一种可以应用于脂滴成像的希夫碱类衍生物.pdf

基础研究272BME&Clin Med,May 2023,Vol.27,No.3生物医学工程与临床2 0 2 3年5月第2 7 卷第3期网络出版时间：2 0 2 3-0 4-2 10 9：35：30D0I:10.13339/ki.sglc.20230420.009网络出版地址：https： 0%水合肼反应得S2，之后进一步与1-比甲醛反应得到脂滴探针分子希夫碱类的衍生物BPD。测量BPD核磁共振氢谱（H-NMR）、光物理特性和pH依赖性。将探针BPD制成纳米颗粒，与Hela细胞共培养，进行细胞毒性实验。结果探针的光物理特征表明在疏水性溶剂中有很强的溶剂致变色行为，较大的斯托克斯位移（约7 0 nm）和较高的荧光量子产率（0.34）。探针BPD在从52 0 nm（非极性溶剂正已烷）到59 0 nm（极性溶剂水）上表现出较大的荧光发射红移（约7 0 nm)并且伴随着明显的颜色变化（绿色到橙色）。探针于1,4-二氧六环中在宽的pH5.09.0内都是稳定的。另外，该荧光团在细胞中表现出无毒的特征和高的信噪比。结论该衍生物成为研究脂质生物学和病理学的极佳候选者。关键词：希夫碱类衍生物；荧光探针；脂滴；生物成像；荧光增强中图分类号：0 6 57.3；R318.08文献标识码：A文章编号：10 0 9-7 0 9 0（2 0 2 3）0 3-0 2 7 2-0 7A derivative of Schiff base used for lipid droplet imagingCHENG Wen-jing,ZHANG Yu,WANG Lin,ZHENShuai,HU Leil(l.Medical Genetics Center,Northwest Womens and Childrens Hospital,Xian710061,Shaanxi,China;2.Department of Blood Transfusion,the First Afiliated Hospital of Xian Jiaotong University,Xian710061,Shaanxi,China)Corresponding author:HU Lei.E-mail:.Abstract:Objective To study related physical,chemical and biological characteristics of Schiff base derivatives,base onthe consideration that changes in lipid metabolism and abnormal storage of lipids in cells are known to be associated with avariety of diseases(including obesity,hyperlipidemia,inflammation,atherosclerosis and even cancers such as hepatocellularcarcinoma),and the study of lipid accumulation and formation by specific fluorescent probes has aroused great interest instudying the pathological processes related to abnormal lipid metabolism.Methods Firstly,the probe molecule S1 was syn-thesized from 4-bromo-1,8-dinaphthalic anhydride and propylamine in anhydrous ethanol solvent,then S1 was reacted withexcessive 80%hydrazine hydrate to obtain S2,and later reacted with 1-formaldehyde to obtain lipid droplet probe moleculespyrene Schiff base derivative 1-pyrenecarboxaldehyde,2-(2,3-dihydro-1,3-dioxo-2-propyl-6-yl)hydrazone(BPD).BPD nu-clear magnetic resonance H spectrum(H-NMR),photophysical properties and pH dependence were measured.The probe BPDwas made