着丝粒蛋白M在卵巢透明细胞癌中的表达及作用.pdf

宁夏医科大学学报4缘卷第 45 卷6 期2023 年 6 月宁夏医科大学学报Journal of Ningxia Medical University卵巢癌（ovarian cancer，OC）是全球女性最致命的生殖系统恶性肿瘤之一，在妇科恶性肿瘤中发病率排名第三，且逐年增加，严重威胁着女性的生活质量1。其中，超过 85%的 OC 是上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）。卵巢透明细胞癌（ovarian clear cell carcinoma，OCCC）作为 EOC的一种特殊亚型，具有独特的发病机制、分子变化和临床行为。OCCC 的恶性程度高于其他类型，传统化疗药物效果不好，易耐药，易复发，预后差2。因此，探讨 OCCC 的进展机制对于改善OCCC患者预后具有重要意义。着丝粒蛋白 M（cen原tromere protein M，CENPM）是着丝粒蛋白家族的成员，对于染色体的正确分离至关重要，CENPM异常表达会导致染色体不正确分离，从而加速肿瘤的发生和癌变。CENPM 在肝癌3、肺腺癌4和胰腺癌5等恶性肿瘤中均高表达。本课题组前期研究发现，CENPM 对肿瘤药物克唑替尼（crizotinib）的靶标间变性淋巴瘤激酶（ALK）具有调控作用，提示其作为多种肿瘤潜在新靶点的价值。但 CENPM 在 OCCC 中的表达情况、参与疾病发生发展的机制仍不清楚，本研究旨在进一步探讨CENPM 在 OCCC 发生发展中的作用，为揭示其作用机制提供实验依据。1材料与方法1.1标本来源收集 20172021 年宁夏医科大学总医院手术切除并保存的 OCCC 及其癌旁组织标本各 10例，患者年龄 3168 岁。所有患者均经病理证实，未进行任何放化疗及靶向治疗。患者或其家属签署知情同意书，并经宁夏医科大学医学伦理委员会批准（2022-G026）。1.2细胞系及主要试剂OCCC 细胞株 ES2 由课题组保存；McCoy s5A 培养基购自武汉赛维尔生物科技有限公司；胎牛血清购自以色列 BI 公司；CCK-8 试剂盒购自大连美仑生物技术有限公司；Annexin V 细胞凋亡检测试剂盒购自美国 BD 公司；细胞周期检测试剂盒购自上海贝博生物科技有限公司；CENPM兔单克隆抗体购自美国 Affinity 公司；GAPDH 鼠单克隆抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；鼠二抗购自美国 Proteintech 公司；兔二抗购自美国ImmunoWay 公司；LipofectamineTM2000购自美国Thermo Scientific 公司；si-NC 和 si-CENPM购自美国 Origene 公司，各序列如下：SR312293A：rUrArArArCrArUrUrCrUrCrUrGrUrUrGrArGrGrArUrGrUCC；SR312293B：rGrCrArGrCrUr收稿日期：2023-01-31基金项目：宁夏自然科学基金重点项目（2022AAC02028）作者简介：张玲（1998），在读硕士研究生，研究方向：肿瘤基础。E-mail：通信作者：梁锦屏（1977），博士，教授，研究方向：肿瘤免疫、感染免疫。E-mail：着丝粒蛋白 M 在卵巢透明细胞癌中的表达及作用张玲员，马小霞员，张芳伟员，张咏梅2，梁锦屏员（1.宁夏医科大学基础医学院，银川750004；2.银川市第一人民医院妇科，银川750001）摘要：目的探讨着丝粒蛋白 M（centromere protein M，CENPM）在卵巢透明细胞癌（ovarian clear cell carcino原ma，OCCC）组织中的表达及对 OCCC 中 ES2 细胞株增殖、迁移、凋亡的影响和作用机制。方法采用 HE 染色观察 OCCC 组织病理改变；免疫组织化学法检测 OCCC 组织及癌旁组织 CENPM 的表达；si-CENPM 转染 ES2细胞；Western blot 检测 CENPM 蛋白的表达；CCK-8 法、细胞划痕实验检测细胞增殖和迁移能力；流式细胞仪评价 CENPM 对细胞凋亡和周期的影响。结果与癌旁组织相比，OCCC 组织中 CENPM 高表达（P0.01）；转染si-CENPM#B 组 ES2 细胞 CENPM 蛋白表达水平较 si-N悦 组降低（P0.01）；与 Control 组和 si-N悦 组比较，敲减 CENPM 后 ES2 细胞的增殖、迁移能力下降（P均0.05）；敲减 CENPM 后 ES2 细胞凋亡率增高，阻滞 ES2 细胞的周期在 S 期（P均0.05）。