5-氟尿嘧啶介导氧化应激治疗结肠癌的关键基因筛选.pdf

收稿日期:基金项目:长沙市科学技术局指导性科技项目(k z d )作者简介:杨丰帅(),男,硕士研究生,主治医师,主要从事胃肠肿瘤疾病发病机制方面的研究.通信作者:彭玲,主管护师,E m a i l:q q c o m.氟尿嘧啶介导氧化应激治疗结肠癌的关键基因筛选杨丰帅a,彭玲b,邱东达a,杨运泉a,陈石林a,周厚吾a(长沙市第一医院a 胃肠外科;b 外科护理,长沙 )摘要:目的探 究 氟 尿 嘧 啶(F U)介 导 氧 化 应 激 治 疗 结 肠 癌 的 关 键 基 因.方 法从G S E 和G S E 数据集中筛选 F U介导氧化应激治疗结肠癌的共同差异基因(D E G s),并对共同D E G s进行功能富集,构建P P I网络筛选关键基因.基于T C GA数据集和G S E 数据集,分析关键基因在结肠癌中的表达、相关性及其与预后的关系.利用分子对接实验验证 F U对关键基因的靶向作用.结果筛选出 个共同D E G s;这 个基因在功能上与P 信号通路、细胞周期等条信号通路和有丝分裂细胞周期过程、微管等 项功能有关.P P I网络分析筛选得到个关键基因(AUR KA、C D C A、C C N B、K I F 、S P A G、B U B B和K I F A);这个关键基因均在结肠癌中高表达,且 F U可显著抑制结肠癌细胞中这个关键基因的高表达(均P);在T C GA和G S E 数据集中这个关键基因的表达之间均具有较好的相关性(r,均P).这个关键基因的高表达与结肠癌患者总体生存不良密切相关(L o g r a n kP).F U与这个关键基因之间存在靶向作用.结论成功筛选个与 F U介导氧化应激治疗结肠癌相关的关键基因.关键词:氟尿嘧啶;结肠癌;氧化应激;生物信息学;关键基因中图分类号:R 文献标志码:A文章编号:()D O I:/j c n k i n c d m 结肠癌是临床上最常见的消化道恶性肿瘤之一,发病率较高.由于结肠癌侵袭性高、预后不良以及缺乏靶向治疗等,其病死率在全球癌症相关死亡中排名第二.据统计,全世界每年约有 万结肠癌新发病例,其中约 万例因该病死亡.结肠癌的发病机制复杂,与不良饮食习惯、吸烟、饮酒等外在因素以及遗传等内在因素有关.氧化应激是组织或细胞中高活性物质如活性氧(r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s,R O S)产生过多,导致氧化程度超过氧化物的清除能力,进而引起组织或细胞损害的过程.有研究 表明,氧化应激在结肠癌的发生发展和治疗过程中发挥着重要作用.氧化应激可通过介导细胞凋亡、自噬、坏死、铁死亡等方式诱导结肠癌细胞死亡.氟尿嘧啶(F l u o r o u r a c i l,F U)是当前治疗结肠癌的一线药物.有研究发现,F U可通过诱导结肠癌细胞发生氧化应激而发挥治疗结肠癌的作用.但是,F U调控结肠癌细胞氧化应激的作用机制尚不明确.随着基因组微阵列和高通量测序技术的发展,基于基因表达谱数据的生物信息学分析被广泛用于药理作用及病理机制的研究.本研究采用生物信息学方法筛选与 F U介导氧化应激治疗结肠癌相关的关键靶点及信号途径,并进行相关验证,将为 F U介导氧化应激治疗结肠癌的分子机制研究提供参考.资料与方法资料来源利 用G E O数 据 库(h t t p s:/www n c b i n l mn i hg o v/g e o p r o f i l e s/)获取人结肠癌细胞的 F U治疗相关基因表达谱(G S E 数据集)和氧化应 激 相 关 基 因 表 达 谱(G S E 数 据 集).G S E 数据集为 F U处理和未处理条件下人结肠癌HC T 细胞的基因表达谱.G S E 数据集为HO处理和未处理条件人结肠癌MD A M B 细胞和H C T 细胞的基因表达谱.利用癌症基因组图谱(T C G A)数据库(h t t p s:/p o r t a l g d c c a n c e r g o v)获取结肠癌基因表达谱和患者总体生存等信息,用于验证关键基因的表达与预后的关系.南昌大学学报(医学版)年第 卷第期J o u r n a l o fN a n c h a n gU n i v e r s i t y(M e d i c a lS c i e n c e s),V o l N o F U介导氧化应激治疗结肠癌相关基因的筛选使用R软件(版本:)对G S E 和G S E 数据集进行背景校正、标准归一化处理和表达式值计算.