NF-κB、TGF-β1与风湿性心脏病心房颤动患者心房纤维化的关系.pdf

实验与检验医学2 0 2 3年8 月第41卷第4期Experimental and Laboratory MedicineAug.2023,Vol.41,No.4NF-KB、T G F-1与风湿性心脏病心房颤动患者心房纤维化的关系陈刚，贺少功，李伟(河南省平顶山市中医院,河南平顶山46 7 0 0 0)摘要：目的探究风湿性心脏病(Rheumatic heart disease,RHD)心房颤动（Atrial fibrillation，A F)患者心房纤维化和核因子kB(（Nu c l e a r f a c t o r k a p p a-B,NF-k B）、转化生长因子1(Transforming growthfactor-1，T C F-1)相关性。方法回顾性分析2019年1月至2 0 2 0 年12 月于我院行心脏瓣膜置换术的RHD患者10 0 例,其中AF者6 2 例为AF组，窦性心律(SR)者38例为 SR组,比较两组患者的NF-kB、T G F-1水平的变化,分析 RHD伴发 AF 患者的心房纤维化与NF-kB、T C F-1之间的关系。结果与SR组患者比较，AF组患者的右房心肌组织胶原容积分数增加，两者之间比较，差异有统计学意义(P0.05)；AF组患者的纤维化标志物TGF-1、水平增加明显,NF-kB磷酸化水平明显升高,与SR组患者比较,差异有统计学意义(P0.05);TCF-1水平及NF-kB磷酸化水平均与右房心肌组织胶原容积分数呈正相关。结论RHD伴发AF患者心肌组织中NF-kB激活可能促进分泌TGF-1,引起细胞外基质沉积，导致心房纤维化。关键词：风湿性心脏病；心房颤动；心房纤维化；核因子kB；转化生长因子1中图分类号：R541.7+5D0I:10.3969/j.issn.1674-1129.2023.04.026RHD 是由急性风湿热（Acute rheumatic fever,ARF)加重或反复发作导致的心脏瓣膜损伤引起的一种慢性瓣膜病变,ARF是由遗传易感个体对甲型链球菌引起的感染的自身免疫反应引起的-1。AF在心血管疾病患者中变得越来越常见，包括RHD、高血压、冠心病、先天性心脏病、心肌病和心包疾病等 3。AF可能诱发恶性心律失常、附壁血栓的发生，出现主要不良心血管病变,将严重影响人体健康 4。有研究表明,心房结构重构发生在AF的发作和发展过程中，将导致左心房扩张和左心室射血分数(LVEF)下降 5-6 。然而,预防或改善心肌纤维化可能会显著降低AF患者的左心房扩张并改善心功能7。因此,抑制心房纤维化可能是预防AF发展的关键。心肌纤维化是心脏病病变的一个重要组成特征，其特征是细胞外基质的过度表达和原纤维胶原的积累8。心肌中有五种胶原(即I、I V和V型),其中I型和型最常见 9-10 ,主要导致心脏疾病进展中的心肌纤维化叫。NF-kB是一种转录因子,控制与免疫和炎症反应、细胞生长和黏附有关的基因转录，在大多数细胞中普遍表达12 TCF-1是迄今发现的最有效的促纤维化细胞因子，也是导致心脏成纤维细胞活化和纤维化的关键介质,属于TGF-超家族的一个亚家族,能够调483.检验与临床文献标识码：A文章编号：16 7 4-112 9(2 0 2 3)0 4-0 48 3-0 4节增殖、生长抑制、细胞迁移和侵袭、肌成纤维细胞转化和细胞外基质重塑 13。本研究检测并比较了两组患者的NF-kB、T G F-1水平的变化，分析RHD伴发AF患者的心房纤维化与NF-kB、T G F-1之间的关系,现将结果报告如下。1资料与方法1.1一般资料通过回顾分析2 0 19年1月至2 0 2 0年12 月于我院行心脏瓣膜置换术的RHD患者100例。排除标准：（1）冠状动脉粥样硬化性心脏病、慢性肺源性心脏病、感染性心内膜炎等心脏病变患者;(2)甲状腺功能亢进患者;(3)严重肝、肾或肺功能障碍或恶性肿瘤患者；（4)服用可以减轻心室重构的药物的患者，包括血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素受体阻滞剂、受体阻滞剂和螺内酯等。其中AF者6 2 例为AF组,SR者38 例为SR组。收集入组患者的一般临床资料,如年龄、性别、左心房内径(LAD)、LVE F、心功能分级等。其中,SR组患者最大年龄8 0 岁，最小年龄6 3岁，平均年龄(6 8.7 35.2 8)岁。1.2研究方法及观察指标1.2.1采集标本所有患者都进行了心脏瓣膜置换手术,在此期间从每个患者中收集约2 0 0 mg右心房组织。每个样品被分成两部分。一部分迅速放入.484.液氮容器中，然后放入-8 0 冰冻保存；另一部分用盐水溶液洗涤，随后在室温下浸泡在4%多聚甲醛溶液中用于病理分析。