脂质代谢相关基因在非酒精性脂肪肝实验猪中的研究进展.pdf

综述脂质代谢相关基因在非酒精性脂肪肝实验猪中的研究进展上海畜牧兽医通讯2 0 2 3年第3期马胜伟1，陈一帆，涂尾龙，蒋玮，朱丽慧1，吴潇1*（1上海市农业科学院，上海2 0 110 6；华中农业大学动物科学技术学院动物医学院，湖北武汉430 0 7 0）摘要：人类非酒精性脂肪肝病（non-alcoholicfattyliverdisease，NA FL D)患病率越来越高，该病主要表现为非酒精因素导致的肝脂质积累。有研究表明：参与脂质代谢的部分基因与肝内脂肪蓄积、脂肪变性等NAFLD的病理生理学特征相关。为了更好地利用实验猪模型研究人类NAFLD治疗方法，综述了近年来脂肪合成相关基因、脂质氧化相关基因、脂质转运相关基因等脂质代谢相关基因在实验猪上的研究进展，并介绍了小型猪NAFLD模型构建方法。关键词：非酒精性脂肪肝；非酒精性肝硬化；脂质代谢；猪；脂肪沉积；模型目前，由肝脏脂肪过度堆积造成的非酒精性脂肪肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NA FL D)已经成为威胁人类健康的全球性疾病之一，全球患病率约为2 5%，并且患者越来越低龄化 1。然而，因尚不清楚NAFLD形成机制，目前还没有治疗NAFLD的特效药。有研究发现：NAFLD的形成与肝脏脂质代谢的重编程有关，由控制肝脏代谢的相关基因表达失控所致；调控基因表达的表观遗传机制的改变与肝部脂质代谢紊乱密切相关,其中脂质代谢相关基因对 NAFLD的形成有重要影响 2 。目前，主要利用小鼠和大鼠建立动物模型来进行NAFLD研究，但是由于小鼠、大鼠与人之间的物种差异较大,相关研究成果运用到人类NAFLD临床研究和治疗中进展缓慢。在基因组上，猪与人的相似度接近84%3；实验用小型猪因体型小，生理生化指标及组织器官与人类相似，被广泛应用在医学临床以及生命科学等多个研究领域 4。小型猪是研究人类疾病的理想模式动物,如瘦素(Leptin)双等位基因敲除猪模型 5、载脂蛋白E基因（Apolipoprotein Egene，A p o E）敲除小型猪模型C6)、黑色素皮质素受体4（Melanocortin 4receptor，M C4R)双等位基因敲除小型猪模型 7 等的研究结果为人类疾病研究与治疗提供了丰富信息和新思路。笔者主要概括与脂肪合成、脂肪氧化、脂质转运以及极低密度脂蛋白（verylowdensitylipoprotein，VLDL)合成分泌密切相关的基因在调控NAFLD发生、发展中的重要机制，进一步阐释这些相关基因在实验猪上的研究进展，总结小型猪NAFLD模型构建方法，以期为研究人类NAFLD的发病机制及治疗方法提供参考。1脂质代谢相关基因在实验猪上的研究进展影响人类患NAFLD风险的大部分基因固醇（激素）调节元件结合蛋白基因（sterol regulatoryelement-binding protein gene，SRE BP）、过氧化物酶体增殖物激活受体基因（peroxisome proliferator-activated receptor gene，PPA R）、二酰基甘油酰基转移酶基因（diacylglycerol acetyltransferase 2gene，DGAT2）、p a t a t i n 样磷脂酶结构域 3 基因（patatin-like phospholipase domain containing 3 gene,PNPLA3）、解耦联蛋白基因（uncoupling protein gene，U CP）、乙醛脱氢酶2 基因（aldehyde dehydrogenase基金项目：优质猪肉评价体系研究及相关分子标记筛选与解析（2 0 2 1-0 2-0 8-0 0-12-F00768）；沪农科卓（2 0 2 2)0 16 农业生物安全评价研究团队B作者简介：马胜伟（19 9 8 一），女，在读硕士，主要从事猪遗传育种研究。