小鼠细小病毒VP2蛋白在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达和免疫原性分析.pdf

第 40 卷第 4 期2023 年 8 月实验动物科学LABORATORY ANIMAL SCIENCEVol.40No.4August 2023论著收稿日期:2022-04-12基金项目:2019 年度军队实验动物专项科研课题(SYDW-2018-11);2021 年度东部战区总医院青年课题(YYQN2021099)作者简介:马畅(1986),女,技师,硕士,研究方向:实验动物病原体检测.E-mail:machang316 通信作者:恽时锋(1965),男,主任医师,研究方向:实验动物与比较医学.E-mail:yunshifeng1 小鼠细小病毒 VP2 蛋白在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达和免疫原性分析马 畅1 赵迎峰2 陈 莉1 刘 彪1 赵志刚1 恽时锋1(1.中国人民解放军东部战区总医院医疗保障中心实验动物室,全军实验动物科普与伦理教育基地,全国科普教育基地,南京210002)(2.中国人民解放军东部战区总医院第三派驻门诊部,南京210002)摘要:目的利用杆状病毒表达系统合成重组小鼠细小病毒(MVM)VP2 蛋白,并对其免疫原性分析。方法将优化后的 MVM VP2 序列克隆至表达载体 pFastBac1,命名为 pFastBac1-MVM VP2,再将其转化至 DH10Bac 感受态大肠杆菌中形成重组杆粒,提取重组杆粒经 PCR 鉴定正确后转染昆虫细胞 Sf9,镜下观察到细胞明显病变后收获重组杆状病毒 rBac-MVM VP2。Sf9 细胞接重组病毒 48 和 72 h 后,用间接免疫荧光(IFA)和蛋白免疫印迹(Western blot)法验证重组蛋白的免疫原性。结果构建的 rBac-MVM VP2 重组杆状病毒感染 Sf9 细胞后,可成功表达 MVM VP2 重组蛋白,经 Western blot 和 IFA 检测分析,重组蛋白具有较好的免疫原性且在病毒感染 72 h 时表达量较高。经蛋白纯化后可得到纯度较高的 VP2 重组蛋白。结论本研究利用昆虫细胞-杆状病毒系统成功表达 MVM VP2蛋白并具有良好的免疫原性,为 VP2 相关功能的研究和临床诊断方法的建立奠定基础。关键词:小鼠细小病毒;VP2 蛋白;杆状病毒表达中图分类号:Q95-3文献标志码:A文章编号:1006-6179(2023)04-0028-06DOI:10.3969/j.issn.1006-6179.2023.04.006Expression and Immunogenicity Analysis of VP2 Protein of Minute Virus of Micein Insect Cell-baculovirus Expression SystemMA Chang1,ZHAO Yingfeng2,CHEN Li1,LIU Biao1,ZHAO Zhigang1,YUN Shifeng1(1.Department of Laboratory Animal,Chinese PLA General Hospital of Eastern Theater Command,Army Education Base of Science andEthics of Experimental Animal,National Sciene Education Base,Nanjing 210002,China)(2.Department of No.3 Stationed Out-patient,Chinese PLA General Hospital of Eastern Theater Command,Nanjing 210002,China)Abstract:ObjectiveRecombinant MVM VP2 protein was synthesized by baculovirus expression system and the immunogenicity of the recombinant VP2 protein was analyzed.MethodThe optimized MVM VP2 gene sequence was cloned into the eukaryotic expression vector pFastBac1,then the recombinant vector pFastBac1-MVM VP2 was transformed into DH10Bac susceptible E.coli to form recombinant plasmid.The recombinant plasmid were transfected into insect cells Sf9.Recombinant baculovirus rBac-MVM VP2 was harvested after significant cellular lesions were observed.Sf9 cells were