into nanoparticles and co-cultured with Hela cells for cytotoxicity experiments.Results The photophysical charac-terization of the probe showed strong solvochromic behavior in hydrophobic solvents with large Stokes shift(about 70 nm)andhigh fluorescence quantum yield(0.34).The probe BPD showed the large fluorescence emission red-shifted(about 70 nm)andobvious color change(green to orange)from 520 nm(non-polar solvent n-hexane)to 590 nm(polar solvent water).The probe wasstable in 1,4-dioxane at pH 5.0-9.0.In addition,the fluorophore exhibited non-toxic characteristics and high signal-to-noiseratio in cells.Conclusion It is demonstrated that the derivative is an excellent alternative for studying lipid biology and pathol-ogy.Key words:Schiff base derivatives;fluorescent probes;lipid droplets;bioimaging;fluorescence enhancement脂滴是真菌、植物和动物体内普遍存在的富含脂质的细胞器，在多种生物过程中起着至关重要的作用。细胞内脂质小滴(lipiddroplets,LD)是富含脂质的球形细胞器，它是内质网（endoplasmicreticulum，ER）衍生的细胞器，主要由甘油三酯和胆固醇酯组成，并被磷脂单分子膜和相关蛋白包围，使它们与所作者单位：1.西北妇女儿童医院医学遗传中心，陕西西安7 10 0 6 1;2.西安交通大学第一附属医院输血科，陕西西安7 10 0 6 1作者简介：程文静（19 8 8），女，陕西西安市人，本科，主管技师，主要从事检验遗传研究。电话：159 9 16 9 6 18 5。E-mail：w e n 12 3456 0 7 14 12 6.c o m。通信作者：呼蕾（19 8 7 一），女，陕西西安市人，本科，主管技师，主要从事临床检验工作。电话：159 9 16 9 6 18 5。E-mail：x s 17 i 5 16 3.c o m。版权保护，不得翻录。BME&ClinMed,Mav2023.Vol.27.No.3生物医学工程与临床2 0 2 3年5月第2 7 卷第3期有其他细胞器区分开，被认为是用于能量存储的惰性储存库2。LD是具有生命力的动态物体,其具有必要的细胞分配功能，包括膜运输、融合和参与信号转导通路。最近的证据表明,LD和许多生理过程都与脂质代谢、信号转导及细胞调亡有关3。近年来人们对LD产生了极大的兴趣。LD的异常蓄积与肥胖、高脂血症、肝囊肿、动脉粥样硬化和肾癌等癌症有关4。此外，LD还与炎症和传染病有关5。据报道,LD参与了各类病原体的传染病发病机制，如病毒、细菌7、真菌8 原生生物9,这表明LD参与宿主对感染的先天性和适应性免疫反应。宿主LD也可能被利用作为病原体逃避免疫系统适应的一部分，并作为细胞内病原体的能量来源10.1。因此,准确监测LD对分析其生物代谢至关重要，有助于诊断相关早期疾病脂滴的固有环境是亲脂性的。据此判断具有高疏水性的亲脂性有机染料可能具有潜在的脂滴染色能力。带受体-供体的有机染料通过引人大杂环来增加受体的吸电子能力，得到的有机染料通常表现出更红的荧光、更高的疏水性和更大的双光子吸收截面,但细胞穿透性较低。因此应调整疏水性和细胞渗透性之间的平衡。然而实现这一目标的空间非常有限。另一方面，基于二萘酰亚胺的供体-受体分子已被证明是活体细胞荧光检测和生物成像的优异探针12 。通过引人二萘酰亚胺的受体单元，笔者合成了一个新的基于芘的希夫碱类脂滴荧光探针1氢-苯并异喹啉衍生物1-pyrenecarboxaldehyde,2-(2,3-dihy-dro-1,3-dioxo-2-propyl-6-yl)hydrazone,BPD,用于活细胞中的脂滴可视化并实现了对脂滴的可视化成像，为实时检测脂滴动态水平提供了一种可行的方案。