3D生物打印技术在皮肤修复中的应用.pdf

：通信作者：黄文华，教授，博士生导师，：基金项目：南方医科大学 年大学生创新训练计划项目（）综述 生物打印技术在皮肤修复中的应用马锦媛，吴耀彬，黄文华 南方医科大学第二临床医学院，广东广州 ；南方医科大学基础医学院人体解剖学国家重点学科 广东省医学生物力学重点实验室 广东省医学 打印应用转化工程技术研究中心，广东广州 摘要 皮肤是人体最大的器官，其结构的完整性对维持人体的正常生理机能有重要作用。大面积皮肤创伤的修复和皮肤慢性溃疡的愈合问题是临床待解决的难题。尽管过去组织工程皮肤的研究已取得很多成果，但如何一体化构建具有毛囊、汗腺、皮脂腺等皮肤附属器和血管网络的组织工程皮肤等仍有许多难题有待解决。近年来，生物打印技术迅速发展，为解决上述难题提供了新思路。本文对新兴的 生物打印技术在皮肤创面修复中的应用、前景和目前存在的问题进行综述。关键词 生物打印；皮肤修复；生物墨水 ，；，：，：，；皮肤位于人体表面，是人体的第一道防线，其完整性对于保持机体内环境的稳定、免受外界环境中各种病原体的侵犯、维持人体的正常生理机能起到重要作用。作为人体最大的器官，其由表皮、真皮、皮下脂肪组织三层结构和其它一些成分如细胞外基质（，）、毛细血管、神经、毛囊、顶泌汗腺、外泌汗腺、皮脂腺等组成。皮肤发生创伤时，需要及时清创缝合，恢复创伤皮肤的结构、功能和形态。尽管目前临床上可以使用敷料和组织工程产品覆盖创面，但皮脂腺、毛囊和感觉神经等皮肤附属器几乎无法再生，如果创伤面积大时自体供皮也不能皮肤性病诊疗学杂志 年 月第 卷第 期满足皮肤移植需要，因此通过新兴的 生物打印技术辅助修复创伤的皮肤，以达到快速修复创口并减少瘢痕的形成已经成为一种趋势。生物打印技术 生物打印是一种以计算机三维模型为图纸，将特制生物墨水，装配种子细胞，进行层层打印构建具有生物活性的组织或者器官的制造技术，主要有三类：喷墨式生物打印、挤压式生物打印和激光生物打印。这项基于离散堆积原理的分层制造、逐层堆砌的打印技术，能够打印出可以模仿人体复杂解剖结构和生理功能的组织，在组织工程中应用广泛。通过打印不同组织、器官的活细胞并添加各种生物活性材料的生物墨水，能够彻底改变 结构的生物、化学、生理和机械特性，最终达到增强组织和器官最优功能化的目的 。关于 材料的优势，研究发现使用负载外泌体的 明胶细胞外基质水凝胶 周后的实验组皮肤创面面积（）明显低于空白组（），表明其有效促进创面愈合 。余海洋等 利用 挤压式打印成功构建了不同规格的海藻酸钠 明胶皮肤支架，并初步证明了 的海藻酸钠 明胶皮肤支架具有较好的生物相容性和胶原蛋白分泌效应，并能有效抑制炎症反应的发生。喷墨式生物 打印该技术由喷墨打印技术发展而来，用生物墨盒（水凝胶和细胞的混合物）代替传统墨盒。喷墨液滴压缩有 种方法：热喷墨、压电喷墨、声喷墨和静电喷墨，其中热法和压电法是应用最为广泛的结构制备方法。打印过程包括两个阶段：将生物墨滴分配到基材上的特定位置；生物墨滴与基材接触时的相互作用（交联和凝胶）。打印分辨率与液滴大小相对应，可以通过调整喷嘴直径、墨水粘度、电压冲击频率以及热喷墨的温度梯度进行优化 。喷墨生物打印的优点是成本低、打印速度快、分辨率高且能够改变浓度梯度 。这项技术的缺点是由于喷墨的打印头不能挤出高黏度材料，所以不适用于高密度细胞的打印，并且交联和凝胶过程导致细胞活性和功能受损。