inoculated with recombinant virus rBac-MVM VP2 for 48 and 72 h.Immunogenicity of the recombinant protein was tested by IFA and Western blot.ResultRecombinant baculovirus rBac-MVM VP2 could successfully express recombinant MVM VP2 protein after infecting Sf9 cells.Western blot and IFA analysis showed that the recombinant protein had good immunogenicity and high expression at 72 h of virus infection.After protein 第 4 期马畅等:小鼠细小病毒 VP2 蛋白在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达和免疫原性分析 purification,a high purity recombinant protein VP2 was obtained.ConclusionIn this study,MVM VP2 protein was successfully expressed by insect cell-baculovirus system and the recombinant VP2 protein has good immunogenicity,which lays a foundation for the study of VP2-related functions and the establishment of clinical diagnosis method.Key words:minute virus of mice;VP2 protein;baculovirus expression小鼠细小病毒(minute virus of mice,MVM)是啮齿类动物常见病原体,对肿瘤细胞、肠上皮细胞、造血细胞和淋巴细胞均具有较高亲和力1-2,是细胞培养中的常见污染源3-4。MVM 稳定性极强,在4 或 37 放 置 一 周,感 染 滴 度 下 降 不 超 过1.2 Log5。因此 MVM 污染不易清除和灭活,已成为危害生物制品安全的一个重要因素。自然情况下,MVM 感染成年小鼠不表现任何临床症状,但能影响免疫系统、肿瘤接种和皮肤移植等实验数据的准确性2,6-7。因此,表达出免疫原性较好的抗原蛋白,可为 MVM VP2 相关功能的研究和临床诊断方法的建立提供依据。1材料和方法1.1材料1.1.1细胞、杆状病毒表达系统:草地贪夜蛾卵巢细胞系(Spodoptera frugiperda cells 9,Sf9)由本实验室保存;Bac-To-Bac 杆状病毒表 达系统采购 于Life technologies 公司。1.1.2主要试剂:硫酸庆大霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、链霉素、四环素、IPTG、X-Gal(北京索莱宝科技有限公司);Alexa Fluor 555 标记驴抗小鼠 IgG、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠 IgG、免疫染色固定液及 His 标签蛋白纯化试剂盒(碧云天生物技术公司);0.3%TritonX-100(北京博奥森生物技术有限公司);PCR 相关试剂(南京诺维赞生物科技有限公司);BAC/PAC DNA 提取试剂盒、无内毒素质粒提取试剂 盒、DNA 胶 回 收 试 剂 盒(OMEGA 公 司);HiGene 转 染 试 剂(普 利 莱 基 因 技 术 有 限 公 司);BamH I 和 EcoR I【宝日医生物技术(北京)有限公司】;I-Max 昆虫细胞无血清培养液(维森特生物技术有限公司);PCR 引物和优化基因序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。1.1.3序列优化与引物合成:根据 NCBI GenBank中公布的 MVM 株全基因(GenBank:J02275.1)中VP2 序列(2792-4554),进行编码序列偏好性优化,并在序列两端增加酶切位点、C 端添加 His-tag,合成后插入 pUC57,命名为 pUC57-MVM VP2,由本实验室保存。pUC57-MVM VP2 和 VP2 特异引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。引物序列信息见表 1。