*通信作者，E-mail:45综述2gene，A L D H 2）、脂肪酸转运蛋白基因（fatty acid transport protein geneFATP）、脂肪酸转位酶基因(fatty acid translocase gene，FA T/CD 36）、脂肪酸结合蛋白基因(fatty acid binding proteins gene，FA BP)、微粒体甘油三酯转运蛋白基因（microsomal triglyceride transfer protein gene，M T T P）、载脂蛋白基因（apolipoproteingene，A p o)等在模型猪中均有研究，且发现这些基因的表达水平会影响脂肪沉积(表1)。基因SREBPPPARDGAT2PNPLA3UCPALDH2磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶基因(phosphatidylethano-lamine N-mathyl-transferase gene,PEMT)FATPFAT/CD36FABPMTTPApo跨膜6 超家族成员2 基因（trans-membrane6superfamilymember2与VLDL分泌有关gene,TM6SF2)脂肪量和肥胖相关基因（fatmassand obesity associated gene,FTO)G蛋白偶联受体基因（G-proteingene coupled receptorgene,GPR)Leptin上海畜牧兽医通讯2 0 2 3年第3期表1脂质代谢相关基因调控人NAFLD及猪脂肪沉积的机制对人NAFLD的调控促进脂肪酸合成与甘油三酯积累PPAR阻止肝脏脂肪变性；PPAR抑制脂肪生成；PPAR使脂肪特异性表达量与肌内脂肪含量呈正相关缺乏，导致肝脏脂肪堆积在瘦肉型猪中表达量较低，与背骠催化甘油三酯合成厚和瘦肉率相关降低PNPLA3mRNA表达，可减轻PNPLA3促进肌内脂肪和背最长阻止肝脏脂肪变性UCP3影响脂肪沉积性状及肉质性UCP2促进脂肪酸氧化及脂肪酸转状;UCP1敲入转基因猪的瘦肉率运至线粒体，减少脂质蓄积增加ALDH2的活化可以减轻非酒精性脂ALDH2与皮下脂肪沉积相关肪性肝炎的发展肝脏病变时，PEMT活性降低，促使脂肪肝形成过表达促进对脂肪酸的摄取，加重NAFLD在肥胖和NAFLD患者体内高表达，肝脏中CD36显著上调，不会导致促进脂肪在细胞内过度沉积L-FABP高表达促进甘油三酯及磷脂的合成，L-FABP的缺失会引起脂肪酸氧化能力下降干涉肝脏甘油三酯变为VLDL，将脂肪从肝脏转运出ApoA5促进甘油三酯水解，ApoC3抑制脂蛋白脂肪酶活性和机体对甘油三酯的摄取在NAFLD患者和模型动物的肝脏中FTO多态性与猪肌内脂肪沉积、肉表达量较高GPR41、G PR42、G PR2 0 和 GPR120与肝细胞脂质代谢相关，影响代谢疾在背最长肌中几乎不表达病的发生 9rs1137100、r s 1137 10 1变异增加惠NAFLD风险对猪脂肪沉积的调控SREBP-3cmRNA表达量与肌内脂肪含量呈正相关肌脂肪沉积，促进肝脏脂肪代谢FATP1与肌内脂肪沉积呈正相关肝脂肪变性的发展 8 FABP表达量与肌内脂肪含量呈正相关MTTP与猪脂肪和脂肪酸含量相关表达量在脂肪型猪中较高，且在不同猪种中随年龄增长的变化趋势有差异质性状、生长性状关联可能与猪骨骼肌肉嫩度有关小型猪模型GIPRdn、h I A PP、PNPL A 