结论下调 CENPM 可抑制人 OCCC 中 ES2 细胞株的增殖、迁移并促进细胞凋亡，提示 CENPM 参与了 OCCC 的发生发展。关键词：着丝粒蛋白 M；卵巢透明细胞癌；增殖；凋亡中图分类号：砸737.31文献标识码：ADOI院10.16050/ki.issn1674-6309.2023.06.008文章编号：1674-6309（2023）06-586-07论著586窑窑6期GrGrCrGrUrGrUrUrArCrArUrCrUrCrCrATT；SR312293C：rGrCrArGrCrUrGrGrCrGrUrGrUrUrArCrArUrCrUrCrCrATT；Scrambled negative control：rCrGrUrUrArArUrCrGrCrGrUrArUrArArUrArCrGrCrGrUAT。1.3HE 染色将组织蜡块切片处理后置入 68 益烤箱过夜，次日进行脱蜡、脱水处理，脱水完成后，PBS清洗；切片用苏木精水染液处理 5 min，PBS 清洗；切片置于稀释后的氨水与 0.5%的盐酸乙醇中浸泡 30 s，然后冲洗 1 min；将 0.5%的伊红染液覆盖在组织上 1 min，冲洗 1 min；进行梯度脱水，脱水后将切片置于二甲苯玉、域中各 5 min，待切片晾干，封片，镜检。1.4免疫组织化学检测石蜡切片脱蜡后采用高锰酸钾/草酸盐法脱色。脱色后，切片放入 EDTA 抗原修复液中加热，煮沸 3 min。将高压锅放在自来水下，冷却至室温。加入一抗，37 益恒温箱孵育 1.5 h，PBS 液冲洗；加入二抗，室温孵育 0.5 h，PBS 液冲洗。加入DAB 显色液 10 min，隔光。以流动的水完全冲洗掉显色液。经过复染、脱水和透明，用中性树脂封固剂封片。显微镜观察组织并拍照，棕褐色着色颗粒为阳性结果。使用 Image J 软件分析得到CENPM 阳性面积后进行统计学分析。1.5细胞培养和转染将 OCCC 细胞株 ES2 培养（培养条件：McCoy s5A 培养基、10%FBS 和 1%青霉素-链霉素）至对数生长期时进行后续实验，实验分为空白对照（Control）组、阴性对照（si-NC）组和实验（si-CENPM）组，前 1 天将细胞按照 2.5伊105个/孔平铺于 6 孔板中，次 日转 染（按照 LipofectamineTM2000 说明书进行相应的转染操作），6 h 后换液，继续培养至相应时间以便进行其他实验操作。1.6Western blot 鉴定转染 si-CENPM 的 ES2 细胞敲低效率实验设置 Control 组、si-NC 组、si-CENPM#A组、si-CENPM#B 组和 si-CENPM#C 组，分别提取各处理组的 ES2 细胞总蛋白后，BCA 法定量，100 益变性 10 min，使用质量分数为 10%的SDS-PAGE 电泳分离蛋白、转膜、封闭，封闭结束后在 4 益冰箱中孵育一抗（1颐1 000）过夜；次日，从冰箱中拿出置于摇床上慢摇 1 h 复温，TBS-T清洗 3 遍，室温孵育二抗（1颐10 000）2 h，TBS-T清洗 3 遍；最后使用 ECL 发光液显影曝光，通过Image J 软件分析蛋白印迹条带，以内参 GAPDH与各处理组蛋白条带的灰度值之比作为蛋白的相对表达量。筛选出敲低效率最好的 si-RNA 进行后续实验，统一用 si-CENPM 表示。1.7CCK-8 法检测细胞增殖能力实验设置 Control 组、si-NC 组和 si-CENPM组，在 96 孔板中接种各组 ES2 细胞，分别孵育 24、48、72 h，后续步骤参考 CCK-8 试剂盒说明书进行操作，最后用酶标仪检测 450 nm 处的 OD 值。1.8细胞划痕试验检测细胞迁移能力实验设置 Control 组、si-NC 组和 si-CENPM组，事先在准备好的 6 孔板背后画平行的 3 条线，各组细胞铺板完成待细胞长满后，在超净工作台上用 200 滋L 枪头垂直于事先标记的 6 孔板背面横线画三条竖直的线；PBS 洗涤至没有漂浮的细胞后，加入无血清的 McCoy s 5A 培养基，分别培养 0、24 h，显微镜下拍照，图片使用 Image J软件分析。划痕愈合率（%）=（划痕面积0 h原划痕面积24 h）/划痕面积0 h伊100%。