DNS法与菲林试剂法测定酿酒大曲糖化酶活力的比较分析.pdf

DNS 法与菲林试剂法测定酿酒大曲糖化酶活力的比较分析郑东影，梅婕，陈玮，张温清*(安徽宣酒集团股份有限公司科研中心，安徽宣城242000)摘要:试验采用菲林试剂法和 DNS 法分别对 20 个大曲糖化酶活力进行测定，并比较两种方法测得结果的相关性、精密度和准确性。结果表明，DNS 法的检测值大于菲林试剂法，两种方法测得大曲糖化酶活力的结果高度相关（相关系数 r=0.9918）;同时两种方法测得糖化酶活力的精密度和准确度也均较好，相对于菲林试剂法，DNS法测定糖化酶活力的精密度较高，准确度稍好。两种方法均能满足大曲日常检测需求，从精密性和准确性来说，DNS 法相对更优。关键词：DNS 法；菲林试剂法；糖化酶活力；精密性；准确性中图分类号：TS262.3；TS207.3文献标识码：BComparison of the DNS Method and the Film ReagentMmethod for Determination of Daqu Glucoamylase ActivityZHENG Dongying,MEI Jie,CHEN Wei,ZHANG Wenqing*(Technology Research Center of Xuanjiu Group Co.,Ltd,Xuancheng 242000,Anhui,China)Abstract:In this study,The glucoamylase activity of 20 Daqu was measured by the Film Reagent method and DNS method respectively,andthe correlation,precision and accuracy of the results were compared.The results showed that DNS method was higher than photographicFilm Reagent method,and the two methods were highly correlated(r=0.9918);The precision and accuracy of the two methods were alsoacceptable.Compared with Film Reagent method,DNS method had higher precision and better accuracy.The two methods can meet theneeds of Daqu daily detection,and DNS method is relatively better in terms of precision and accuracy.Key words:DNS method,film Reagent method,glucoamylase activity,precision,accuracy大曲是白酒酿造中的生香剂，也是其主要的糖化发酵剂。大曲糖化酶又称葡糖淀粉酶，可以从淀粉的非还原性末端依次水解-1,4、-1,6、-1,3-葡萄糖苷健产生葡萄糖。糖化酶活力1是酿酒企业大曲质量控制的主要指标，也是衡量大曲对淀粉酶解生成葡萄糖的能力，其高低反应了大曲中的微生物对酿酒原料淀粉的利用效率2。糖化酶活性主要是通过检测酶水解前后，产物葡萄糖浓度的增加来进行量化表达。国标对糖化酶制剂采用碘量法3，该法准确可靠，但操作复杂，对糖化力低的样品颜色变化不明显，判断误差大，应用有局限性。菲林试剂法的应用最为广泛，各文献对方法虽进行了优化4-6,但是影响因素依然较多，且操作繁琐、时间长，对测定人员技术要求高，不同测定者的人为误差较大7。DNS 法测定还原糖的原理是在碱性条件下，黄色的3,5-二硝基水杨酸（DNS）与还原糖发生氧化还原反应生成 3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕红色，且在一定浓度范围内颜色的深浅与还原糖含量成正比例，该法因简便、快速而被广泛使用9-11，曹润洁等依此原理开发了 DNS 法快速测定大曲糖化酶活力的方法，并表明与菲林试剂法测定结果无显著差异。