3I148M三重转基因猪/ApoE敲除巴马香猪模型Leptin敲除中国实验用小型猪46综述基因脂联素基因（adiponectingene，ADIPOQ)葡萄糖激酶调节蛋白基因（glucosekinase regulatory proteins gene,GCKR)Tribbles同源蛋白1基因（tribblesrs2954029与脂肪合成相关，增加患pseudokinase 1 gene,TRIBl)Kruppel样因子6 基因（kruppel-rs3750861抑制NAFLD发生，影响肝组like factor 6gene,KLF6)游离态2 5-羟维生素D基因（vita-rs222054、r s 7 0 41、r s 458 8 增加患min D binding protein gene,DBP）NA FL D 风险超氧化物歧化酶2 基因（superoxiders4880变异增加患NAFLD、I I 型糖dismutase 2 gene,SOD2)蛋白磷酸酶1调节亚基3B(proteinphosphatase1，r e g u la t o r y s u b u n it PPP1R3B变异增加患NAFLD风险SNP与肉色、pH等肉质性状相关3B,PPP1R3B)羊毛围醇合成酶基因(lanosterol LSS 功能缺失抑制 NAFLD 发生、/synthase gene,LSs)MC4R注：“/表示无相关信息。1.1 脂肪合成相关基因与瘦肉型猪种长白猪相比，肌内脂肪含量较高的地方猪种乌金猪的SREBP-1c基因mRNA相对表达量更高，并且表达量与肌内脂肪含量呈正相关 12 。用高脂饲料饲喂杜长大(杜洛克长白猪大白猪)三元杂交猪3个月，杂交猪体脂含量大幅增加，背组织中DGAT2、SRE BP-1c 和FABP4以及肝脏组织中DGAT2和SREBP-1c的相对表达量显著升高，背骠组织中PPAR的相对表达量降低。这些都说明：SREBP-1c基因可能促进猪肌内脂肪沉积，可作为肉质改良的候选基因。将瘦肉型猪用作研究高脂饮食导致肥胖的模型，可为研究代谢性疾病提供新工具 13。PPAR基因的表达量与猪肌内脂肪含量呈正相关 14。在大白猪中，PPAR基因在肝脏中高表达，PPAR基因在脂肪组织中高表达 15。GU等 16 利用CRISPR/Cas9转基因克隆技术编辑了2 头PPAR的肌肉特异性过表达的猪模型，发现PPAR模型猪的肌内脂肪含量显著高于非编辑猪，而瘦肉率与非编辑猪相近；PPAR可以激活脂肪细胞分化调节因子并促进调节因子表达，从而促进脂肪细胞分化以及脂肪沉积；骨骼肌特异性超表达PPAR，可以促进猪肌内脂肪沉积。增强PPAR、PPA R基因的表达可增加猪肌内脂肪含量，提升猪肉品质。DGAT2基因对于猪脂肪沉积具有重要意义。初生莱芜猪的DGAT2基因表达量低于同日龄的杜洛克猪，但莱芜猪成年后的DGAT2基因表达量高于杜洛克猪；陆川猪背最长肌中DGAT2基因相对表达量高于同日龄的杜长大三元杂交猪 17 ，推测DGAT2基因的表达与脂肪沉积能力有一定的相关性。1.2脂质氧化相关基因研究证实：FABP3基因在巴克夏猪和济州岛本地猪中的表达水平比较低，但在2 个猪种中,FABP3基因的表达水平与肌内脂肪含量呈正相关;FABP3 基因对于猪背最长肌中的脂肪沉积很重要 18 。PNPLA3基因突变会影响肝脏脂质代谢 19 ,与济州岛本地猪相比，巴克夏猪PNPLA3基因显著高表达,PNPLA3基因在猪肌肉和肝脏的脂质代谢中都发挥作用。这些研究为构建猪NAFLD模型奠定了基础。