分别以l o g|(F C)|,P 和l o g|(F C)|,P 为阈值筛选G S E 数据集和G S E 数据集中的差异基因(d i f f e r e n t i a l g e n e s,D E G s),并筛选这个数据集的共同D E G s,即为 F U介导氧化应激治疗结肠癌的相关基因.功能富集分析使用M e t a s c a p e(h t t p:/M e t a s c a p e o r g/g p/i n d e x h t m l/m a i n/s t e p)数据库和D AV I D数据库(h t t p s:/d a v i d n c i f c r f g o v/)对 共 同D E G s进 行GO注释和K E G G通路富集分析.P P I网络分析及关键基因的筛选使用S t r i n g数据库(h t t p:/s t r i n g d b o r g)对共同D E G s进行蛋白质蛋白质相互作用(p r o t e i n p r o t e i n i n t e r a c t i o n,P P I)分析,构建P P I网络.然后通过C y t o s c a p e软件计算P P I网络的拓扑参数,以度值 为阈值,筛选P P I网络中的关键基因,即为 F U介导氧化应激治疗结肠癌的关键基因.关键基因的表达验证及相关性分析利用G S E 数据集,计算关键基因在 F U处理和未处理时人结肠癌细胞中的表达差异.从T C GA数据库中下载结肠癌相关的数据集(包含 个正常结肠组织样本和 个结肠癌组织样本),比较关键基因在正常和结肠癌组织中表达的差异.P e a r s o n相关性分析在G S E 数据集和T C GA数据库中关键基因在结肠癌中表达的相关性.关键基因的生存预后分析利用T C GA数据库获取关键基因在结肠癌中的表达谱和患者的总体生存信息,绘制相应的生存曲线,评估 关 键 基 因 与 生 存 的 关 系.以L o g r a n kP 为差异有统计学意义.分子对接验证P u b c h e m数据库(h t t p s:/p u b c h e mn c b i n l mn i hg o v/)中下载 F U的 D结构.从P D B数据库(h t t p s:/wwwr c s b o r g/)下载关键基因编码蛋白的 D结构,利用D i s c o v e r ys t u d i o软件验证小分子药物与关键靶点的相互作用,对接效果以对接分数(L i b s c o r e)评价,L i b s c o r e越大,表明 F U与关键基因的对接效果越佳.结果 F U介导氧化应激治疗结肠癌的共同D E G s筛选基于G S E 数据集,MD A MB 细胞系中 筛 选 获 得 个 与 氧 化 应 激 密 切 相 关 的D E G s,其中 个D E G s显著上调,个D E G s显著下调;HC T 细胞系中筛选获得 个与氧化应激密切相关的D E G s,其中 个D E G s显著上调,个D E G s显著下调.见图.从MD A MB 和HC T 细胞系中获得 个与氧化应激密切相关的共同D E G s,包括 个正相关基因和 个负相关基因.见图.BAHCT_1_2HCT_2_1HCT_1_1HCT_2_2MDA_1_2MDA_2_1MDA_1_1MDA_2_2正常对照组H2O2处理组正常对照组H2O2处理组A:HC T 细胞系中氧化应激相关基因的筛选;B:MD A MB 细胞系中氧化应激相关基因的筛选.图G S E 数据集中与氧化应激密切相关的D E G s筛选南昌大学学报(医学版)年月,第 卷第期图与氧化应激相关的共同D E G s筛选基于G S E 数据集,从H C T 细胞系中筛选获得 个与 F U治疗密切相关的D E G s,包括 个上调基因和 个下调基因.见图 A.基于G S E 和G S E 数据集,共获得 个与氧化应激和 F U治疗均密切相关的共同D E G s,包括个上调基因和 个下调基因.见图 B.BAA:人结肠癌HC T 细胞系中与 F U治疗作用相关的D E G s筛选;B:氧化应激和 F U治疗作用相关的共同D E G s的筛选.图与氧化应激和 F U治疗均密切相关的共同D E G s筛选功能富集分析K E G G功 能 富 集 分 析 结 果 显 示,个 共 同D E G s显著富集于P 信号通路、细胞周期、细胞衰老、F O X O信号通路等条信号通路.见图 A.GO功能注释分析结果显示,个共同D E G s主要富集于有丝分裂细胞周期过程、微管、主轴机构、蛋白质磷酸化的正调节等 项功能.见图 BC.AA:K E G G功能富集分析.