而林晓婕等12在研究 DNS 法测定红曲米糖化酶活力时，认为 DNS 法和碘量法的检测数据具有可比性，菲林试剂法的测定值偏收稿日期：2022-11-02作者简介：郑东影，女，硕士研究生，主要从事酿酒相关检测工作。*通信作者：张温清，男，博士，省专标委委员，安徽宣酒集团食品安全总监。文章编号:1002-8110（2023）05-0134-05第 50 卷 第 5 期2 0 2 3 年 9 月酿酒LIQUORMAKINGVol.50.5Sep.，2023134郑东影，等：DNS 法与菲林试剂法测定酿酒大曲糖化酶活力的比较分析第五期2023低。鉴于本厂所产大曲的糖化酶活性测定一直采用菲林试剂法，其准确度值得商榷。本文以宣酒集团生产的中高温大曲为对象，分别采用优化后的菲林试剂法和 DNS 法测定其酶活性，比较两种方法测定结果的相关性、精密度和准确性，为相关科研和实践应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料本试验所用大曲为宣酒集团新出房的高温曲及已储存一段时间的中温曲。1.2实验仪器TU-1901 双光束紫外可见光分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；ME204E 型分析天平，梅特勒-托利多公司(上海）；恒温水浴锅，江苏国胜实验仪器厂；电炉，北京中兴伟业世纪仪器有限公司。1.3溶液配制1.3.1葡萄糖标准溶液（1.0 g/L）准确称取已烘干至恒重的无水葡萄糖 1.0 g，用水溶液，加 5 mL 浓盐酸（防腐），并用水溶至1000 mL。1.3.2乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH4.6）2 mol/L 乙酸溶液：量取 118 mL 冰乙酸，加水稀释至 1000 mL。2 mol/L 乙酸钠溶液：称取 164 g 乙酸钠(CH3COONa)或 272 g 的三水乙酸钠（CH3COONa 3H2O），加水溶解 并定容至 1000 mL。将以上两种溶液等体积混合均匀，即为 pH 4.6 的乙酸-乙酸钠缓冲液。1.3.3淀粉溶液（20 g/L）称取 2.00 g 可溶性淀粉于 50 mL 烧杯中，用少量的水调匀后，不断搅拌下倒入 70 mL 沸水的烧杯中，并用水分次洗涤烧杯继续煮沸至透明，冷却后用水定容至 100 mL，此溶液现用现配1.3.420%NaOH 溶液称取 20 g氢氧化钠，加水溶解并稀释至 100 mL，摇匀，贮存于聚乙烯瓶中1.3.5斐林试剂斐林甲液：称取 15 g 硫酸铜（CuSO4 5H2O）、0.05 g 次甲基蓝，用水溶解并稀释至 1000 mL。斐林乙液：称取 50 g 酒石酸钾钠、75 g 氢氧化钠、4 g 亚铁氰化钾，用水溶解并稀释至 1000 mL。1.3.6DNS 试剂将 6.30 g DNS 用少量的温水溶解，与 262.0 mL2mol/L 氢氧化钠溶液先后加入到含有 182.0 g 酒石酸钾钠的温热水中，再加入 5.00 g 苯酚和 5.00 g亚硫酸钠，充分搅拌溶解，冷却后，用水定容至1000 mL，贮于棕色瓶中备用，使用前储存 7 d 以上，配制时溶液温度不超过 451.4样品预处理将大曲均匀破碎，称取相当于 5.00 g 绝干曲的试样量置于 250 mL 烧杯中，加入 90 mL 水及 10 mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液，搅匀。将烧杯置于 35恒温水浴中保温 1 h，间隔 15 min 搅拌 1 次，高速滤纸过滤得酶液备用。吸取 20 g/L 淀粉溶液 25mL 于 50 mL 的容量瓶中，加 5 mL 的缓冲溶液，于 35水浴中保温 10 min后。准确加入 10.00 mL 上述酶液，混匀并立即计时。1 h 后，迅速加入 2 mL 的 20%NaOH 溶液，终止酶解反应。