上海畜牧兽医通讯2对人NAFLD的调控对猪脂肪沉积的调控通过调节肝细胞氧化应激减轻在瘦肉型猪肝脏组织中的表达量低NAFLD损伤rs1260326、r s 7 8 0 0 9 4变异增加惠NAFLD风险NAFLD风险脏纤维化进程尿病风险发展rs17782313纯合突变基因型的人更容具有减缓生长速度和降低躺体瘦肉易患肥胖症 10 2023年第3期续表小型猪模型于长白猪与猪的脂肪性状无明显相关与臀中肌饱和脂肪酸含量相关细胞中，KLF6可以增强脂肪的启动子活性并上调其mRNA表达与猪身体构造特征相关率作用 1147/MC4R双敲除模型综述DAMON等 2 0 1证明：在不表达UCP1的幼猪中,UCP3mRNA的表达量较低，但UCP2mRNA在肌肉和脂肪组织中均有表达。UCP2在新生仔猪的肺部高表达,UCP3在新生仔猪颈部的脂肪组织和肌肉组织中高表达 2 1。UCP3基因的表达量与眼肌面积呈显著负相关，与肌内脂肪含量呈显著正相关；与江口萝卜猪肉质性状相关的UCP3基因的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）位点主要为g.10439CT、g.10 441CA、g.10 46 6 G A 和g.10479AG/T,UCP3基因表达量可调控肌内脂肪沉积 2 2 。利用CRISPR/Cas9等技术构建的UCP1定点敲人转基因猪较非转基因猪，瘦肉率较高，背厚度较薄。UCP1基因减少脂肪沉积的途径是促进脂肪水解 2 3。可见,UCP3高表达可提高肌内脂肪含量,UCP1高表达可提高猪瘦肉率。有研究使用高通量测序技术检测太湖猪和长白猪脂肪组织的基因表达谱，发现ALDH2参与调控皮下脂肪沉积 2 41，但该基因在肝脏脂肪沉积中的作用未见报道。1.3脂质转运相关基因FATP1基因在荣昌猪的肌肉、脂肪和肝脏中表达水平较高，并且在肌肉中的表达水平随着新生仔猪的生长逐渐升高,FATP1基因的表达水平与猪肌内脂肪沉积量显著正相关 2 5。猪肌内前脂肪细胞过表达pFATP1可显著促进猪肌内前脂肪细胞增殖,并显著上调PPAR、脂蛋白脂肪酶、脂肪酸合成酶和围脂滴蛋白1的表达，肌内前脂肪细胞过表达pFATP1可显著增加脂肪堆积，pFATP1在猪肌内前脂肪细胞的增殖和分化中发挥重要作用 2 6 FABP家族在各物种间保守性较高，然而FABP3在我国地方品种猪中存在集体丢失现象，这可能与人工驯化选择密切相关。FABP3的生物学功能可能与猪生长效率或特定部位脂肪分布有一定相关性 2 7 。猪FABP4的起始密码子上游3kb片段具有脂肪组织特异启动子活性，可以用于构建脂肪组织特异性基因修饰猪 2 8 。研究发现：在大河乌猪和长白猪中，脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白基因（adipocyte fatty acid-bindingprotein gene，A-FA BP)第1内含子均存在SNP位点;BC基因型肌内脂肪含量低,BD或CC基因型肌内脂肪含量高 2 9 。藏猪背脂肪、背最长肌和肝脏组织中心脏型脂肪酸结合蛋白基因（heart fatty acid-bindingproteingene，H-FA BP）的mRNA和蛋白水平表达均显著高于大白猪，C-1375G位点可能具有调控H-FABP基因(与猪脂肪沉积有关的)表达的作用 30 11.4VLDL合成分泌相关基因广西巴马小型猪ApoAl 基因的保守性很强 31,ApoAl、A p o C3、A p o E 基因在脂肪型猪肝脏中表达量最高 32 。巴马小型猪和大白猪肝脏组织ApoC2基因mRNA发育性变化趋势存在差异，ApoC2基因表达水平可能对猪脂质代谢有重要影响 33。MTTP的基因多态性位点与脂肪组织和猪肉中的脂肪酸浓度相关,H-FABP的多态性仅与脂肪组织中脂肪酸含量存在相关性 342猪NAFLD模型构建与啮齿动物相比，小型猪不仅基因序列与人类同源性较高，生理结构和代谢特点也与人类比较接近，且易于饲养管理。因此，建立小型猪NAFLD模型对于研究人类NAFLD具有重要意义。