图共同D E G s功能富集分析杨丰帅等:氟尿嘧啶介导氧化应激治疗结肠癌的关键基因筛选BCB:GO功能注释;C:GO功能注释条目之间相互关系连接图.图(续)P P I网络分析及关键基因的筛选P P I网络分析图见图.以度值 为阈值,从P P I网络中获得个关键基因,分别为AUR KA、C D C A、C C N B、K I F 、S P A G、B U B B、K I F A.这个关键基因在P P I网络中的拓扑参数见表.图D E G s的P P I网络分析图表个关键基因的拓扑参数基因名称度值中心度邻近中心度聚类系数邻近连通性AUR KA C D C A C C N B K I F S P A G B U B B K I F A 关键基因在结肠癌组织中表达的验证及相关性分析T C G A数据库结果显示,与正常组织(n)比较,在肿瘤组织(n )中个关键基因A U R K A、C D C A、C C N B、K I F 、S P AG、B U B B、K I F A的表 达 均 显 著 增 加(均P ).见 图.G S E 数据集差异分析显示,F U可显著抑制HC T 细 胞 系 中AUR KA、C D C A、C C N B、K I F 、S P AG、B U B B、K I F A基因的高表达(均P).见图.南昌大学学报(医学版)年月,第 卷第期图个关键基因在结肠癌与正常组织中的表达分析图个关键基因在 F U治疗结肠癌细胞中的表达分析P e a r s o n相关性分析结果显示,在T C GA数据库中关键基因在人结肠癌组织中的表达具有良好的相关性(r,P),其中C C N B 表达与K I F A表达之间具有最强的正相关(r).见图 A.在G S E 数据集中关键基因在人结肠癌细胞中的表达具有很好的相关性(r,P).见图 B.A:T C GA数据库中关键基因在人结肠癌组织中表达的相关性;B:在G S E 数据集中关键基因在人结肠癌细胞中表达的相关性.图关键基因的表达相关性分析关键基因表达与预后的相关性分析生存分析结果显示,关键基因AUR KA、C D C A、C C N B、K I F 、S P AG、B U B B、K I F A的高表 达 与 结 肠 癌 患 者 总 体 生 存 不 良 密 切 相 关(L o g r a n kP).见图.1.00.80.60.40.20.0生存率/%总体生存时间/月1005001501.00.80.60.40.20.0生存率/%总体生存时间/月100500150BA1.00.80.60.40.20.0生存率/%总体生存时间/月100500150C总体生存时间/月总体生存时间/月总体生存时间/月1.00.80.60.40.20.0生存率/%1005001501.00.80.60.40.20.0生存率/%100500150ED1.00.80.60.40.20.0生存率/%100500150F总体生存时间/月1.00.80.60.40.20.0生存率/%100500150GAG:AUR KA、C D C A、C C N B、K I F 、S P A G、B U B B、K I F A.图个关键基因的总体生存分析杨丰帅等:氟尿嘧啶介导氧化应激治疗结肠癌的关键基因筛选分子对接验证分子对接结果显示:F U与个关键基因之间具有良好的结合作用.见图.AG:B U B B、AUR KA、C C N B、C D C A、K I F 、S P A G、K I F A.图 F U与个关键基因的分子对接可视化分析图讨论在结肠癌等疾病的发生发展和治疗过程中,氧化应激发挥着双重作用:可诱发癌变,也可选择性地杀死癌细胞.临床多种抗癌药被证实可增加细胞内R O S,触发氧化应激而导致癌细胞死亡.例如,紫杉烷类(如紫杉醇、多西紫杉醇)、长春花生物碱类(如长春碱、长春瑞滨)、抗代谢药物(如氟达拉滨)等抗癌药物可促进线粒体释放细胞色素C,扰乱电子传输链,导致氧自由基的大量产生而促进癌细胞凋亡.但是,F U作为结肠癌的一线治疗药物,其介导结肠癌细胞氧化应激的作用机制尚不明确.基于G E O数据库,本研究从氧化应激相关的结肠癌细胞基因表达谱G S E 和 F U治疗相关的结肠癌细胞基因表达谱G S E 中筛选出 个与氧化应激和 F U治疗均密切相关的共同D E G s.基于功能富集分析,本研究发现 F U诱导结肠癌细胞氧化应激发生可能与P 信号通路、细胞周期、细胞衰老、F O X O信号通路等K E G G信号通路,以及有丝分裂细胞周期过程、微管、主轴机构、蛋白质磷酸化的正调节等等生物过程密切相关.基于P P I网络分析,本研究鉴定出个与 F U诱导结肠癌细胞氧化应激密切相关的关键基因,包括AUR KA、C D C A、C C N B、K I F 、S P AG、B U B B和K I F A.