值得注意的是，这种打印技术已经被改进和开发为手持便携式生物打印设备，用于原位打印应用，以解决传统皮肤移植中不规则伤口的修复问题 。挤压式生物 打印挤压式生物打印是所有生物打印方式中应用最广泛的一种，利用气动压力或机械力，将连续的生物材料流（而不是液滴）喷射到基板上 。气动系统通过使用加压气体将生物墨水从喷嘴挤出，从而实现更好的材料流动控制，而机械系统通过活塞的压缩力提供更好的挤出速度控制。挤压式打印虽然能够负载高细胞密度进行打印，但打印过程中的剪切力往往对细胞具有损伤作用，因此该打印方式的细 胞 生 存 能 力（）低 于 喷 墨 生 物 打 印（）。降低挤出压力和增加喷嘴尺寸可一定程度提高细胞活力，但会导致打印速度降低和分辨率降低。因此，需要微调喷嘴直径、打印压力和速度，以确保使用该方法打印的组织结构的功能。另一方面，也需要开发出具有剪切变稀的打印材料从而降低喷嘴处细胞所受到的剪切力。这项打印技术支持多种兼容材料，如水凝胶、生物相容性共聚物和高种植密度的细胞球体，通常用于体外生物工程方法来生成 人体皮肤结构 。激光生物打印激光生物打印的工作原理是将脉冲激光聚焦在能量吸收带层上，产生高压气泡，将生物墨水喷射到基材上，它是一种无喷嘴技术，与其他生物打印技术相比不存在细胞或材料堵塞喷嘴的问题，因此可用于不同粘度的各种生物墨水，以实现高分辨率打印。但与其他喷墨机制相比，高温和激光会损伤细胞，因此激光生物打印的细胞存活率普遍低于喷墨生物打印。此外，激光生物打印的高分辨率打印会导致打印速度相对缓慢，每小时仅能打印 皮肤组织，并会因脱水而影响水凝胶的保真度和构造功能 。因此，这种打印技术更多地应用于无细胞生物制造，如在伤口敷料中加入精确数量的生物分子 。生物打印技术在皮肤修复中的应用现状与传统组织工程及其他几种先打印支架成型后再接种细胞构建组织的打印方式相比，生物打印将不同类型的细胞精确打印在相应的空间位置，根据不同组织或器官特性添加相适应的生物材料后形成类似组织或器官的强度和弹性并产生一定的生物学功能。体外 生物打印皮肤的应用生物打印的一个主要优点是能够将生物相容性基质中的不同生物墨水或细胞混合物整合到打印构件的特定的位置。可以利用这一特性来设计与天然皮肤更相似的皮肤替代品，以提高创面修复的成功率。等 使用挤压式 打印机设计和制造了由人真皮成纤维细胞、角质形成细胞和微血管内皮细胞组成的双层皮肤结构，之后被移植到小鼠的全层切除伤口上，以检测他们对伤口愈合的影响。与无细胞基质对照相比，生物打印的含有角质形成细胞、成纤维细胞和内皮细胞的模拟皮肤移植物加速了伤口的愈合，伤口收缩增加了 。在另一项研究中，含有脐带血来源的人内皮细胞、胎盘周细胞、包皮真皮成纤维细胞和角质形成细胞的 打印构建体在胶原生物墨水中具有与正常人体皮肤相似的生物学和形态学功能 。更重要的是，在实验模型中，当移植到创面上时，胎盘周细胞和含人真皮微血管内皮细胞的移植物在植入 周和 周后均观察到宿主的微血管迅速进入移植物 。这些研究表明，改良的 生物打印皮肤替代物可以加快移植物 ，内血管形成，改善伤口部位移植物的血供，从而更好地促进伤口的愈合。生物打印还被应用于基于干细胞的皮肤溃疡产品的开发，将所需密度的活性干细胞精确地整合到生物活性支架中，以创造出具有增强细胞再生和伤口愈合潜力的创面贴片。据报道脱细胞猪皮肤细胞外基质中含有脂肪来源干细胞和内皮祖细胞的 打印皮肤贴片可以促进表皮的再生 。