再冷却至室温，用水定容至 50 mL，摇匀，即得样品糖化液（空白糖化液制取，先加入NaOH 溶液 2 mL，再加酶液，其余同样品糖化液制备）。1.5糖化酶活力的测定1.5.1菲林试剂法准确吸取斐林甲、乙液各 5.0 mL 于 150 mL三角瓶中，加入1(中温曲 1 mL、高温曲 5 mL)制备好的糖化液，自滴定管中加入一定量 1.0 g/L 的葡萄糖标准溶液(使随后滴定时其用量不超过 1 mL)，于电炉上加热至沸腾，保持沸腾 2 min，在沸腾状态下继续用葡萄糖标准溶液滴定至蓝色刚好消失而呈浅黄色，记录葡萄糖标准溶液的总用量。此滴定操作需在 1 min 内完成，同时作一空白试验。记录葡萄糖的消耗量并计算酶活力单位1.5.2DNS 法1.5.2.1标准曲线的绘制准确称取已烘干至恒重的葡萄糖 0.1000 g,用蒸馏水溶液定容至 100 mL容量瓶中，配成 1.0 mg/mL标准葡萄糖溶液，分别吸取 0、0.1 mL、0.3 mL、0.5 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.6 mL 的 1.0 mg/mL 标准葡萄糖溶液于 10 mL的比色管内，蒸馏水补足至1352 mL，加入 4 mL的 DNS 试剂混匀，将比色管置于沸水中显色 5 min，取出置于冷水中迅速冷却至室温，用蒸馏水定容至 10 mL。以 0 管为参比，在波长 600 nm 处测定吸光度。以葡萄糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。1.5.2.2样品糖化力测定比色条件参考曹润洁13，分别吸取mL的糖化液于 10 mL比色管中，蒸馏水补足至 2 mL，加入4 mL DNS 试剂混匀，置于沸水浴中显色 5 min，取出迅速冷却至室温，用蒸馏水定容至 10 mL，在波长 600 nm 处测定吸光值，以空白管调零，3 个重复。根据标准曲线记录葡萄糖含量，并计算酶活力单位。1.6糖化酶活力单位定义糖化酶活力的大小用酶活力单位表示，定义为：在 温度 35，pH4.6 时，1 g 绝干曲 1 h 内将可溶性淀粉分解为葡萄糖的量 1 mg 所需酶量为 1 个酶活力单位（U/g）1.7糖化酶活力计算公式1.7.1菲林试剂法糖化酶活力（U/g）=（0-）10011001015其中，0空白消耗标准葡萄糖量（mL）；样品消耗葡萄糖的量（mL）；标准葡萄糖浓度（mg/mL）;1测糖是吸取糖化液体积（mL）；100 糖化液体积（mL）；10 制备糖化液时吸取酶液体积（mL）；100 酶液体积（mL）；5 干曲质量（g）。1.7.2DNS 法糖化酶活力（U/g）=10011001015其中，所测吸光值对应的葡萄糖含量（mg）；100 糖化液体积（mL）；比色时吸取糖化液体积（mL）；10 制备糖化液时吸取酶液体积（mL）；100 酶液体积（mL）；5 干曲质量（g）。2结果与分析2.1葡萄糖-DNS 标准曲线以葡萄糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制葡萄糖-DNS 标准曲线，如图 1 所示。在 0.1 mg1.6 mg 范围内的葡萄糖含量与吸光度值之间呈良好的线性关系，其回归方程式为：y=0.7047x-0.0597，R2=0.99952.2两种检测结果的统计分析对随机选取本厂生产的中高温大曲 20 个样品分别采用菲林试剂法和 DNS 法进行糖化酶活力测定，并对检测结果进行统计得到如图 2，可以看出DNS 法所测曲样糖化酶活力的检测结果大于菲林试剂法。这与林晓婕等的研究结果一致，认为菲林试剂法检测还原糖值偏低。将菲林试剂法所测结果作为自变量，DNS 法结果作为因变量，利用 SRSS 软件对两者进行回归分析，得出相关系数 r=0.9918，回归系数 1.296（t=32.940），表明两种方法所测结果之间高度相关。结果分析见图 2。2.3两种方法精密度实验对比精密度是指在相同下 n 次重复测定结果彼此相符合的程度。