1.9流式细胞仪检测细胞凋亡实验设置 Control 组、si-NC 组和 si-CENPM组，处理 48 h 后用不含 EDTA 的胰酶消化各组细胞，离心弃去废液后 PBS 液洗涤 2 遍，用 1伊loading buffer 重悬细胞，各组分别取 100 滋L 至新 标 记 好 的 1.5 mL EP 管 中，先 加入 5 滋LAnnexin吁，再加入 5 滋L 7-AAD，混合均匀，室温避光孵育 15 min，加入 400 滋L 1伊loading buffer混匀后使用流式细胞仪检测。1.10流式细胞仪检测细胞周期实验设置 Control 组、si-NC 组和 si-CENPM组，处理 48 h 后收集各组细胞，加入提前预冷的75%乙醇，4 益固定过夜，预冷 PBS 洗涤后每孔先加入 500 滋L预冷 PBS重悬，再加入 20 滋L RNase A轻混匀后 37 益水浴箱孵育 30 min，离心弃上清液，最后每孔加入 PI 染液 400 滋L，避光孵育 3060 min，上机检测。1.11统计学方法采用 Graphpad Prism 8.0 软件进行统计学分析。两组比较采用 t 检验，多组间比较采用单因素方差分析。P臆0.05 为差异有统计学意义。所有实验均重复 3 次以上。2结果2.1OCCC 组织病理改变HE 染色结果显示，与癌旁组织相比，OCCC组织中病灶为片状、巢状或腺泡状，能见细胞核异型，细胞质丰富，细胞核变大，核不规则，并可张玲，等.着丝粒蛋白M在卵巢透明细胞癌中表达及作用587窑窑宁夏医科大学学报4缘卷见核分裂像，见图 1。2.2OCCC 组织中 CENPM 的表达免疫组化结果显示，CENPM 在 OCCC 组织中表达升高，在癌旁组织中表达低或不表达（P0.01），见图 2。A.OCCC 癌旁组织；B.OCCC 组织。图 1HE 染色观察 OCCC 组织病理改变（HE400）A.免疫组织化学检测 CENPM 蛋白表达；B.CENPM 阳性面积柱状图；与癌旁组织比较*P0.01。图 2IHC 观察 OCCC 组织中的 CENPM 蛋白表达（IHC400）AB50 滋m50 滋m2.3转染 si-CENPM 的 ES2 细胞的敲低效率转染 si-CENPM#B 组 ES2 细胞 CENPM 蛋白表达较 si-NC 组降低（P0.01），见图 3。2.4敲减 CENPM 对 ES2 细胞增殖的影响在 72 h 时，与 Control 组和 si-NC 组比较，si-CENPM 组增殖能力下降（P均约0.001），见图4。2.5敲减 CENPM 表达对 ES2 细胞迁移的影响处理 24 h 后，与 Control 组和 si-NC 组比较，si-CENPM 组划痕愈合减慢（P约0.05），见图 5。2.6敲减 CENPM 对 ES2 细胞凋亡的影响在转染后 48 h，与 Control 组和 si-NC 组比较，si-CENPM 组细胞凋亡率上升（P 均约0.01），A.各组 ES2 细胞 CENPM 蛋白表达情况；B.各组 ES2 细胞 CENPM 蛋白表达柱状图；与 si-NC 组比较*P0.01。图 3蛋白质印迹法检测转染 si-CENPM 的 ES2 细胞中 CENPM 的表达ABCENPMGAPDH1.51.00.50.0*AOCCC 癌旁组织OCCC 组织B*50403020100OCCC 癌旁组织 OCCC 组织100 滋m100 滋m588窑窑6期见图 6。2.7敲减 CENPM 对 ES2 细胞周期的影响与 Control 组和 si-NC 组比较，si-CENPM 组在 S 期细胞百分比差异有统计学意义（P0.05），见图 7。3讨论相关研究表明，亚洲 OCCC 病例占亚洲 EOC病例的 13%28%，远高于西方国家 5%10%的发病率6-10。OC 目前的标准治疗方法为最高限度的肿瘤细胞减灭术和加铂类药物为基础的联合化疗11。标准治疗方法可使 OC 患者获得较好的与 Control 组和 si-NC 组比较*P0.001。图4CCK-8法检测敲减CENPM 对ES2细胞增殖的影响A.各组 ES2 细胞的迁移情况；B.处理 24 h 后，各组 ES2 细胞迁移能力比较；与 Control 组比较*P0.05；与 si-NC 组比较#P0.05。