的8 30 5C细胞2 10 5个，加人195lAnnexinV-FITC结合液重悬细胞，随后依次加人5lAnnexinV-FITC和10 lPI染液轻轻混匀，室温避光孵育15min，随后冰浴、上机检测。3.统计学处理：应用SPSS21.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量数据以xs表示，组间比较采用t检验。以P0.05为差异有统计学意义结果1.不同甲状腺细胞系中PARP1表达水平比较：两种TC细胞系（SW579和8 30 5C）中PARP1表达水平高于正常细胞系Nthy-ori3-1（1.430.2 8 比0.42 0.15,2.170.33比0.42 0.15,P均 0.0 5）。2.NMS-P118对TC细胞增殖调亡的比较：NMS-P118+8305C细胞2 4h、48 h 及7 2 h后细胞增殖均低于同期的DMSO+8305C细胞（0.2 50.0 4比0.350.10,0.510.13比0.7 6 0.2 5,1.0 30.2 6 比1.56 0.52,P均 0.0 5）。NMS-P118+8305C细胞2 4h后细胞调亡明显高于同期DMSO+8305C细胞（34.6 3.51 比10.40.6 2,P0.05)。3.PARP1调控TC细胞生物信息学结果分析：PARPI高表达TC患者总生存期（OS）低于PARPI低表达 TC患者(HR=3.21,95%CI 1.11 9.27,P0.05）。T CG A 数据库中筛选出与PARP1表达相关的前10 0 0 个差异基因（图1），并富集分析所调控的关键信号通路，结果显示除已被报道与PARP1功能相关的MAPK和Kras通路外，N-糖基化修饰信号通路中的基因显著富集（图2）。ALGI高表达患者OS具有降低倾向(HR=4.24,95%CI 1.2514.27,P0.05)。4.PARP1调控TC细胞机制的验证：NMS-P118显著抑制ERK、JNK 和Kras的活化水平（0.6 10.12 比0.080.03,1.240.15比0.310.0 8,3.0 7 0.2 5PARP1新10 0 0 考带4风老话PARP1TCGAdalaset(n=502)图1TCGA数据库PARP1表达显著相关的前10 0 0 个差异基因Rboscme+RNA.poymeraseCtrateCycle TCAcyce+Basatranscrpoonfactcrs-logiciowateiRbcscmebogenesis neuiayotas+20mRNAsurveilancepattwar15Spliceoscme-10Vaineleucreand iscleuciredegradatonUoquitin_mediated_pratechrsisNGiycan biosyntresisNon small cellung canceroountProtein processrginendoplasmio rebouum+2030Incstolphosonatemetatolism*40Epster_Bart_vinus_infectcn-50Sphingolpidsgraingpatwar60Oacjte me.csisPynmadnemelatolismRNA.branspartEndocptosisC.304D5图2差异基因的富集分析比0.8 6 0.18,P均0.05)。NM S-P118显著抑制ALG1表达（1.2 10.2 5比0.2 8 0.0 7），显著下调8 30 5C细胞的甘露糖修饰水平（0.57 0.2 1比0.26 0.06,P均 0.0 5)。5.不同表达水平ALG1对TC细胞增殖亡的比较：过表达ALG1可明显逆转NMS-P118+8305C细胞24h、48 h 及7 2 h的细胞增殖作用（0.410.0 2 比0.24 0.08,0.84 0.05 比0.52 0.13,1.6 0 0.18比1.0 30.2 4,P均 0.0 5）。过表达ALG1k可逆转NMS-P118促进TC细胞调亡的作用（5.46 0.48 比35.994.48,P0.05)讨论抑制调亡在TC的进展中具有关键作用，如磷脂酶C83(PLCD3）通过Hippo通路促进TC细胞的增殖、迁移和侵袭,从而抑制其凋亡,进而促进TC 进展10 1（本文编辑：高婷）（收稿时间：2 0 2 2-0 9-0 9）J Clin Intern Med,June 2023,Vol.40,No.6413临床内科杂志2 0 2 3年6 月第40 卷第6 期虽然PARP1 在多种肿瘤中具有促凋亡作用1-12 ,但研究显示PARP1对卵巢癌等肿瘤的发展具有促进作用13。