1材料与方法1.1实验材料与仪器1.1.1实验材料4-溴-1,8-萘二甲酸酐、正丙胺、8 0%水合肼、1-甲醛、冰醋酸、无水乙醇、甲醇、二氯甲烷（分析纯。富宇化工，中国）、普朗克12 7（中国阿拉丁试剂公司）。1.1.2实验仪器V-550紫外可见分光光度计（SHIMADZU岛津公司，日本）；F-4700荧光光谱仪（日立公司，中国）；FM4积分球；MercuryPlus-400核磁共振光谱仪(Bruker布鲁克公司，瑞士）；WATERSI-ClassVIONIMSQTof质谱仪（沃特世科技公司，美国）；NikonA1MP（尼康公司，日本）；12 0 kV投射电子显微镜（赛默飞科技公司，美国）。1.2方法1.2.1探针分子的合成方法探针分子的合成分为三步。首先以4-溴-1,8-二萘酸酐和丙胺为原料在无水乙醇溶剂中合成S1，然后将S1与过量的8 0%水合肼反应得S2，之后进一步与1-比甲醛反应得到脂滴探针分子芘希夫碱类的衍生物BPD。合成路线如图1。H2NH.NH2EtOHBrBrHNNH2HNNS1S2BPD图1探针BPD的合成路线Fig.1Diagram of synthetic route of probe BPD1.2.1.14-溴-N-丙基-1,8-萘二甲酰亚胺(S1)的合成分别称取110 8 mg的4-溴-1,8-萘二甲酸酐(4mmol)和2 36 mg正丙胺（4mmol)，置于2 0 mL甲醇溶液中，于氮气氛围下剧烈搅拌升温于8 5，随着反应的进行，体系颜色由浅黄色变为浅棕色。持续反应8 h后，将整个体系冷却至室温，有浅棕色固体析出、过滤，用冰甲醇溶液反复洗涤3次，然后放人温度设置为40 的真空干燥箱中干燥，得到粗产物4-溴-N-丙基-1,8-萘二甲酰亚胺,即S1。1.2.1.26-肼基-2-丙基-1H-苯并异喹啉-1,3-(2 H)-二酮(S2)的合成将312 mg4-溴-N-丙基-1,8-萘二甲酰亚胺溶液（0.8 mmol)置于圆底烧瓶中，加入15mL甲醇溶液，之后滴加1.5 2.0 mL80%水合肼溶液（大大过量）于圆底烧瓶中，于下剧烈搅拌下回流过夜；随着反应的进行，体系颜色由浅棕色逐渐变为橙色，反应完成后，倒人10 0 mL冰水中，有大量沉淀析出，过滤，用冰水反复洗涤3 5次，于真空干燥箱干燥后得粗产物，经真空干燥后得到目标产物6-肼基-2-丙基-1H-苯并异喹啉-1,3-(2 H)-二酮,即 S2。1.2.1.3芘希夫碱类的衍生物BPD的合成将2 40 mg6-肼基-2-丙基-1H-苯并异喹啉-1,3-(2 H)-二酮(0.5mmol)和115mg1-芘甲醛(0.5mmol)置于盛有274-BME&ClinMed,May2023,Vol.27,No.3生物医学工程与临床2 0 2 3年5月第2 7 卷第3期10mL的圆底烧瓶中,加人1滴冰醋酸溶液，回流反应5h；冷却至室温后析出大量红橙色沉淀，过滤，于真空干燥箱中干燥后得到红橙色固体，用甲醇溶液进行重结晶最终得到目标产物，即芘希夫碱类的衍生物BPD1.2.2结构表征方法用MercuryPlus-400核磁共振光谱仪测量化合物的核磁共振氢谱(nuclear magnetic resonance H spec-trum，H-NM R）;F-47 0 0 荧光光谱仪用于测试荧光光谱；FM4积分球用于测试荧光量子产率；WATERSI-ClassVIONIMSQTof质谱仪用于测试高分辨质谱。1.2.2.1荧光光谱测试式称取目标分子2.4mg，转移至干燥的容量瓶中。用二甲基亚砜（dimethyl sulfox-ide,DMSO)定容至5mL,得到浓度为10-3mol/L的探针分子母液。荧光光谱测量时激发和发射狭缝均为2.5nm，激发波长38 0 nm，在不同溶剂的发射波长为510 600 nm。1.2.2.2光物理特性和pH依赖性测试研究 BPD在DMSO、乙腈、丙酮四氢喃甲苯正已烷常用溶剂中的光物理特征（V-550紫外可见分光光度计）。为了在生理环境中监视细胞中的脂滴，探针应在较宽的pH范围内保持稳定性。因此,分别测量了在各种pH环境下的BPD的荧光光谱。通过荧光强度变化来表征探针的稳定性。1.2.3探针BPD-纳米颗粒的制备和测量为了使其具有水溶性，将10 mg探针BPD溶于10mL四氢呋喃中，加人8 0 mg普朗克F127（一种两亲性聚合物），超声溶解后，迅速倒人10 0 mL去离子水中，搅拌12 h，待有机溶剂挥发后，得到水溶性的BPD纳米颗粒（nano-particles,NP），使用超滤离心管浓缩至10 mol/L。对其进行动态光散射（dynamiclight scattering,DLS）测试，使用透射电子显微镜(transmission electron microscopy,TEM)进行测试。