图 5划痕实验检测敲减 CENPM 对 ES2 细胞迁移的影响ABControl 组si-NC 组si-CENPM 组Control 组 si-NC 组 si-CENPM 组8060402000 h24 hControl 组si-NC 组si-CENPM 组2.52.01.51.00.50.0*时间/h244872*#张玲，等.着丝粒蛋白M在卵巢透明细胞癌中表达及作用缓解率，但易复发。又因 OCCC 是一种特殊 OC组织类型，在晚期诊断时预后差，目前没有针对OCCC 患者的特定治疗方式，而标准化疗法缓解率较低12-14。因此，要想提高 OCCC 的治疗水平，寻找重要的基因靶点仍是其突破点。CENPM 又称增殖相关核元件 1（prolifera原tion-related nuclear element 1，PANE1），可在小鼠乳腺上皮中检测到15，是 CENPA-NAC（核小体相关）复合物的组成部分，在着丝粒蛋白的组装、有丝分裂的过程中和细胞分裂的染色体分离中起着关键作用16。CENPM 不仅是细胞分裂过程中与微管相关的、调节染色体分离的着丝粒蛋白，还参与细胞周期的生物学功能17。细胞内 CENPM高表达导致染色体数量不相等，可能会在有丝分裂过程中导致染色体不平等地分离，从而加速肿瘤的发生和癌变。化疗药物的作用机制主要是通过作用于微管蛋白18，直接或间接破坏 DNA19，抑制蛋白质的合成20。CENPM 可能是化疗药物的潜在靶点，其主要功能为抑制微管蛋白的产生并促进其分解，抑制细胞有丝分裂，从而提高癌症的化疗敏感性。近年来，虽已有研究21表明CENPM和癌症的发生发展有关，但关于 CENPM 在 OCCC589窑窑宁夏医科大学学报4缘卷中的研究较少，本研究以此为切入点，首先通过HE 染色确定所选标本确为 OCCC 病理性改变，再通过免疫组化技术观察 CENPM 在 OCCC 及其癌旁组织中的表达。Xiao 等22的研究结果显示，CENPM 在肝癌组织中高表达。本研究结果也表明，OCCC 组织中 CENPM 的表达高于其癌旁组织，初步说明 CENPM 在 OCCC 的发生发展中起到了一定的作用。随后用 OCCC 细胞株 ES2 作为研究对象，后续成功将 CENPM-siRNA 转染到ES2 细胞中，有效抑制了 CENPM 在 ES2 细胞中的表达。Zheng 等5的研究结果证实，CENPM 的水平下调可以通过哺乳动物雷帕霉素靶基因/p70S6K 的途径控制胰腺癌细胞生长，从而调节细胞周期并控制胰腺癌细胞的迁移与侵袭。本研A.各组 ES2 细胞的周期情况；B.各组 ES2 细胞的周期百分比比较；与同期 Control 组比较*P0.05；与同期 si-NC 组比较#P0.05。图 7流式细胞术检测敲减 CENPM 对 ES2 细胞周期的影响*Control 组si-NC 组si-CENPM 组Control 组si-NC 组si-CENPM 组G0/G1SG2/M8060402001 0008006004002000ABFL2-A FL2 Propidium lodide-A050100150FL2-A FL2 Propidium lodide-AFL2-A FL2 Propidium lodide-A0 20 40 60 80 100 120 1400501001502001 2001 00080060040020006005004003002001000G0G1G2MS-PhaseG0G1G2MS-PhaseG0G1G2MS-PhaseA.各组 ES2 细胞的凋亡情况；B.转染后 48 h，各组 ES2 细胞的凋亡率比较；与 Control 组比较*P0.01；与 si-NC 组比较#P0.01。图 6流式细胞术检测敲减 CENPM 对 ES2 细胞凋亡的影响Control 组si-NC 组si-CENPM 组151050ABControl 组 si-NC 组si-CENPM 组*#Comp-FL2-A颐颐PE-AComp-FL2-A颐颐PE-AComp-FL2-A颐颐PE-A100103106109101210010310610910121001031061091012101210101081061041021001012101010810610410210010121010108106104102100Q11.07Q21.64Q496.7Q30.64Q11.46Q21.29Q496.4Q30.90Q12.66Q27.66Q487.6Q32.10#590窑窑6期究中 CCK-8、迁移实验结果显示，CENPM 的下调抑制了 ES2 细胞的增殖和迁移。