表 1引物序列信息Table 1Primer sequence information引物名称引物序列酶切位点MVM VP2-F5-GGATCCATGTCAGACGGAACATCGCAGCC-3BamH IMVM VP2-R5-GAATTCTTAGTGATGGTGATGGTGATG-3EcoR IpUC/M13-F5-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3无pUC/M13-R5-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3无1.1.4重组杆状质粒的构建及鉴定:质粒 pUC57-MVM VP2 作为模板,利用特异引物进行目的片段扩增。扩增体系:稀释后的质粒模板 1 L,MVM VP2-F/R 引 物(10 mol/L)各 1 L,2 Phanta Max Master Mix 12.5 L,灭菌水补足至 25 L。扩增程序:95 30 s 预变性,扩增片段 35 个循环(变性95 15 s,退火 56 15 s,延伸 72 55 s),彻底延伸 72 5 min。PCR 扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳,切 下 目 的 片 段 回 收 和 纯 化。回 收 片 段 经BamH I 和 EcoR I 双酶切后,插入 pFastBac1 载体中,构建 pFastBac1-MVM VP2 重组质粒。提取质粒,取1 g 转化至 DH10Bac 感受态细胞,涂布蓝白斑筛选LB 平板,恒温培养箱 37 避光培养。蓝白斑筛选两次后,挑选出白色单克隆用 MVM VP2-F/R、pUC/M13-F/R 引物 进行 PCR 鉴定,扩大培 养 后 提 取Bacmid 杆粒,获得重组 Bacmid-MVM VP2,经再次92 实验动物科学40 卷PCR 鉴定后备用。实验过程严格按照试剂盒说明书和杆状病毒表达系统操作说明书进行。1.1.5重组杆状病毒的获得:参照 HiGene 转染试剂说明书,利用 HiGene 转染试剂将 Bacmid-MVM VP2 转染至 Sf9 细胞,27 温箱培养至细胞出现明显病变时,1 200 r/min、4 低温离心 5 min,弃去细胞和碎片沉淀,上清液即为第一代重组病毒 rBac-MVM VP2(P0),按 1 10 接毒比例传至第三代,测定病毒滴度(TCID50)后避光存放于 4 或分装冻存于-80 冰箱。1.1.6IFA 鉴定蛋白表达:rBac-MVM VP2(MOI=1)感染 Sf9 细胞,同时设空白 Sf9 作对照,27 恒温箱培养。分别于 48、72 h 后弃除细胞培养液,加入免疫染色固定液室温固定 10 min,PBST 洗涤 3 次;TritonX-100 室温透膜 10 min,PBST 清洗,加入 1 500 稀释 的 MVM 鼠 源 单 克 隆 抗 体(由 本 实 验 保存),37 孵育 1 h,PBST 清洗;加入 1 500 稀释的Alexa Fluor 555 标记驴抗小鼠 IgG,37 避光孵育45 min,PBST 清洗后置于荧光显微镜下观察。1.1.7Western blot 检测蛋白表达:重组病毒感染Sf9 细胞,操作同步骤 1.6,27 、90 r/min 恒温摇床悬浮培养,于 48、72 h 分别收集细胞,使用 MVM 鼠源单克隆抗体作为一抗,辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠 IgG 作为二抗,进行 Western blot 检测。1.1.8蛋白纯化:Sf9 细胞同 1.1.5 方法接种重组杆状病毒,72 h 后 1 200 r/min 低速离心收集细胞,去除培养液加入预冷细胞裂解液 4 作用 30 min。超声破碎处理,超声条件:超声功率 300 W,每次超声 10 s,间隔 10 s,共超声破碎 10 min。细胞裂解液10 000 r/min、4 低 温 离 心 10 min,上 清 液 经0.45 m 蛋白低吸附针头滤器过滤后进行纯化。纯化过程严格遵照试剂盒说明书进行,SDS-PAGE 检测纯化蛋白。2结果2.1重组杆状质粒的构建及鉴定 以 pUC57-MVM VP2 质粒为模板,利用特异性引物 成 功 扩 增 出 MVM VP2 条 带,与 预 期 大 小1 781 bp 一致(图 1A)。再用限制性内切酶(BamH I 和 EcoR I)酶切纯化后的目的条带,酶切片断再次纯 化 后 插 入pFastBac1 载 体 构 建 重 组 质 粒pFastBac1-MVM VP2。重组质粒转化至 DH10Bac 感受态细胞,蓝白斑筛选后用 PCR 方法对 Bacmid-MVM VP2 菌 液 进 行 鉴 定(扩 增 片 断 大 小 为2 300 bp+插入片段 1 781 bp)。结果显示(图 1B),第 1、2、4、6 号为阳性,选取 4 号 Bacmid-MVM VP2重组菌提取重组杆粒,经再次 PCR 鉴定后(图 1C)进行 Sf9 细胞转染。2.2重组杆状病毒 rBac-MVM VP2 的获得将重组杆状质粒 Bacmid-MVM VP2 转染至 Sf9细胞,27 恒温培养,每天观察细胞状态,直至出现病变,低温离心收集细胞上清液,获得重组杆状病毒P0 代。与空白组相比,感染病毒后的 Sf9 细胞体积变大,核区扩增明显并向内凹陷,细胞边缘模糊颜色变暗,且有较多细胞碎片漂浮在培养液中。