JMJD6在氯化锂-匹罗卡品颞叶癫痫大鼠模型中的表达.pdf

中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 21 JMJD6 在氯化锂-匹罗卡品颞叶癫痫大鼠模型中的表达 蓝 元1 韦建缘2 卢秉妮2 罗 期1 孔德燕2（通讯作者）1.广西医科大学，广西 南宁 530021 2.广西医科大学第二附属医院神经内科，广西 南宁 530007 摘要：摘要：目的 颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy，TLE）是临床中最常见的难治性癫痫。Jumonji 结构域家族蛋白 6（the jumonji domain-containing protein 6，JMJD6）与神经系统密切相关且被发现在恶性肿瘤中高表达，而 JMJD6 与 TLE 之间的关系目前尚未明确。本研究旨在探讨 JMJD6 是否参与 TLE 的发生发展，为阐明 TLE 的发病机制提供新的思路。方法 该研究运用 qRT-PCR 和 Western blot 检测氯化锂-匹罗卡品 TLE 大鼠中，mRNA 及 JMJD6指标情况。结果 样本大鼠 JMJD6 在氯化锂-匹罗卡品颞叶癫痫大鼠模型中的表达情况高于正常大鼠。结论 mRNA及 JMJD6 有可能参与 TLE 的发生发展。关键词：关键词：颞叶癫痫；JMJD6；氯化锂-匹罗卡品；大鼠 中图分类号：中图分类号：R74 Expression of JMJD6 in Lithium chloride-pilocarpine temporal lobe epilepsy rat model LAN Yuan 1 WEI Jianyuan 2 LU Bingni 2 LUO Qi 1 KONG Deyan 2(Corresponding author)1 Guangxi Medical University,Guangxi,Nanning 530021 2 Department of Neurology,The Second Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Guangxi,Nanning 530007 Abstract:Objective:Temporal lobe epilepsy(TLE)is the most common refractory epilepsy in clinic,so it is particularly necessary to find new therapeutic targets for TLE to control the seizure and improve the therapeutic effect of TLE.The jumonji domain-containing protein 6(JMJD6)has recently been found to be highly expressed in malignant tumors and can promote tumor cell proliferation.However,the relationship between JMJD6 and TLE has not been clarified.The purpose of this study is to investigate whether JMJD6 is involved in the occurrence and development of TLE,and to provide new ideas for elucidating the pathogenesis of TLE.Methods:qRT-PCR and Western blot were used to detect the expression of JMJD6 mRNA and protein levels in TLE rat model of lithium chlorine-Pilocapine,so as to explore the role of JMJD6 in TLE pathogenesis.Result:In this study,qRT PCR and Western blot were used to detect mRNA and JMJD6 indicators in Lithium chloride pilocarpine TLE rats.Results:The expression of JMJD6 in the sample rat model of Lithium chloride pilocarpine temporal lobe epilepsy was higher than that in the normal rat model.Conclusion:mRNA and JMJD6 may be involved in the occurrence and development of TLE.Keywords:temporal lobe epilepsy;JMJD6;Lithium chloride-pilocarpine;Rat 在神经内科中，TLE 属于较常见的难治性癫痫类型之一。大多数的 TLE 患者在规律使用药物治疗后仍出现癫痫发作，对抗癫痫药物具有耐药性，需要通过手术切除病灶来控制癫痫发作。Jumonji 结构域家族蛋白6（the jumonji domain-containing protein 6，JMJD6）是一种同时具有组蛋白精氨酸去甲基酶、赖氨酰羟基中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 22 酶及酪氨酸激酶活性的表观遗传调节分子，有研究表明 JMJD6 在神经元上广泛表达1。