此外，流式细胞术显示，敲减 CENPM 可促进 ES2 细胞凋亡，导致 ES2 细胞 S 期阻滞，与 Xiao 等22的研究结果类似。细胞凋亡又被称作程序性死亡，目前已知抗肿瘤药物就是通过这一机制发挥作用的，凋亡平衡被破坏可能是肿瘤发生的原因。结果表明，敲减 CENPM 可促进细胞凋亡，调控细胞周期，证实了 CENPM 在 OCCC 发生发展中的重要作用。综上所述，CENPM 在 OCCC 组织中高水平表达，敲减 CENPM 可抑制 OCCC 细胞 ES2 的生长、迁移，并促使其凋亡，引起细胞周期阻滞，为临床 OCCC 的防治提供了新的思路。参考文献：1 李艺，祝洪澜，昌晓红，等.初诊晚期上皮性卵巢癌的规范化治疗 J.现代妇产科进展，2020，29（10）：778-782，787.2 尹晶，黄敏丽，黄品同.超声诊断卵巢透明细胞癌J.实用肿瘤杂志，2021，36（5）：439-443.3 Wu ZH，Yang DL.High CENPM mRNA expression andits prognostic significance in hepatocellular carcino 原ma：a study based on data mining J.Cancer Cell Int，2020，20：406.4 Liu C，Wang Y，Dao Y，et al.Upregulation of CENPMfacilitates lung adenocarcinoma progression via PI3K/AKT/mTOR signaling pathway J.Acta Biochim Bio原phys Sin（Shanghai），2022，54（1）：99-112.5 Zheng C，Zhang T，Li D，et al.Upregulation of CENPMfacilitates tumor metastasis via the mTOR/p70S6K sig原naling pathway in pancreatic cancer J.Oncol Rep，2020，44（3）：1003-1012.6 Okamoto A，Glasspool RM，Mabuchi S，et al.Gyneco原logic Cancer InterGroup（GCIG）consensus review forclear cell carcinoma of the ovary J.Int J GynecolCancer，2014，24（9 suppl 3）：S20-S25.7 Yoshikawa H，Jimbo H，Okada S，et al.Prevalence ofendometriosis in ovarian cancer J.Gynecol Obstet In原vestig，2000，50（Suppl 1）：11-17.8 Sugiyama T，Okamoto A，Enomoto T，et al.Random原ized phase III trial of irinotecan plus cisplatin comparedwith paclitaxel plus carboplatin As first-line chemother原apy for ovarian clear cell 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6，12 and 24 h，and the expression level ofP62 decreased（P all0.05）；At the same time point compared with each group of C57BL/6J mouse macrophages，the expression levels of ATG5 and LC3 in each group of cells after HDAC6 knockout increased，Beclin1 in-creased first and then decreased，and P62 decreased（P all0.05）.ConclusionHDAC6 promotes rflaA to in-hibit macrophage autophagy in mice.HDAC6 may interfere with macrophage autophagy by