这些发现证明了 生物打印细胞结构在伤口愈合中的适用性，它可以通过促进血管重建等来提高皮肤替代物的长期存活率 。原位皮肤生物打印的应用原位皮肤生物打印利用喷墨生物打印技术，使用手持设备或机器人自动化系统将充满细胞的生物墨水直接打印到人体伤口部位 。这种生物打印方法可以将浓缩的皮肤细胞悬浮液打印在伤口上加速其愈合。等 开发了一种手持式 原位生物打印机，能够在小鼠和猪伤口模型中直接打印，细胞在伤口原位形成皮片。等 使用便携式喷墨生物打印机和激光生物打印机，将高密度的人成纤维细胞和角质形成细胞悬浮液以纤维蛋白 胶原生物墨水打印在实验小鼠的全层皮肤切除的伤口上。伤口上打印的皮肤结构保留了很高的细胞密度，打印后长达 周的时间里，组织中还可以观察到人类细胞的存在。与没有治疗和用无细胞的移植物相比，直接原位皮肤 生物打印治疗的伤口愈合更快。等 对伤口愈合过程中干细胞来源的种子细胞的作用也进行了评估，使用机器人喷墨生物打印机将羊水源性干细胞（，）和携带骨髓间充质干细胞（，）的纤维蛋白 胶原生物墨水直接打印在小鼠的全层皮肤切除的伤口上。与单纯凝胶对照组相比，接受 和 治疗的小鼠其伤口闭合和表皮形成要更快一些。在另一项调节伤口部位旁分泌活性的实验中，等 将含有 的肝素偶联透明质酸水凝胶直接打印在全层皮肤切除的伤口上，水凝胶可在原位隔离 分泌的细胞因子，延长旁分泌活性，并使全层创面更快地闭合和血管化。原位生物打印的主要优点是能够根据创面的精确形态对细胞墨水进行分层，因此，这种方法特别适用于治疗形态不规则的创面。生物打印技术在皮肤修复中未来的发展方向 研制新型皮肤 打印的生物墨水使用具有生物相容性的细胞外基质为基础的水凝胶，在打印皮肤结构时可以制造类似于正常皮肤的细胞外基质的微环境，这对于皮肤创伤的修复非常重要。目前常用的具有生物相容性的脱细胞外基质水凝胶，无论是天然的还是人工合成的，均缺乏重要的生化因子，因此都不能完全具备天然皮肤的细胞外基质的生物活性。因此，研制与皮肤组织生物学特性一致的新型生物墨水材料很有必要 。最近研发的导电聚合物可以将电刺激直接应用于伤口区域，促进更快的伤口愈合，此外还可以通过使用外部电刺激来调节药物或生物制剂向伤口部位的释放 。由于缺乏细胞外基质和有微生物的存在，慢性伤口的碱性（值为 ）明显高于健康皮肤（值为 ），而与 接近中性的伤口相比，碱性伤口愈合较慢 ，因此研制 值敏感性的生物墨水也可能有助于促进伤口修复。例如，已经开发出一种调节 值敏感性的水凝胶，可以在 而不是 或 的条件下释放隔离的血管内皮生长因子（，）。这种生物墨水可以用来重建合适的微环境，以促进皮肤创伤的愈合。此外，其他可开发为潜在的皮肤生物打印墨水材料包括低熔点琼脂糖、壳聚糖、温敏性、热敏性水凝胶等 。生物打印方式的改进 等 报道利用可生物降解的大分子聚乙二醇 二硫苏糖醇，开发出一种瞬时的水凝胶载体，可以在早期阶段改善细胞存活率，然后进行生物降解，并在更有利的条件下将输送的人间充质干细胞（，）定向释放到 打印的聚合 （，）支架中。与标准悬浮打印相比，这种细胞的包裹和输送方式可以改善 在 打印的聚合 移植物中的分布。此外，聚合 支持 释放后持续的细胞活性和成骨分化。这些结果说明这种原位固化的水凝胶载体可以增强 在骨移植中的均匀分布和保持成骨分化的能力。虽然这种改进的生物打印方法最初用在改善骨再生，但将细胞包裹在水凝胶载体中的这种新方法有望应用于皮肤的组织工程中。个性化治疗 生物打印可以为患者不同的部位和疾病定制产品，促进了精准医学的发展。