继续感染 Sf9 细胞,进行病毒增殖,收集病毒液并测定病毒滴 度,P3 株 滴 度 可 达 到 2.52 108 TCID50/mL(图 2)。2.3IFA 鉴定蛋白表达于接毒后 48 和 72 h 两个时间点,分别收集重组病毒感染(MOI=1)的 Sf9 细胞,IFA 鉴定蛋白表达。如图 3 所示,感染 rBac-MVM VP2 的 Sf9 细胞出现特异性红色荧光,而空白组无荧光。荧光强度统计结果显示,72 h 感染细胞的荧光数量明显多于48 h 的荧光数量(P0.01)。表明接毒 48 和 72 h后,Sf9 细胞中均成功表达 VP2 重组蛋白,且在感染72 h 后时蛋白表达量较高。2.4Western blot 检测蛋白表达于 48 和 72 h 两个时间点,分别收集病毒感染(MOI=1)的 Sf9 细胞蛋白,Western blot 检测蛋白表达情况。如图 4 所示,重组 VP2 蛋白在 Sf9 细胞中得到高效表达,能与 MVM 鼠源单克隆抗体结合出现特异条带,大小约 64 kU。且病毒感染 72 h 后胞内重组 VP2 蛋 白 的 表 达 量 明 显 较 48 h 高(P 0.01)。结果表明,感染病毒的 Sf9 细胞表达出的MVM VP2 重组蛋白可与 MVM 单克隆抗体特异性结合,且在感染 72 h 后蛋白表达量较高。2.5重组蛋白纯化结果重组杆状病毒感染(MOI=1)Sf9 细胞,悬浮培养 72 h 后低速离心收集细胞。加入适量预冷细胞裂解液,冰浴条件下超声破碎细胞,裂解液经低温离心后收集上清进行蛋白纯化,SDS-PAGE 检测纯化前后的蛋白纯度。如图 5 所示,经过多次洗涤后,可以得到纯度较高的 VP2 重组蛋白,大小约 64 kU,蛋白大小符合预期。03第 4 期马畅等:小鼠细小病毒 VP2 蛋白在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达和免疫原性分析 注:A.M:DL5000 DNA Marker;1.特异引物扩增产物 MVM VP2;2.重组质粒 pFastBac1-MVM VP2 经 BamH I 和 EcoR I 双酶切;3.重组质粒 pFastBac1-MVM VP2;B.M:DL5000 DNA Marker;1-8.pUC/M13 引物对 Bacmid-MVM VP2 重组菌鉴定;9.阴性对照;C.M:DL5000 DNA Marker;1.pUC/M13 引物鉴定 Bacmid-MVM VP2 4 号质粒;2.重组 Bacmid-MVM VP2 杆粒;3.阴性对照Note:A.M:DL5000 DNA Marker;1.PCR products of pUC57-MVM VP2;2.The recombinant plasmid pFastBac1-MVM VP2 wasdigested by BamH I and EcoR I;3.Recombinant plasmid pFastBac1-MVM VP2;B.M:DNA Marker;1-8.Identificationof the recombinant bacteria by pUC/M13 primers;9.Negative control;C.M:DL5000 DNA Marker;1.Identification of the recombinantplasmids No.4 by pUC/M13 primers;2.Recombinant plasmid Bacmid-MVM VP2;3.Negative control图 1Bacmid-MVM VP2 重组杆状质粒的构建和鉴定Fig.1Construction and Identification of Recombinant Bacmid-MVM VP2 plasmids注:A.正常 Sf9 细胞;B.感染重组杆状病毒 rBac-MVM VP2 后病变的 Sf9 细胞Note:A.Normal Sf9 cells;B.Sf9 cells transfected with recombinant baculovirus rBac-MVM VP2图 2重组杆状病毒 rBac-MVM VP2 感染 Sf9 细胞(200)Fig.2Sf9 cells transfected with recombinant baculovirus rBac-MVM VP2(200)3讨论细小病毒(MVM 株)是啮齿类动物常见的感染性病原体,在欧洲、美国和澳大利亚等国家都有较高的感染率。我国也曾报道,在普通小鼠群体中 MVM感染非常普遍8,MVM 已被列为实验动物国家标准中要求排除的感染性病原体。MVM 对新生小鼠可以诱发致命性肾出血,但在自然条件下,MVM 对成年小鼠常呈隐性感染,不表现任何临床症状。但研究报道,在涉及免疫系统、肿瘤移植的实验中,感染 MVM 可增强动物机体对诱发性或自发性肿瘤的抵抗力,直接降低肿瘤生长速度9,还会干扰淋巴细胞的调节和腹水的产生,改变异体皮肤移植的排13 实验动物科学40 卷注:A.正常 Sf9 细胞;B.重组杆状病毒感染 Sf9 细胞 48 h;C.重组杆状病毒感染 Sf9 细胞 72 h;D.