affecting tubulinacetylation.Key words：legionella pneumophila；flagellin；histone deacetylase 6；autophagyExpression and Effects of Centromeric Protein M in Ovarian Clear CellCarcinoma TissuesZHANG Ling1，MA Xiaoxia1，ZHANG Fangwei1，ZHANG Yongmei2，LIANG Jinping1（1.School of Basic Medical Sciences，Ningxia Medical University，Yinchuan750004，China；2.Departmentof Gynecology，the First People s Hospital of Yinchuan，Yinchuan750001，China）Abstract：ObjectiveTo investigate the expression of centromere protein M（CENPM）in ovarian clear cellcarcinoma（OCCC）and the mechanism and effect on proliferation，migration，and apoptosis of ovarian clear cellcarcinoma ES2 cell line.MethodsHE staining was used to observe the histopathologic changes of OCCC.Theexpression of CENPM in OCCC and paracancer tissues was detected by immunohistochemistry.ES2 cell wastransfected with si-CENPM.The expression of CENPM protein was detected by western blotting.Cell prolifera-tion and migration were detected by CCK-8 assay and cell scratch assay.The effect of CENPM on apoptosis andcell cycle was evaluated by flow cytometry.ResultsCompared with paracancer tissue，CENPM was highly ex-pressed in OCCC tissue（P0.01）.The expression level of CENPM protein in ES2 cell transfected with si-CENPMwas decreased than that in the si-NC group（P0.01）.Compared with control group and si-NC group，the pro-liferation and migration ability of ES2 cells was significantly decreased after CENPM deletion（P all0.05）.Af-ter CENPM knockdown，ES2 cell apoptosis rate increased and ES2 cell cycle was blocked in S phase（Pall0.05）.ConclusionDown-regulating CENPM gene can inhibit the proliferation，migration，and apoptosisof human ovarian clear cell carcinoma ES2 cell line，suggesting that CENPM is involved in the development ofovarian clear cell carcinoma.Key words：centromere protein M；ovarian clear cell carcinoma；proliferation；apoptosis（上接第 580 页）592窑窑