进一步研究发现,这个关键基因在结肠癌中高表达,其高表达可能与结肠癌患者总体生存不良密切相关,而 F U可有效抑制结肠癌细胞中这个关键基因的高表达.而且,分子对接实验证实 F U与关键基因之间存在良好的结合作用.P 是一种重要的肿瘤抑制因子,在抑制肿瘤发生和改善抗肿瘤药物治疗中发挥着重要作用.在氧化应激状态下,p 被激活并结合到染色质上,高度特异地调节转录相关靶基因,进而驱动肿瘤细胞的凋亡、铁死亡、自噬、细胞周期停滞、衰老等反应,发挥抗癌作用 .叉头转录因子(F O X O)是一种具有 抑 癌 作 用 的 转 录 因 子,由F o x O、F o x O、F o x O 和F o x O 四个成员组成.Z HANG等 研究表明,F O X O可通过激活促凋亡蛋白(如B I M和B A D)、死亡受体配体(如F a s)、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(T R A I L)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(C D K I s)来促进凋亡信号的传导.有研究 发现,F O X O信号通路的激活可由氧化应激介导.P 信号通路和F O X O信号通路作为氧化应激驱动的抗肿瘤信号途径已被证实,但尚无 F U通过氧化应激调控P 信号通路和F O X O信号通路发挥抗结肠癌作用的相关报道,故本研究将为该机制研究提供依据.此外,本研究鉴定的关键基因AUR KA、C D C A、C C N B、K I F 、S P AG、B U B B和K I F A均被发现 与 结 肠 癌 等 多 种 癌 症 密 切 相 关.有 研究 报道,下调这些关键基因的表达可抑制结肠癌等.L I U等 研究发现,AUR KA可诱导结肠癌细胞G/M期阻滞和线粒体相关途径,导致结肠癌细胞凋亡.TOO L A B I等 研究显 示,AUR KA、C C N B、B U B B、K I F A和B U B 在结肠癌组织中高表达,并且与结肠癌的不良预后显著相关.此南昌大学学报(医学版)年月,第 卷第期外,有研究 表明,AUR KA、B U B B的高表达可被R O S抑制.综上,本研究初步发现 F U诱导结肠癌细胞的氧化应激可能与关键基因AUR KA、C D C A、C C N B、K I F 、S P AG、B U B B和K I F A密 切 相关,但它们之间具体的调控关系仍需更多功能和机制实验加以验证.参考文献:P ANBY,X I AYF,GAOZL,e t a l C i n n a m o m i r a m u l u s i n h i b i t st h eg r o w t ho fc o l o nc a n c e rc e l l sv i a A k t/E R Ks i g n a l i n gp a t h w a y sJC h i nM e d,():WON G MC,D I N GHY,WANGJX,e t a l P r e v a l e n c e a n d r i s kf a c t o r so f c o l o r e c t a l c a n c e r i nA s i aJI n t e s tR e s,():C I A R D I E L L OF,C I A R D I E L L OD,MA R T I N IG,e t a l C l i n i c a lm a n a g e m e n to fm e t a s t a t i c c o l o r e c t a l c a n c e r i nt h ee r ao f p r e c i s i o nm e d i c i n eJC AC a n c e r JC l i n,():Z HAO W,Z HUAN GP,C HE NY,e t a l D o u b l e e d g e ds w o r d e f f e c to f r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s(R O S)i nt u m o rd e v e l o p m e n ta n dc a r c i n o g e n e s i sJP h y s i o lR e s,():AUY E UN GKK,KOJK A n g i o g e n e s i s a n do x i d a t i v e s t r e s s i nm e t a