1.2.2HE染色检测心房肌细胞的形态学变化右心房组织在室温下固定在4%多聚甲醛溶液中至少2 4h,并包埋在石蜡中。将厚度约4m的切片放在干净的带正电荷的显微镜载玻片上。干燥后，将载玻片在6 0 环境中加热。在脱蜡和再水合后，洗涤载玻片，用苏木精染色7 min用0.3%酸性醇区分,在斯科特的自来水替代物中漂洗,用苏木红染色2 min，然后脱水、清除并固定。所有上述实验都在室温下进行。光学显微镜被用来观察载玻片。1.2.3Masson染色测定心房肌间质和血管周围的胶原沉积在脱蜡和再水合后，载玻片被洗涤并在56的布恩溶液中重新固定1h，以提高染色质量。然后用韦格特的铁苏木精染色载玻片5min，在酸性品红溶液中染色8 min,然后在磷钼酸溶液中染色5min。载玻片随后用苯胺蓝溶液染色,在1%乙酸中分化,快速脱水,在二甲苯中清除,并使用树脂固定介质固定。Masson染色的所有步骤都在室温下进行。蓝色染色显示胶原蛋白的存在，红色染色显示肌肉和细胞质的存在。使用光学显微镜拍摄高倍光学显微照片。使用image-Pro Plus6.0(Media Cybernetics,Inc.Rockville,MD,USA)测定胶原蛋白体积分数(CVF)。1.2.4WB测定心房肌中NF-kB磷酸化水平使用放射免疫沉淀分析裂解缓冲液从-8 0 冰冻保存的右心房组织中提取总蛋白,BCA蛋白检测试剂盒用于测定蛋白浓度。使用10%SDS-PAGE加载和分离变性蛋白，然后转移到硝酸纤维素膜上。在室温下,用5%非脂肪乳封闭6 0 min后,将膜与初级抗体在4孵育过夜。第二天,将膜与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔孵育，作为第二抗体在室温下放置2 h。C h e m iD o c 触摸成像系统用于检测蛋白质信号，并使用Bandscan4.3进行分析。1.2.5RT-qPCR测定心房肌中TGF-1水平使用TRIzol试剂从-8 0 冰冻保存的右心房组织中组别男/女(n)SR组(n=38)69.44 4.15AF组(n=62)67.56 6.98TX1.689P0.094实验与检验医学2 0 2 3年8 月第41卷第4期Experimental and LaboratoryMedicine，A u g.2 0 2 3,Vo l.41,No.4分离总RNA。定量聚合酶链反应在Illumina-Eco机器上进行，根据肌动蛋白基因表达对结果进行标准化。反应条件为50 2 min,9510 mi n，9530 s,6 0 30 s。用1g总核糖核酸进行逆转录聚合酶链反应实验，然后进行40 个循环的聚合酶链反应扩增。通过分析Cq值和标准曲线，使用荧光信号的变化来量化表达水平；使用RUOViiA7软件对起始模板进行定量分析。1.3统计学方法将所采集数据输人Excel2013表建立量表数据库。将所有资料导人计算机，采用SPSS20.0软件进行统计分析。计数资料以频数表和百分率表示，采用x检验；计量资料以（xs）表示,采用t检验；用Pearson相关进行相关性分析。以=0.05为统计学检验标准,P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1两组患者的一般资料比较情况AF组患者的LAD明显大于SR组患者，两者之间比较,差异有统计学意义(P0.05)。见表1。2.2两组患者的心肌组织比较情况HE染色显示，AF组心肌细胞大于SR组。AF组表现出间质胶原纤维排列紊乱。此外,AF组的CVF值明显高于SR组,具有统计学意义(P0.05)。见图1。2.3两组患者的NF-kB、T G F-1水平比较情况与 SR组相比较,AF组患者的 NF-kB、T G F-1水平均明显升高，两者之间比较,差异有统计学意义(P0.05)。见表2。2.4RHD伴发AF患者心房纤维化和NF-kB、TGF-1相关性情况RHD伴发AF患者右心房CVF与NF-kB、T G F-1水平呈正相关关系，差异有统计学意义(P0.05)。见表3。3讨论ARF是遗传易感个体对GAS咽部感染的自身免疫反应的结果，链球菌抗原由抗原呈递细胞如巨噬细胞和树突状细胞识别、加工和呈递，导致B细胞产生抗体,B细胞与人成分交叉反应，导致多个宿主部位的损伤14。心脏瓣膜的长期损伤是ARF表1两组患者的一般资料比较年龄（岁）LAD(mm)19/1941.29 8.6232/3058.43 11.270.0258.0390.8760.000LVEF(%)63.66 10.3859.79 13.041.5520.124心功能 I/(n)16/2226/360.0000.987实验与检验医学2 0 2 3年8 月第41卷第4期Experimental and Laboratory MedicineAug.2023,Vol.41,No.4C图1RHD伴发AF患者扩张的心房肌细胞和积聚的胶原注：A为心房颤动组和房颤组患者右心房组织的苏木精伊红染色；B为AF组和SR组患者右心房组织的Masson染色。