1.2.4选择性测试和细胞实验V-550紫外可见分光光度计用于测试吸收光谱；徕卡共聚焦显微镜（德国，SP8DIVE)用来进行共聚焦成像实验。通过测试光密度，研究底物F-、C I-、Br、I-、C N-、CO.-、NO 2*、PO 3-、SC N-、SO 2-、C IO-、H 2 0 2、SO 2-、A 13+Ca2+、C o 2+、C r 2+、C u 2+、Fe 3+、H g 2+、M g 2+、Ni t、Zn 2+、循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA）、半胱氨酸（Cys-teine,Cys）谷胱甘肽（Glutathione,GSH）、同型半胱氨酸（hyperhomocysteinemia,Hcy）、牛血清蛋白（bovineserum albumin,BSA）、总胆固醇(total cholesterol,TC)、葡萄糖（glucose)对BPD荧光特性的研究。荧光强度与对照组无太大变化，则说明研究底物对探针无识别干扰。使用共聚焦显微镜进行了生物成像，BPD探针孵育Hela细胞30 min，反复洗涤3次后，放置于共聚焦显微镜下成像，采用四甲基偶氮唑盐（methylthia-zolyltetrazolium，M T T）进行探针BPD的细胞毒性测试。1.3统计学方法采用SPSS20.0软件进行统计学分析。计量资料用均数标准差表示，两组比较行t检验。P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1目标分子的结构表征BPD分子的核磁共振峰提示结构为 H-NMR(400 MHz,DMS0-d6),8:0.90(t,J=8.2,3H),1.95(m,2H),3.89(t,J=8.4,2H),7.88(m,2H),8.22(t,J=8.2,1H),8.33(t,J=12.0,2H),8.39(m,5H),8.42(d,J=12.0,1H),8.49(d,J=8.0,1H),8.73(t,J=8.4,2H),8.85(d,J=8.4,1H),11.69(s,1H)。M S(m a s s m lz):482.1794M+H*。见图2。2.2探针BPD的理论计算通过Gaussian09研究了BPD在水中的理论计算基组为B3LYP/6-31G(d,p)。如图3所示,最高占据分子轨道(highest occupied molecular orbital,HO-MO）和最低占据分子轨道（lowestunoccupiedmolecu-larorbital,LOMO）状态下的能量为负值（分别为-2.34eV、-5.46 e V）,表明探针是稳定的。计算得到的理论偶极矩为10.49 D。此外，能隙为3.12 eV,这意味着探针具有高的稳定性和高的化学硬度。探针在水中的荧光很弱，可能归因于水分子进攻分子的受体部分；此外,芘基团与1,8-二萘酸酐基团之间存在较大的二面角,这二者导致了分子在水中的荧光很弱。2.3探针BPD的光物理性质探针在不同有机溶剂中的紫外吸收光谱和荧光光谱表明，随着溶剂极性的增加，探针BPD显示出明显的荧光峰红移（表1)。探针BPD在从52 0 nm(非极性溶剂正已烷）到59 0 nm（极性溶剂水）上表现出较大的荧光发射红移（约7 0 nm）（图4a）并且伴随着明显的颜色变化（绿色到橙色）。此外，探针BPD在纯水中荧光发射微弱，而荧光强度随着1,4-二氧六环比例的增加而逐渐增高,并伴随着明显的蓝移最大发射从59 0 nm（水）到530 nm（1,4-二氧六环）,这是由于分子内的电荷转移作用（图4b）。探针在1,4-二氧六环中表现出强荧光,并且荧光强度与在水中相比提高了约418 倍，测试得到的荧光量子产率为0.34。探针BME&ClinMed,Mav2023.Vol.27.No.3生物医学工程与临床2 0 2 3年5月第2 7 卷第3期880.10二8433一0.090.080.070.06HNN0.0510.040.030.020.010542i2311.511.010.510.09.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.50f1/ppm图2BPD探针的氢谱Fig.2Diagram of hydrogen spectrum of probeE=3.12 e VHOMOLOMO-2.34 eV-5.46 eV图3BPD的理论计算Fig.3Diagrams of theoretical calculation of BPD的这种在低极性溶剂中的高亲脂性性质和高荧光发射性质为其在LD成像中的应用提供了可能性，表1探针在不同溶剂中的光物理性质Tab.1Photophysical properties of probes in different solvents溶剂入mals/nm8/10/(Mcm)Mmluo/nmDMSO4904.15582乙睛4853.87572丙酮4753.80555四氢呋喃4754.01548甲苯4753.89535正已烷3600.815182.4探针BPD-纳米颗粒大小水溶性的BPD-NPDLS测试，其粒径大致为80.28nm。