s t a t i ct u m o rp r o g r e s s i o n:p a t h o g e n e s i sa n dn o v e lt h e r a p e u t i ca p p r o a c ho f c o l o nc a n c e rJ C u r rP h a r m D e s,():T ANHD,C HE N W,L I UQS,e t a l P e c t i no l i g o s a c c h a r i d e s a m e l i o r a t ec o l o nc a n c e rb yr e g u l a t i n go x i d a t i v es t r e s s a n di n f l a mm a t i o n a c t i v a t e ds i g n a l i n gp a t h w a y sJ F r o n tI mm u n o l,:P E T T E R S E NK,MON S E N VT,HAKV GP E T T E R S E NCH,e ta l DHA i n d u c e ds t r e s sr e s p o n s ei nh u m a nc o l o nc a n c e rc e l l s f o c u so no x i d a t i v es t r e s sa n da u t o p h a g yJ F r e eR a d i cB i o lM e d,:P E R I L L OB,D ID ONA T O M,P E Z ON EA,e t a l R O S i nc a n c e rt h e r a p y:t h eb r i g h ts i d eo ft h e m o o nJ E x p M o lM e d,():A F R I NS,G I AMP I E R IF,F O R B E SHE R NN D E ZTY,e t a l M a n u k ah o n e ys y n e r g i s t i c a l l ye n h a n c e st h ec h e m o p r e v e n t i v ee f f e c to f f l u o r o u r a c i l o nh u m a nc o l o nc a n c e r c e l l sb y i n d u c i n go x i d a t i v es t r e s sa n da p o p t o s i s,a l t e r i n g m e t a b o l i cp h e n o t y p e sa n ds u p p r e s s i n g m e t a s t a s i sa b i l i t yJ F r e eR a d i cB i o lM e d,:E B R AH I M ISO,R E I I S IS,S HA R E E FS m i R NA s,o x i d a t i v es t r e s s,a n dc a n c e r:ac o m p r e h e n s i v ea n du p d a t e dr e v i e wJJC e l lP h y s i o l,():J I AN G H,Z UOJ,L IBW,e t a l D r u g i n d u c e do x i d a t i v e s t r e s si nc a n c e rt r e a t m e n t s:a n g e lo rd e v i l?J R e d o xB i o l,:刘斌,刘晔P 信号通路在苦参碱诱导人结肠癌S W 细胞凋亡的作用机制J辽宁医学杂志,():王博,李恩萍,杨长春,等汉黄芩素通过调节P 信号通路增强宫颈癌对顺铂的化疗敏感性J中国免疫学杂志,():Z HAN GXB,T AN G N M,HA D D E N TJ,e ta l A k t,F o x Oa n dr e g u l a t i o no fa p o p t o s i sJ B i o c h i m B i o p h y sA c t a,():HOU T Y,L IZ M,Z HAO Y,e ta l M e c h a n i s m sc o n t r o l l i n gt h ea n t i n e o p l a s t i cf u n c t i o n so fF o x