放大倍数，400;C为自发性高血压大鼠和房颤患者的胶原体积分数。与SR组相比，P0.05。表2 两组患者的NF-kB、T G F-1比较组别NF-K BSR 组(n=38)4.31 1.02AF组(n=62)5.45 0.786.971P0.000表3RHD伴发AF患者心房纤维化和NF-K B、T G F-1相关性右心房CVF指标PNF-K B0.266TCF-10.324更严重的并发症。有研究报道RHD的免疫反应可能与胶原自身免疫有关，宿主内皮产生抗基底膜胶原(IV型）自身抗体是病理过程的触发步骤。在链球菌感染中,M蛋白与IV型胶原的CB3区结合,导致形成一种复合物，促进胶原结构的构象变化，从而启动抗胶原反应5。因此，一种普遍存在的蛋白质可以成为自身抗原，导致胶原沉积和胶原降解之间的不平衡,最终导致RHD的纤维化。与非风湿性二尖瓣对照相比，风湿性心脏病患者的二尖瓣显示出较高的I型和型胶原沉积，这是纤维化的证据16 为探讨AF对心房结构重构的影响，采用HE染色和Masson染色评估心肌纤维化程度。HE染色显示,AF组心肌细胞大于SR组。通过测量心肌组织间质中胶原的总量和测定CVF来评价心肌纤维化。与SR组相比，AF组表现出间质胶原纤维排列紊乱。此外,AF组的CVF值明显高于SR组,有统计学意义（P0.05)。这些结果表明,RHD伴发485.AF患者具有扩张的心房肌细胞，并在心房肌中显示广泛的胶原沉积。心房纤维化是心房结构重塑0.51OSRAF030.20.10发生的主要过程，在AF的发生发展过程中起着关键作用，减轻心房纤维化以抑制心房结构重塑对预防AF的发生和发展至关重要117 。此外，心房纤维化是由心脏成纤维细胞和上皮细胞介导的,内皮细胞可以转化为成纤维细胞，这在心脏肥大和心脏纤维化中发挥重要作用 8 。因此，抑制心肌间质转化以减轻心肌纤维化可能是预防AF发展的重要途径。本研究相关性分析结果显示,RHD伴发AF患者的NF-kB、T G F-1水平与右心房CVF呈正相关,考虑是因为TGF-1能够通过上皮细胞和间TCF-1充质细胞在培养中促进纤连蛋白和胶原蛋白的产1.62 0.37生,并通过相关基因转录激活NF-kB,是心房纤维1.79 0.58化的潜在关键驱动因素119-2 0 2.300综上所述，RHD伴发AF患者心肌组织中0.023NF-kB激活可能促进分泌TGF-1,引起细胞外基质沉积，导致心房纤维化。参考文献1jSika-Paotonu D,Beaton A,Raghu A,et al.Acute RheumaticFever and Rheumatic Heart DiseaseJ.Nature Reviews Disease0.002Primers,2016,2(11):15084.0.0062Woldu B,Bloomfield G S.Rheumatic Heart Disease in the Twen-ty-First CenturyJ.Current Cardiology Reports,2016,18(10):96.3JLi M,Yi X,Ma L,et al.Hepatocyte growth factor and basic fi-broblast growth factor regulate atrial fibrosis in patients with atrialfibrillation and rheumatic heart disease via the mitogen-activatedprotein kinase signaling pathwayJJ.Experimental&TherapeuticMedicine,2013,6(5):1121-1126.4Jalife J,Kaur K.Atrial remodeling,fibrosis,and atrial fibrillationJ.Trends in Cardiovascular Medicine,2015(2516):475-484.5JCui-Ping,Nan,Wang,et al.TGF-beta 1 and TIMP-4 regulate a-trial fibrosis in atrial fibrillation secondary to rheumatic heart 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