T EM 观察,其形貌为圆型颗粒。见图5。2.5探针BPD的pH依赖性测试探针于1,4-二氧六环中在宽的pH5.09.0内都是稳定的。这表明BPD在检测LD于细胞中的生物学应用方面具有很大的潜力。见图6。2.6探针BPD的选择性测试荧光探针在复杂的生物系统中应具有良好的选择性,因此检测了各种分析物对BPD荧光特性的影响。在38 0 nm激发后，其他物质对BPD在530 nm处的荧光几乎没有干扰（图7）。表明该探针对这些分析物呈情性（分析底物分别为F-、C I-、Br、I-、CN-、C O?-、NO 2-、PO?-、SC N-、SO 2-、C 1O-、H O 2、SO2-、A 13+、C a 2+、C o 2+、C r 2+、C u 2+、Fe 3+、H g 2+、M g 2+、Ni+、Zn?+、c t D NA、C y s、C SH、H c y、BSA、T C、g l u c o s e)。这种结构的探针通常会对F-有特异性的识别，即使在荧光下,BPD对F-也有任何荧光信号的变化，表现为情性。2.7探针BPD的细胞毒性结果及在Hela细胞中的成像探针BPD对细胞的毒性测试十分重要，是判断探针能否正常发挥功能的标准之一，通过MTT分析探针BPD在HeLa细胞中对细胞的毒性。与探针(O30mol/L)孵育2 4h后，细胞的存活率高于9 0%。证proportions()380 nm)and fluorescence spectrum of probe in mixture with water(b)Fig.4Normalized fluorescence spectra of probes(10 mol/L)in organic solvents with different polarity(a)and 1,4-dioxane in different合物中探针的荧光光谱（b）图4：38 0 n m）与水的混在不同极性的有机溶剂中探针（化后的荧光光谱（a）和不同比例的1二氧六环（入波长/nm波长/nm650600700550500600550500750700650200100%-90%0.440080%70%0.660%600度40.%20%一丙酮一艺睛一二甲基亚矾0.8一四氢味喃8001,4-二氧六环/%一0%1.0a正口烧甲苯四氢呋喃0.8丙酮乙月睛0.6二甲基亚矾0.40.201.0La正已烧甲苯1000276-BME&Clin Med,May 2023,Vol.27,No.3生物医学工程与临床2 0 2 3年5月第2 7 卷第3期Size(TBAN-DTPANPs):80.28 nm AB6040200500600750直径/nm图5探针BPD-NP的DLS测试图（A)和TEM观察结果(B)Fig.5Images of DLS test of probe BPD-NP(A)and TEM observation result(B)1 000Vat 530 nm9008007006005678910pH图6探针的酸碱度(pH)稳定性Fig.6Diagram of pH stability of probe明探针具有良好的膜渗透性及良好的生物相容性。见图8。由图9 可以看出，探针对细胞进行了良好的染色。根据文献报道，脂滴是于内质网中产生的，之后进人细胞质内进行生理活动。由图可知，部分细胞中LD2520151050051015202530分析底物(1-30)130分别为F、C I、Br、I、C N-、C O？、NO 2、PO、SC N-、SO、CIO-、H 2 0 2、SO-、A 13、C a?C o 2、C r 2、C u、Fe 3、H g*、M g*、Ni t、Zn2*ctDNA.Cys、G SH、H c y、BSA、T C、g l u c o s e图7 探针分子对底物的选择性柱状图Fig.7Histogram of substrate selectivity of probe molecules聚集在了一起上并成功可视化（放大图），推断LD可能正处于内质网中。此外，值得注意的是，探针分子在细胞中呈点状分布，并且主要积累在LD上（放大BME&ClinMed,av2023.Vo1.27.No.3生物医学工程与临床2 0 2 3年5月第2 7 卷第3期1.00.80.60.40.20051015202530探针浓度/mol/L图8 用不同浓度的探针处理Hela细胞2 4h后细胞的存活率柱状图Fig.8 Survival rate histogram of Hela cells treated with differentconcentrations of probes for 24-hour图）。