另一研究发现 JMJD6能够介导突触素的表达进而影响SD幼年鼠的空间学习记忆功能2。本研究拟通过检测氯化锂-匹罗卡品诱导的 TLE 大鼠模型中 JMJD6 的表达水平，探讨 JMJD6 与TLE 间的关系，为探索新的抗癫痫药物作用靶点及新的治疗方法提供理论依据。1 材料与方法 1.1 实验动物与分组 本实验选取 6 周龄、体重为 180-220g 的 SPF 级雄性大鼠。根据研究要求对小鼠进行均匀分组。为保证试验开展质量，先对大鼠适应性喂养 3-7d 后在进行实验。1.2 主要试剂及仪器 荧光扫膜仪；垂直电泳-转膜仪；实时荧光定量 PCR 仪；逆转录 PCR 仪；山羊抗兔荧光二抗；兔抗 JMJD6 多克隆抗体；荧光定量 PCR 检测试剂盒；逆转录试剂盒；组织总 RNA 提取试剂；戊巴比妥钠11 水合氯醛；匹罗卡品；硫酸阿托品；氯化锂。1.3 氯化锂-匹罗卡品模型的建立 氯化锂-匹罗卡品 TLE 大鼠模型的构建是在 Tang W3等人的实验方法的基础上进行的。干预时均是在腹腔内注入药物的。TLE 组（氯化锂溶液-127mg/kg）。18-24h 后注射第二个药物（硫酸阿托品溶液-1mg/kg）。第三种药物为诱导癫痫发生类药（匹罗卡品溶液-35mg/kg）。对照组大鼠腹腔注射等量的生理盐水。按照 Racine 分级标准4评估大鼠癫痫发作的程度，具体标准为：0 级：无惊厥抽搐等异常行为；I 级：静止或伴有面部的抽动；若是表现以点头为主的抽动为级；若是前肢单侧抽动为级；若是双侧前肢抽动，且伴有身体立起为 IV 级；若是出现强癫痫状态为 V 级。将 IV 及 V 级的时称之为 SE 持续状态。腹腔注射匹罗卡品 30min 后若大鼠未诱发出 SE，则每隔 10min 腹腔注射匹罗卡品（10mg/kg）直至出现SE。在成功诱发 SE1h 后予以 10%水合氯醛（300mg/kg）终止癫痫发作。凡追加注射 3 次匹罗卡品后仍未出现SE、SE 持续时间1h 及未到达预定取材时间而中途死亡的大鼠均不纳入后续实验。只有成功诱发 SE1h 且能存活至预定取材时间的大鼠才能纳入后续实验。1.4 qRT-PCR 比较癫痫发作后的 SD 大鼠 24h 后脑海马组织 RNA分布情况，基因表达量计算应用 2-Ct 相对定量分析计算。引物设置：RNA 复制转录引物设置：JMJD6 下游引物：TGCTGTCAAAGATGTAAAGGGGACTATC。JMJD6上游引物：GTGTGGTGAGGATAACGATGGCTAC；GAPDH 下游引物：GAAGG-CTGGGGCTCATTT；GAPDH 上游引物：CAGGAGGCATTGCTGATGAT。1.5 Western blot 取 20mg 冻存的海马组织于 EP 管中，加入 200L提前配制好的组织裂解混合液（高效RIPA组织裂解液：PMSF：磷酸酶抑制剂=100：1：1）提取蛋白。用 10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离样本蛋白，然后转移到 PVDF 膜上，5%BSA 室温封闭 1h。洗膜并将条带放在兔抗 JMJD6 多克隆抗体（1：1000）中 4孵育过夜。次日洗膜后在室温下避光孵育山羊抗兔荧光二抗（1：20000）1h。用 LI-COR Odyssey CLx 荧光成像系统扫描 PVDF 膜，用 ImageJ 分析软件对所得条带的灰度值进行定量分析。1.6 统计学方法 借助 SPSS 26.0 软件，计量资料组间比较采用 t检验，计数资料比较采用2检验，P0.05 视为数据存在比对价值。2 结果 2.1 氯化锂-匹罗卡品 TLE 大鼠模型构建结果 通过实验我们可以观察到腹腔注射匹罗卡品后大鼠的动作逐渐减少，活动范围逐渐变小，眼神逐渐变得呆滞。接着出现面部轻微抽动、以点头为主的节律性抽搐，随后过渡为一侧或双侧前肢离地并伴全身抽动，四肢痉挛，甚至出现向尾部转圈、反复跌倒站立及全身强直的癫痫发作状态，期间可看到有大鼠出现流涎、吐白沫、发汗或者眼眶出血的症状。本项实验使用了 25 只健康的雄性 SD 大鼠，除了随机选取的 5 只大鼠纳入正常对照组外，其余 20 只大鼠用于构建氯化锂-匹罗卡品 TLE 模型。其中有 15 只大鼠成功诱发出 SE，仍有 5 只大鼠未成功诱发 SE，SE诱导的成功率为 75.00%。在成功诱发 SE 的 15 只大鼠中，有 10 只大鼠存活至取材时间，存活率仅为 66.67%，中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 23 有 5 只大鼠死亡，死亡率为 33.33%。2.2 大鼠海马组织 JMJD6 的 mRNA 表达水平 我们用 qRT-PCR 检测正常对照组与 TLE 组大鼠海马组织 JMJD6 的 mRNA 表达水平的变化。我们的结果发现TLE组大鼠JMJD6的mRNA表达水平高于正常对照组，差异具有统计学意义（图 1，JMJD6：3.300.48 vs.1.030.22，P0.001，n=5）。图 1 各组大鼠海马组织 qRT-PCR 结果 注：与正常对照组比较，*，P0.001；n=5。2.3 大鼠海马组织 JMJD6 蛋白表达水平 图 2 各组大鼠海马组织 Western blot 结果 注：与正常对照组比较，*，P0.001；n=5。（A）各组大鼠海马组织 Western blot 分析的典型图片。（B）各组大鼠海马 JMJD6 蛋白表达量的分析。我们运用 Western blot 检测正常对照组与 TLE 组大鼠海马组织 JMJD6 蛋白表达水平的变化。