荧光强度统计图,P0.01Note:A.Normal Sf9 cells;B.Recombinant baculovirus infected Sf9 cells for 48 h;C.Recombinant baculovirusinfected Sf9 cells for 72 h;D.Fluorescence Intensity Statistics,P0.01图 3重组杆状病毒 rBac-MVM VP2 感染 Sf9 细胞内 VP2 蛋白不同时间点的 IFA 鉴定(200)Fig.3Identification of recombinant VP2 protein in Sf9 cells infected with the viruses by IFA(200)注:M.蛋白 Marker;1.正常 Sf9 细胞;2.重组杆状病毒感染 Sf9 细胞 48 h;3.重组杆状病毒感染 Sf9 细胞 72 h;P0.01Note:M.Protein Marker;1.Normal Sf9 cells;2.Sf9 cells were infected with recombinant baculovirus for 48 h;3.Sf9 cells were infected with recombinant baculovirus for 72 h;P0.01图 4重组杆状病毒 rBac-MVM VP2 感染 Sf9 细胞内 VP2 蛋白不同时间点的 Western blot 鉴定Fig.4Identification of recombinant VP2 protein in the Sf9 cells infected withrecombinant baculovirus by Western blot at different time points注:M.蛋白 Marker;CP.细胞沉淀;CL.细胞裂解上清;FT.上样穿流液;W1 W5.洗涤液 1-5;E1 E2.洗脱液 1-2Note:M.Protein Marker,CP.Cell precipitation,CL.Cell lysissupernatant,FT.Flow through,W1-W5.Wash buffer1-5,E1-E2.Elution buffer 1-2图 5纯化重组 MVM VP2 蛋白 SDS-PAGE 鉴定Fig.5Identification of purified recombinantMVM VP2 protein by SDS-PAGE斥反应2。此外,由于 MVM 在外界环境中呈高度稳定性10-11,所以设施内动物之间传播可能性很大。因此,建立针对 MVM 血清学和病原学的检测方法,表达出敏感性好、特异性高的抗原蛋白显得尤为重要。MVM,细 小 病 毒 科 细 小 病 毒 属,无 包 膜 单 链DNA 病毒,基因组总长度约 5 000 bp,呈二十面体对称结构,直径约 26 nm12。基因组携带有 5ORF 和3 ORF 两 个 开 放 阅 读 框(open reading frame,ORF),前者编码结构蛋白 VP1 和 VP2,而后者编码非结构蛋白 NS1 和 NS213。与 VP1 相比,VP2 为主体衣壳蛋白(约占衣壳总蛋白的 85%),主要参与病毒外壳的组装,并在入胞时介导病毒与受体蛋白的互作。所以,MVM VP2 常作为免疫检测方法中的特异检测蛋白。昆虫细胞-杆状病毒系统作为表达外源基因的有效途径,具有表达产量高、保持蛋白天然生物学特23第 4 期马畅等:小鼠细小病毒 VP2 蛋白在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达和免疫原性分析 性的优点。除此,Sf9、High5 等昆虫细胞具有培养操作简便、成本较低、易于扩大培养的特性,常广泛运用于重组蛋白的高效表达14-15。为此,本研究将MVM VP2 目的序列优化为杆状病毒偏爱密码子序列,利用分子克隆技术将 MVM VP2 基因片断插入pFastBac1 质粒。用双酶切方法验证重组质粒,再将其转化至 DH10Bac 细胞中进行重组,得到 Bacmid-MVM VP2 重组杆粒。重组杆粒用经典 PCR 方法验证正确后,利用脂质体转染试剂转染至呈对数期生长的 Sf9 细胞。通过 Sf9 昆虫细胞表达系统,成功获得重组杆状病毒 rBac-MVM VP2。将此病毒感染Sf9 细胞 48 和 72 h 后,分别进行 IFA 和 Western blot验证。IFA 结果显示感染 rBac-MVM VP2 的 Sf9 细胞 48 h 时出现 VP2 蛋白的特异性荧光,且在感染72 h 时特异性荧光明显增多。同样,Western blot 结果显示,感染 rBac-MVM VP2 的细胞 48 h 后即可被MVM 鼠源单克隆抗体特异性识别,具有良好的免疫活性,且 72 h 时蛋白表达量明显升高。蛋白纯化SDS-PAGE 结果显示,多次洗涤后,可洗脱下纯度较高的 MVM VP2 蛋白,蛋白大小与 Western blot 检测结果相同,符合预期。综上,本研究利用昆虫细胞-杆状病毒系统成功表达 MVM VP2 蛋白,经鉴定重组 VP2 蛋白表现出良好的生物学构象,免疫原性较好,可为 MVM VP2相关功能的研究和诊断方法的建立奠定基础。