这表明BPD有能力追踪LD的细胞内积累及可视化活细胞中的LD的动态运动。3讨论荧光探针由于易于制备，高选择性和灵敏度及实时成像的潜力而被认为是一种出色的检测技术 3 15。因为其结构通常会存在较大的二面角，使其不利于电荷转移，因此大多数的希夫碱类荧光探针发光很差甚至没有荧光发射，因为其结构通常会存在较大的二面角，使其不利于电荷转移 6 。由于这个特点，目前存在的大多数希夫碱类荧光探针的识别机制是基于与分析物反应后发生结构上的改变，导致整体结构更加刚性从而有利于电荷转移，因而其荧光团部分发出强烈放大明场像暗场像叠场像50Jum50u150um图9在Hela细胞中孵育30 min探针（10 mol/L）后的图像（入ex=488nm）Fig.9Images(Aex=488 nm)of probe(10 mol/L)after incubation in Hela cells for 30-minute的荧光信号，到目前为止，很少存在可视化脂滴的希夫碱类荧光探针。笔者合成的一种基于芘的希夫碱类荧光探针BPD，该探针在1,4-二氧六环中存在强烈的荧光发射，而在水中荧光很弱，可能是归因于水分子的进攻而灭荧光，这个特点使其更加适合用于脂滴成像，因为脂滴的结构导致其有十分疏水的特性。希夫碱类荧光探针通常是作为反应型探针的，其本身发光性质并不好，因此在希夫碱类荧光探针的设计中通常加人可以淬灭荧光的识别基团或导致其具有大二面角的大空间位阻基团 17.18 而笔者合成的基于芘的希夫碱类荧光探针BPD与大多数染料的荧光性质恰恰相反，探针具有极强的亲脂性，可以靶向到LD中，且具有很高的荧光强度。通过理论计算，发现与其他脂滴成像探针不同，希夫碱类荧光探针BPD在疏水的环境中,结构并不会变得太扭曲，而是保持几乎在一个平面上，这也说明了分子内仍旧存在电荷转移，且E=3.12eV。此外，探针具有十分良好的选择性、抗干扰能力、良好的膜渗透性及生物相容性，并在宽泛的pH值中依旧存在强荧光信号。此外，探针可以在Hela细胞中形成可视化细胞内脂滴。（利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突）参考文献：1 J Ralhan I,Chang CL,Lippincott-Schwartz J,et al.Lipid dropletsin the nervous systemJ.J Cell Biol,2021,220(7):e202102136-e202102136.2 J Wang L,Liu J,Miao Z,et al.Lipid droplets and their interac-tions with other organelles in liver diseasesJ.Int J BiochemCell 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Nevada,Reno）机械工程系金翼飞教授课题组提出一种基于响应性屈服应力流体的“peeling-boiled-eggs(PBE）方法，实现了全尺寸人脑模型的快速制造，以用于术前模拟训练目前，手术仍然是治疗脑部肿瘤及多种原因造成脑外伤的有效手段之一。但由于人类大脑的复杂结构，极大提高了手术过程的难度。因此，根据患者病情而定制的术前大脑模型能够帮助外科医生精准分析病灶和提高手术熟练度，从而提升手术成功率。然而，基于已有的模具成型方法，难以根据患者的大脑，打印出高精准度的大脑模型。同时，当前的3D打印技术，也只能利用生物相容性材料打印等比缩小的人脑结构，无法实现全尺寸人脑模型的打印为解决上述问题，该研究团队使用PBE方法，所使用的3D打印材料是由海藻酸钠（NaAlg）和明胶（gelatin）组成。光固化温敏性屈服应力流体由纳米黏土（nanoclay）、聚氧乙烯聚氧丙烯(PluronicF127)和聚乙二醇二丙烯酸酯（PECDA)组成。不同于传统的打印思路，PBE利用了响应性屈服应力流体可在打印过程中随时添加的优点，实现了短针头打印全尺寸人脑外部轮廓的过程。打印结束后，通过降低温度完成了明胶的交联反应和支撑浴的液化。这样，人脑外轮廓模型可以移入氯化钙（CaCl2)溶液实现海藻酸钠的二次交联。同时，剩余的支撑浴材料回收以备后续打印使用。完全固化后的人脑外轮廓模型被放置在紫外光下。紫外光可有效穿过人脑外轮廓，实现内部人脑模型的交联反应。通过37 的柠檬酸钠（sodium citrate)溶液完全溶解外轮廓，最终得到了全尺寸的人脑模型。该方法可以极大缩短打印时间、节省材料、降低成本。同时，短针头的使用可