为探究PARP1在TC中的作用,我们通过对正常甲状腺细胞系和两种TC细胞系进行PARP1检测,发现PARP1在两种TC细胞系中均高水平表达。同时TCGA数据库分析也显示PARP1高表达TC患者OS低于PARP1低表达的TC患者，这说明TC中PARP1高水平表达预示不良预后，可能有利于TC进展。此外,我们使用NMS-P118处理8 30 5C细胞后，检测细胞增殖与凋亡状况,结果显示抑制PARP1的表达可显著抑制TC细胞的增殖并促进其调亡，这进一步表明PARP1可能在促进TC细胞增殖而加快TC进展过程中发挥着重要作用。在研究PARP1影响TC细胞生物学功能具体机制的过程中，我们通过从TCGA数据库中筛选出与PARP1表达呈显著相关的前10 0 0 个差异基因,并通过富集分析找出其所调控的主要信号通路。结果显示,PARP1参与调节TC细胞中包括剪接体、泛素化蛋白水解、RNA转运和内吞作用在内的多种生物学过程。PARP1调节TC细胞生物学过程的多面性既为我们靶向PARP1治疗TC提供了更多的可能性，又让我们的研究方向充满了复杂性。本研究中我们发现PARP1下游调控的ERK、JNK 信号通路及N-糖基化修饰都可能在TC细胞中发挥抑制调亡的作用。且我们使用PARP1抑制剂也证实抑制PARP1表达可显著抑制TC细胞中ERK和JNK的磷酸化水平。研究表明PARP1不但通过MAPK促进卵巢癌的进展14,还在非小细胞肺癌通过MAPK通路促进其转移15。值得注意的是,虽然最近的研究发现p38介导了核蛋白Kin17对TC细胞增殖和迁移的促进作用16 ,但本研究中PARP1抑制剂对TC细胞p38的激活无明显抑制作用，因此PARP1可能通过独立于p38的MAPK通路在TC细胞中发挥促癌作用，具体机制有待进一步深人探究。除了常规信号通路，本研究还重点关注了N-糖基化修饰途径。N-糖基化修饰是真核生物中一种高度保守的蛋白质修饰过程，多种甘露糖基转移酶参与N-糖基化途径并在不同的肿瘤当中发挥促癌作用17 。但是，不同的唾液酸转移酶对肿瘤的进展具有不同作用，如ST3GAL1能够促进前列腺癌细胞增殖、侵，抑制其凋亡18 ,而ST6GAL1则通过增加细胞间黏附因子1（ICA M-1）的唾液酸化而增加其蛋白质的稳定性，抑制结直肠癌细胞的转移能力19。我们通过TCGA数据库对TC患者中ALG1的表达与预后情况进行分析,发现ALG1高表达的TC患者OS具有降低倾向。此外，过表达ALG1可逆转NMS-P118对TC细胞的抑制作用。这说明N-糖基化修饰可能在TC的发展过程中扮演着重要角色,且有可能受PARP1的影响。但ALG1通过N-糖基化修饰下游何种关键靶分子进而影响TC细胞功能,还有待进一步的实验探索。综上所述,本研究表明TC中高度表达的PARP1通过调节N-糖基化酶ALG1促进TC细胞的N-糖基化修饰，从而抑制TC细胞调亡，促进其增殖。高水平表达的PARP1和ALG1都预示TC患者OS降低，这将为靶向PARP1治疗TC提供重要理论依据。参考文献1 Seib CD,Sosa JA.Evolving Understanding of the Epidemiology of Thy-roid Cancer JJ.Endocrinol Metab Clin North Am,2019,48(1):23-35.2 Ferrari SM,Elia G,Ragusa F,et al.Novel treatments for anaplastic thy-roid carcinomaJ.Gland Surg,2020,9(Suppl 1):S28-S42.3 KKitahara CM,Sosa JA.The changing incidence of thyroid cancer J.Nat Rev Endocrinol,2016,12(11):646-653.4 Prete A,Borges de Souza P,Censi S,et al.Update on Fundamental Mecha-nisms of Thyroid CancerJ.Front Endocrinol,2020,2020(11):102.5李浩，荣成，张诠.甲状腺癌靶向治疗进展J.分子诊断与治疗杂志,2 0 2 1,13(3):50 4-50 8.6 Cao X,Shao Y,Meng P,et al.Nascent Proteome and GlycoproteomeReveal the Inhibition Role of ALG1 in Hepatocellular 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