参 考 文 献 1 JACOBY R O,JOHNSON E A,BALL-GOODRICH L J,et al.Characterization of mouse parvovirus infection by in Situ hybridizationJ.J Virol,1995,69(6):3515-3519.2 MCKISIC M D,PATURZO F X,SMITH A L,et al.Mouse parvovirus infection potentiates rejection of tumor allografts and modulates T cell effector functionsJ.Transplantation,1996,61(2):292-299.3 MCKISIC M D,LANCKI D W,OTTO G,et al.Identification and propagation of a putative immunosuppressive orphan parvovirus in cloned T cells J.J Immunol,1993,150(2):419-428.4 SEGOVIA J C,REAL A,BUEREN J A,et al.In vitro myelosuppressive effects of the parvovirus minute virus of mice(MVMi)on hematopoietic stem and committed progenitor cellsJ.Blood,1991,77(5):980-988.5 孟淑芳,林林,冯建平,等.鼠细小病毒感染性滴度测定方法的建立及病毒制备J.中国生物制品学杂志,2009,22(8):815-818.6 MCKISIC M D,MACY J D J,DELANO M L,et al.Mouse parvovirus infection potentiates allogeneic skin graft rejection and induces syngeneic graft rejectionJ.Transplantation,1998,65(11):1436-1446.7 SMITH A L,JACOBY R O,JOHNSON E A,et al.In vivo studies with an“orphan”parvovirus of miceJ.Lab Anim Sci,1993,43(2):175-182.8 卫礼,吴惠英,贺争鸣.小鼠细小病毒抗体的检测J.北京实验动物科学,1990(1):24-26.9 JANUS L M,BLEICH A.Coping with parvovirus infections in mice:health surveillance and controlJ.Lab Anim,2012,46(1):14-23.10BOSCHETTI N,WYSS K,MISCHLER A,et al.Stability of minute virus of mice against temperature and sodium hydroxideJ.Biologicals,2003,31(3):181-185.11BOSCHETTI N,NIEDERHAUSER I,KEMPF C,et al.Different susceptibility of B19 virus and mice minute virus to low pH treatmentJ.Transfusion,2004,44(7):1079-1086.12CRAWFORD L V,FOLLETT E A C,BURDON M G,et al.The DNA of a minute virus of miceJ.J Gen Virol,1969,4(1):37-46.13GARCIN P O,PANTE N.The minute virus of mice exploits different endocytic pathways for cellular uptake J.Virology,2015,482:157-166.14ELMENOFY W,MOHAMED I,EL-GAIED L,et al.Expression of 1B capsid protein of Foot-and-mouth disease virus(FMDV)using baculovirus expression system and its validation in detecting SAT 2-specific antiseraJ.Peer J,2020,8:e8946.15ELGAIED L,SALEM R,ELMENOFY W.Expression of tomato yellow leaf curl virus coat protein using baculovirus expression system and evaluation of its utility as a viral antigen J.3 Biotech,2017,7(4):269.33