O p r o t e i n sJ S e m i nC a n c e rB i o l,:L I UXJ,Z HAN GYR,WUSQ,e t a l P a l m a t i n e i n d u c e sG/Mp h a s e a r r e s t a n dm i t o c h o n d r i a l a s s o c i a t e dp a t h w a ya p o p t o s i s i nc o l o nc a n c e rc e l l sb yt a r g e t i n g AUR KAJ B i o c h e mP h a r m a c o l,:J E ONT,KO MJ,S E OYR,e t a l S i l e n c i n gC D C A s u p p r e s s e sh e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m ag r o w t ha n ds t e m n e s sv i ar e s t o r a t i o no fA T F t u m o r s u p p r e s s o r a n d i n a c t i v a t i o no fAK T/c a t e n i ns i g n a l i n gJC a n c e r s(B a s e l),():Z HU Y,S UNLT,YUJR,e t a l I d e n t i f i c a t i o no fb i o m a r k e r si nc o l o nc a n c e rb a s e do nb i o i n f o r m a t i ca n a l y s i sJ T r a n s lC a n c e rR e s,():MOHAMA D A L I Z A D E H HA N J A N IZ,S HAH B A Z IS,G E R A N P A Y E H LI n v e s t i g a t i o no ft h eS P A G g e n ee x p r e s s i o na n da m p l i f i c a t i o nr e l a t e dt ot h e N u MA mR NAl e v e l si nb r e a s td u c t a l c a r c i n o m aJ W o r l dJS u r gO n c o l,():T OO L A B IN,D A L I R IFS,MOKHL E S IA,e ta l I d e n t i f i c a t i o no fk e yr e g u l a t o r sa s s o c i a t e dw i t hc o l o nc a n c e rp r o g n o s i sa n dp a t h o g e n e s i sJJC e l lC o mm u nS i g n a l,():HOU D W,D ON G H G,WAN G Q AUR KAc o n t r i b u t e st ot h ep r o g r e s s i o n o fo r a ls q u a m o u sc e l lc a r c i n o m a(O S C C)t h r o u g h m o d u l a t i n g e p i t h e l i a l t o m e s e n c h y m a l t r a n s i t i o n(EMT)a n da p o p t o s i sv i at h er e g u l a t i o no fRO SJB i o c h e mB i o p h y sR e sC o mm u n,():GUN T AN IA,MAT S UMO T O T,KYUR A G IR,e ta l R e d u c e dp r o l i f e r a t i o no fa g e dh u m a nv a s c u l a rs m o o t h m u s c l ec e l l s r o l eo fo x y g e n d e r i v e df r e er a d i c a l sa n dB u b R e x p r e s s i o nJJS u r gR e s,():(责任编辑:黄永红)杨丰帅等:氟尿嘧啶介导氧化应激治疗结肠癌的关键基因筛选