我们的结果显示，TLE 组大鼠的 JMJD6 蛋白表达水平明显高于正常对照组，差异有统计学意义（图 2，1.100.10 vs.0.260.04，P0.001，n=5）。3 讨论 癫痫作为一种常见的慢性神经系统疾病，由于其复杂的发病机制导致癫痫治疗的困难性大大提升，被世界卫生组织列为重点防控的疾病。癫痫中最常见的类型即 TLE，70%的 TLE 患者能够用药物控制癫痫的发作，但仍有 30%的患者产生耐药性，进而发展为难治性癫痫。TLE 不仅影响患者的身心健康，给患者带来沉重的经济负担，同时也给社会带来的不可估量的医疗负担。因此寻找有效治疗 TLE 的分子靶标及方法成为我们医疗科研工作者的重中之重。2004 年，JMJD6 首次被证明在胚胎发生过程中对多器官的发育和分化至关重要5，另一研究也证实了JMJD6 能影响大脑、脊索等神经系统的正常发育6。不仅如此，有学者表明宫内缺氧可能通过上调 JMJD6 介导的细胞核内组蛋白去甲基化而使与海马突触可塑性有关的突触素表达降低，进而导致 SD 幼年鼠的空间学习记忆能力降低2。以上研究都表明 JMJD6 与神经系统有着紧密的联系。越来越多的研究证实 JMJD6 的异常表达与多种疾病的发生发展有关，包括乳腺癌、骨肉瘤、黑素素瘤和白血病等7。另外，有研究显示过表达的 JMJD6 与恶性肿瘤晚期临床病理分期、侵袭性增加及生存率降低相关，被视为疾病不良预后的分子指标8。通过以上研究我们提出猜想：JMJD6 是否与 TLE的发生发展有关联？我们通过构建氯化锂-匹罗卡品TLE 大鼠模型发现，与正常对照组相比，TLE 大鼠海马组织中 JMJD6 的 mRNA 及蛋白表达水平均明显升高，提示 JMJD6 可能与 TLE 的发病有密切联系。我们的研究首次将 JMJD6 与 TLE 联系起来，探讨氯化锂-匹罗卡品 TLE 大鼠模型中 JMJD6 表达水平的变化，为研究 TLE 的发病机制提供新思路。为弄清 JMJD6与 TLE 之间的关系，我们在后续的实验中将继续深入研究 JMJD6 参与 TLE 发病的具体通路及分子机制，为寻找有效的癫痫治疗方法提供新的切入点。参考文献 1MO C,XU M,WEN C,et al.Normalizing JMJD6 Expression in Rat Spinal Dorsal Horn Alleviates Hyperalgesia Following Chronic Constriction Injury J.Front Neurosci,2018(12):542.2 Raghuraman N,Temming LA,Doering MM,et al.Maternal Oxygen Supplementation Compared With Room Air for Intrauterine Resuscitation:A Systematic Review and Meta-analysis.J.AMA Pediatr,2021,175(4):368-376.3 TANG W,HE X,FENG L,et al.The Role of Hippocampal Neurogenesis in ANT-DBS for LiCl-Pilocarpine-Induced Epileptic Rats J.Stereotact Funct 中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 24 Neurosurg,2021,99(1):55-64.4RACINE R J,GARTNER J G,BURNHAM W M.Epileptiform activity and neural plasticity in limbic structures J.Brain Res,1972,47(1):262-268.5B SE J,GRUBER A D,HELMING L,et al.The phosphatidylserine receptor has essential functions during embryogenesis but not in apoptotic cell removal J.Biol,2004,3(4):15.6 HONG J R,LIN G H,LIN C J,et al.Phosphatidylserine receptor is required for the engulfment of dead apoptotic cells and for normal embryonic development in zebrafish J.Development,2004,131(21):17-27.7 YANG J,CHEN S,YANG Y,et al.Jumonji domain-containing protein 6 protein and its role in cancer J.Cell Prolif,2020,53(2):12747.8 ZHAO Y F,LI L,LI H J,et al.LncRNA ZFPM2-AS1 aggravates the malignant development of breast cancer via upregulating JMJD6 J.Eur Rev Med Pharmacol Sci,2020,24(21):39-47.基 金 项 目：广 西 自 然 科 学 基 金 项 目（2023GXNSFAA026197）；2022 年度广西医疗卫生适宜技术开发与推广应用项目（S2022103）；广西 2022 年度广西壮族自治区卫生健康委员会西医类自筹经费科研课题（Z-A20220669）。