与商品化的皮肤替代品相比，皮肤移植的 原位生物打印能够定制与伤口大小和形状一致的产品，从而能确保覆盖整个伤口，并且愈后更美观 。然而，目前仅对小伤口（面积小于 ）可实现原位生物打印，而对于面积较大的伤口，由于生物打印皮肤内的血管不能快速形成，因此可能造成局部皮肤缺血坏死 。此外，可以通过 生物打印来制造个性化的含有药物的伤口敷料或皮肤移植物，以便能够将特定剂量或治疗药物的组合（如抗炎药）用到伤口部位，以满足患者特殊的治疗需要 。最近研究显示接种了金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的全层伤口的动物模型，使用注入硅油和纳米银皮肤性病诊疗学杂志 年 月第 卷第 期等可生物降解的聚二甲基硅氧烷进行 打印的伤口敷料，具有高效的抗菌活性，并改善再上皮化和肉芽组织的形成 。创面愈合过程中，机体内功能正常的细胞合成和分泌多种生物活性分子（如分泌性蛋白、生长因子和细胞因子），刺激表皮、真皮和血管的再生和重建 。因此，在商用的生物人工皮肤支架产品中加入多种生长因子，如在 生物打印支架中加入 ，已经证实可以增加体内内皮细胞的增殖和血管生成 。因此，通过 生物打印技术将生物活性分子精确地打印到新型生物相容性细胞外基质中，可以加快皮肤创伤的愈合 。结语与展望每一种 生物打印技术都有其优缺点，因此适合于不同生物材料的制造。目前的组织工程技术尚无法精确模拟体内生理环境，传导重建皮肤附件所需要的真皮刺激信号，诱导干细胞进行定向分化，构建含皮脂腺、毛囊、汗腺等皮肤附属器结构的复合皮肤 。如何确定一种优越的凝胶化方法（合适的生物墨水）以实现预胶化溶液的快速稳定而不影响细胞活力和研制经济、便于运输和不易失活的种子细胞也是目前 打印技术研究的重点 。因此，如何构建性价比高且更接近天然皮肤生物学性能的组织工程化皮肤仍是该领域亟待解决的关键问题。随着高精度的 生物打印技术的成熟，更多的新型细胞或干细胞分化的皮肤附属器细胞（如脂肪源性干细胞、羊水源性干细胞、诱导性多潜能干细胞）、天然材料（如海藻酸钠、壳聚糖、胶原、透明质酸、丝素蛋白等）和人工合成的水凝胶材料可用于皮肤 生物打印。进一步研究光电技术也可以为 生物打印的发展提供帮助，例如使用三角法等光电技术可以实现快速扫描，减少打印准备时间；使用红外荧光能够获得更精确的数据，并与打印过程实时结合，生产出定制程度更高的皮肤 。因此，随着材料科学、组织工程学、细胞培养技术的更新发展及各学科间的交叉协作，未来有望研发出高度接近天然皮肤组织结构和功能的皮肤替代物。参考文献 ，（）：凌华军，崔瑞文，王其友负载外泌体的 明胶细胞外基质水凝胶促进皮肤损伤愈合 中国组织工程研究，（）：余海洋，梅峻豪，秦立昊，等 打印海藻酸钠 明胶皮肤支架及其与成纤维细胞的体外生物相容性研究 组织工程与重建外科，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，?，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，：，：，（）：，：，：，：，（），（）：，（）：，：，：？，：，：，：，：，（）：，（）：，：，：，：，：?，：，（）：，：，：，：，（）：连伟龙，连芩，焦天，等皮肤修复生物 打印的研究进展与挑战 光电工程，（）：收稿日期 （编辑：孙希凤）皮肤性病诊疗学杂志 年 月第 卷第 期