精密度大小用相对标准偏差表示，1.21.00.80.60.40.20y=0.7047x-0.0597R2=0.99950.51.01.52.0葡糖糖含量/mg图 1y=1.2963x+2.6629R2=0.9837120010008006004002000菲林试剂法/U g-1100200300400500600700800图 3两种方法检测结果的线性回归分析菲林试剂法DNS 法图 220 组曲样结果比较10009008007006005004003002001000第五期2023酿酒136RSD 越小说明方法精密度越高。本试验选取高、中、低三个水平糖化力大曲各一份，按照两种不同的检测方法进行 5 次重复测定，并对精密度测试结果进行比较。结果见表 1，可知不管是高糖化力曲样，还是低糖化力曲样，DNS 法的 RSD%均小于菲林试剂法，说明 DNS 法的精密度大于菲林试剂法。2.4两种方法准确度实验对比为了检验方法的准确性，对两种方法进行样品加标回收试验，因菲林试剂法和 DNS 法均是基于还原糖的还原性来测定产物还原糖的生成量，以此计算糖化力。所以本试验用葡萄糖作为加标试剂进行加标回收，方法是根据样品糖化酶活力高低，向制备好的样品糖化液中加入不同量的标准葡萄糖，分别采用菲林试剂法和 DNS 法对加标糖液和未加标糖液的还原糖含量进行测定，计算葡萄糖的回收率，结果见表 2。由表 2 发现，DNS 法测曲糖化酶活力的回收率为 103%119%之间，菲林试剂法的回收率为80%92.5%，两方法的加标回收率都符合相关标准要求（80%120%），相对 DNS 法来说，菲林试剂法的葡萄糖回收率偏低。表 1DNS 法和菲林试剂法精密度比较样品曲 1曲 2曲 3方法DNS 法菲林试剂法DNS 法菲林试剂法DNS 法菲林试剂法198.460374340590460297.65637730060048039660378340598460497.652380360595470595.648377360598500RSD/%1.229.450.5757.20.6543.53糖化力/U g-1表 2DNS 法和菲林试剂法准确度比较曲样糖化力/U g-1448286242220148116葡萄糖加入量/g（相当糖化/U g-1）0.1(200)0.2(400)0.3(600)0.1(200)0.2(400)0.3(600)0.05(100)0.1(200)0.2(400)0.05(100)0.1(200)0.2(400)0.03(60)0.05(100)0.075(150)0.03(60)0.05(100)0.075(150)加标糖化力均值/U g-16598941103460620780345461675311390590215267318164199240回收率/%105.5111.51098783.582.3103110108918592.5111.7119113.3808382.7方法DNS 法菲林试剂法DNS 法菲林试剂法DNS 法菲林试剂法样品酒曲 1酒曲 2酒曲 33讨论宣酒所产的高温曲和中温曲糖化酶活力相差较大，新出房的高温曲糖化酶活力一般要求低于150 U/g，而中温曲糖化酶活力要求在 500 U/g 以上，为了降低检测误差，本实验在采用菲林试剂法测定中、高温曲糖化酶活力时，需要吸取不同体积的糖化液进行滴定，高温曲为 5 mL，中温曲 1 mL。这种变化使得中高温曲糖化力计算公式也发生改变（高温曲糖化力=（0-高）40；中温曲糖化力=（0-中）200）。由于测定者的滴定速度和对终点判断的偏差，容易造成0.10.3 mL 的滴定误差，对于高温曲就会有412 U/g 的相对误差，中温曲会有2060 U/g 的相对误差。DNS 法测定大曲糖化酶活力时，为了确保所测还原糖含量在标准曲线内，也需要根据样品糖化酶活力的高低，吸取不同体积的糖化液进行比色。高郑东影，等：DNS 法与菲林试剂法测定酿酒大曲糖化酶活力的比较分析第五期2023137温曲为 0.5 mL,中温曲 0.2 mL。所以 DNS 法的中高温曲糖化力计算公式也发生改变（高温曲糖化力=高400；中温曲糖化力=中1000）。