小型猪NAFLD模型主要有饮食诱导类和基因缺陷类。2.1饮食诱导类饮食诱导类NAFLD模型是通过饲喂高脂饲料，导致小型猪肝脏脂肪变性，从而模拟NAFLD的一些生理学和病理学变化。LEE等 35 用高脂饲料喂养小型猪奥萨博岛猪2 4周，建立了第1个由饮食诱导引起的脂肪性肝炎的大动物模型，该模型表现与人类NAFLD代谢综合征非常接近的特征。上海畜牧兽医通讯2 0 2 3年第3期48综述给伊比利亚幼猪饲喂高果糖、高脂肪饲料10 周，其肌肉组织的总甘油三酯含量较对照组增加，但肌细胞内脂质含量降低；高果糖、高脂肪饮食的伊比利亚幼猪会产生较少的氧化骨骼肌表型，并降低脂质作为燃料的能力 36 。这为研究儿童因摄入高热量饮食而导致NAFLD提供了良好的模型。给哥廷根小型猪饲喂高脂肪、高果糖、高胆固醇饮食13个月，小型猪肝脏发生了纤维化、炎症反应和细胞质改变，小型猪存在明显的肥胖和血脂异常表现,NAFLD哥延根小型猪已经被用作研究人类NAFLD的模型37。然而，具有与人类相关的关键组织病理学特征的成功模型有限，限制了该模型在临床研究中的使用。2.2基因缺陷类基因缺陷类猪模型多用于心血管疾病、糖尿病和肥胖等疾病研究，而在非酒精性脂肪肝领域研究中应用较少 38-39 利用锌指核酸酶基因编辑技术，对中国实验用小型猪进行Leptin基因敲除，小型猪从12 月龄开始，陆续出现脂肪肝、非酒精性肝炎和肝纤维化病理表型，Leptin敲除中国实验用小型猪与肥胖人群的非酒精性肝损伤发展模式相符 40。利用CRISPR/Cas9基因编辑等技术敲除小型猪ApoE基因，新生仔猪肝脏胆固醇和甘油三酯含量高于野生型，脂肪酸酶表达水平却较低，导致肝脏内脂质不断积累。敲除ApoE小型猪为研究脂质代谢与ApoE的关系提供了理想模型。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建MC4R双等位基因敲除小型猪模型，小型猪表现出胰岛素抵抗，在没有高脂饮食的情况下表现出肥胖和肝脂肪变性，且出现肝脏脂肪变性表型的时间早于小鼠。3展望本文从脂质代谢的脂肪合成、脂质氧化、脂质转运和VLDL合成分泌4个途径综述了相关基因对NAFLD的影响，概括了相关基因在猪脂肪沉积中的作用，并介绍了利用小型猪模型研究人类NAFLD的案例。随着脂质代谢基因与NAFLD间的作用进一步被揭示，脂质代谢相关基因有望成为NAFLD疾病诊断的标志以及临床治疗的靶点。很多与NAFLD易感性相关的基因也与猪脂肪沉积相关，但大部分脂质代谢相关基因尚未在小型猪上进行研究。未来,研究NAFLD易感基因与小型猪脂肪沉积及脂肪肝的相关性、构建适宜的小型猪NAFLD模型或将成为热点，这对NAFLD的形成机制研究、临床治疗以及药物开发利用有着重要意义。上海畜牧兽医通讯2 0 2 3年第3期参考文献1J WANG X J,MALHI H.Nonalcoholic fatty liver diseaseLJJ.Annals of Internal Medicine,2018,169(9):ITC65-ITC80.2徐安癌基因Kras在非酒精性脂肪性肝病及其向肝癌转化中的作用与机制研究 D上海：第二军医大学，2 0 17.3J FANG X,MOU Y,HUANG Z,et al.The sequence and analysis of a Chinese pig genomeJJ.Gigascience,2012,15(1):16.4涂尾龙，吴潇，王洪洋，等实验用小型猪的品种资源概况及其应用研究进展 J上海畜牧兽医通讯，2 0 2 2（4)：1-10.5J TAN T,XING Y,HU X,et al.Generation 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