因比色时随 机 误 差 的 存 在，同 一 样 品 的 吸 光 度 值 会有0.0010.01 的误差，根据葡萄糖的标准曲线推断，还原糖 M 的含量也会有0.0010.01 的偏差，那对于中、高温曲就会被带入110 U/g和0.44 U/g 糖化力误差。两种检测方法相对误差和计算公式的不同，导致测定结果的精密度不同。在两种方法的精密度试验中，DNS 法的相对标准偏差 RSD%明显小于菲林试剂法，可知 DNS 法测定酒曲糖化酶的精密度更高。但是方法精密度好并不代表方法的准确度就高。对于样品的测定，取样量越少，即稀释倍数越大，造成测定结果准确度的误差就越大。本试验中DNS 法测糖化酶活力时的稀释倍数是菲林试剂法的 510 倍，按照稀释倍数越大，准确度误差越大的原理，理论上 DNS 法的准确度要低于菲林试剂法。但是试验中发现 DNS 法的样品加 标回收率 为103%119%之间，而菲林试剂法的回收率为 80%92.5%，其平均回收率 85%低于 DNS 法的平均回收率 110.7%，如果用回收率来衡量方法准确度的话，那 DNS 法的准确度要稍高于菲林试剂法。分析原因可能是因为测定方法的不同造成的，也可能是滴定速度过快和滴定技术不稳定造成的。4结论本试验通过菲林试剂法和 DNS 法分别对 20 个大曲糖化酶活力进行测定。结果显示，菲林试剂法测定大曲糖化酶活力结果低于 DNS 法，两种方法测得糖化酶活力的结果高度相关（相关系数 r=0.9918）。通过对两种方法测得糖化酶活力的精密度和准确度的分析比对，DNS 法的相对标准偏差明显小于菲林试剂法，其平均回收率 110.7%大于菲林试剂法的平均回收率 85%。因此，两种方法均能满足大曲日常检测需求，但从精密性和准确性来说，DNS法相对更优。参考文献1QB/T 42572011 酿酒大曲通用分析方法S.2孟娇娇,崔海灏.大曲贮存过程中理化指标及微生物变化研究J.酿酒,2015,42(5)：43-45.3GB1886.1742016 食品工业用酶制剂S4马群,汪彩莉,李晓环,程险峰,汪棉坤.大曲糖化力测定方法的优化J.酿酒技,2019(08):61-64.5王中凯，张小君，雷敏.浓香型大曲糖化力测定方法的改进研究J.酿酒科技,2021（05）62-64+696温小英,廖勤俭,李扬华,王芳,练顺才.一种酒醅糖化力的测定方法J.酿酒科技,2013(05):100-101+104.7张凤英，吴芝岳，杨武英。测定小曲糖化力新方法的探讨J.酿酒科技,2006（04）：99-1048Miller G L.Use of dinitrosalicylic acid reagent for determinationof reducing sugarJ.Anal.Chem.,1959,31(3):426-428.9陈勇，陶德欣，鲁黎明.DNS 法测定烟草还原糖条件的优化J.江苏农业科学，2011，39（5）：393-395.10程柳，李静.3,5-二硝基水杨酸法测定山楂片中还原糖和总糖含量J.食品与生物，2016（3）：25-28.11颜繁鹤，周金梅，吴如春.DNS 法测定甘蔗渣中的还原糖含量J.食品研究与开发，2015（2）：126-128.12林晓婕，梁璋成，黄飞.红米曲糖化酶提取工艺及其糖化力测定方法选优J福建农业学报 2016，31（8）：89289613曹润洁,马叶胜，汤有宏.大曲糖化力快速检测方法的开发及应用J.酿酒,2021,48(3)：58-61.中国地图，一点都不能错！2023 年 8 月 28 日上午，在浙江举行的 2023 年测绘法宣传日暨国家版图意识宣传周主场活动现场，“2023 年版标准地图”正式发布并在自然资源部主办的标准地图服务网站上线。今年，自然资源部发布关于印发 公开地图内容表示规范 的通知，要求公开地图或者附着地图图形产品的内容表示，应遵守 公开地图内容表示规范。标准地图依据中国和世界各国国界线画法标准编制而成，可用于新闻宣传用图、书刊报纸插图、广告展示背景图、工艺品设计底图等，也可作为编制公开版地图的参考底图。社会公众可以免费浏览、下载标准地图，直接使用标准地图时需要标注审图号。第五期2023酿酒138