染色体外环状DNA在肿瘤中的研究进展.pdf

DOI:10.12289/j.issn.1008-0392.22376综述 收稿日期:2022-09-13 基金项目:国家自然科学基金青年科学基金项目(81802560)作者简介:朱亚茹(1997),女,硕士研究生.E-mail:15801785161 通信作者:吴 刚.E-mail:wg_urologist 染色体外环状 DNA 在肿瘤中的研究进展朱亚茹,訾 彤,吴登龙,吴 刚(同济大学附属同济医院泌尿外科,上海市 200065)【摘要】染色体外环状 DNA(extrachromosomal circular DNA,eccDNA)是一种来自染色体的双链环状 DNA。eccDNA 种类繁多,但其来源与功能仍尚不清楚。越来越多的证据表明 eccDNA 通过多种方式在癌症中发挥重要作用,且可能作为生物标志物参与肿瘤诊断与预后判断。本文综述 eccDNA 的分类、来源、功能等方面的研究进展,为 eccDNA 的研究提供参考。【关键词】染色体外环状 DNA;肿瘤;癌基因;生物标志物【中图分类号】R730.2【文献标志码】A【文章编号】10080392(2023)04060108Research progress of extrachromosomal circular DNA in cancerZHU Yaru,ZI Tong,WU Denglong,WU Gang(Department of Urology,Tongji Hospital,School of Medicine,Tongji University,Shanghai 200065,China)【Abstract】Extrachromosomal circular DNA(eccDNA)is a double-linked circular DNA derived and free from chromosomes.There are many types of eccDNA,but its origin and function are still unknown.More and more evidences show that eccDNA plays an important role in cancer in a variety of ways,and may be used as a biomarker if tumor diagnosis and prognosis.Here,the classification,sources and functions of eccDNA are reviewed to provide reference for further eccDNA research.【Key words】extrachromosomal circular DNA;tumor;oncogenes;biomarker eccDNA 是一种来源于染色体的双链环状DNA。在 1957 年,Jacob 等1首次在大肠杆菌模型中提出环状 DNA 的概念;1965 年,Hotta 等2首次使用电子显微镜在公猪精子中观察到 eccDNA。随后,越来越多的研究表明,eccDNA 在真核生物中广泛存在,并已被鉴定出来3-4。本文综述 eccDNA 在肿瘤中的研究进展。1 eccDNA 分类eccDNA 可以来源于基因组的任何地方,根据来源、大小、序列等特征可被分为线粒体 DNA(mitochondrial circular DNA,mtDNA)、附 加 体(episomes)、双 微 体(double-minute chromosome,DM)、染 色 体 外 DNA(extrachromosomal DNA,ecDNA)、端粒环(telomeric circles,t-circle)、小多分散 环 状 DNA(small polydisperse circular DNA,spcDNA)、微 DNA(microDNA)等5。1.1 线粒体 DNA线粒体 DNA 是位于线粒体基质中的长度为16 kb的染色体外环状双链 DNA,其含量丰富,易于分离6。在哺乳动物中,mtDNA 仅通过雌性生殖系传播,在精子细胞中,mtDNA 的拷贝数很低,而卵母细胞中的拷贝数非常高7。mtDNA 的结构在哺乳动物中高度保守,此外,mtDNA 缺乏内含子,除了一个调节区外,几乎不存在基因间序列,rRNA 和tRNA 分子都非常小8。此外,线粒体 DNA 上的一106第 44 卷第 4 期2023 年 8 月同 济 大 学 学 报(医 学 版)JOURNAL OF TONGJI UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)Vol.44 No.4Aug.2023些蛋白质基因是重叠的,在许多情况下,部分终止密码子也不被编码,而是通过 mRNA 的多聚腺苷酸化在转录后产生9。1.2 附加体附加体是一种能够介导基因扩增的小型环状细胞外染色体。研究表明,在染色体复制过程中,复制叉停滞可能导致复制叉塌陷,复制泡随后从染色体上脱落,形成附加体10,附加体可以结合形成ecDNA 或整合形成均匀染色区(homogeneously staining regions,HSR)中,从而影响细胞功能11。1.3 双微体和染色体外 DNA1965 年,DM 首次在中期神经母细胞瘤细胞中发现12,随后其在各种肿瘤中被发现13-14,且恶性肿瘤中 DM 的量远高于良性肿瘤15。最初发现的DM 以二聚体的形式存在,随着研究技术的进展,发现了更多单体形式的 DM16,因此提出了更广义的ecDNA 的概念。ecDNA 是长度为 13 Mb 的染色体外环状 DNA,缺乏着丝粒和端粒,包含一个以上的完整基因和调控区域,与肿瘤的发生发展相关17。关于 ecDNA 如何产生尚不明确,目前已提出几种不同的模型:断裂 融合 桥循环、易位 缺失扩增模型、附加体模型、染色体碎裂模型18-20。断裂融合桥 循 环 是 最 经 典 的 模 型 之 一,最 初 由McClintock18提出。断裂融合桥循环由双链DNA 断裂引起的断裂染色体末端融合开始,随后形成双着丝粒染色体,在有丝分裂中两个着丝点彼此分离向两级移动,形成桥状物,称“染色体桥”,最后在分裂的后期染色体桥断裂,桥的断裂使一端产生重复,一端产生缺失,这样再周而复始,就形成了“断裂 融合 桥循环”21。根据断裂的位置和大小,可以产生高水平的基因扩增,如 HSRs 和 ecDNA22。在易位 缺失 扩增模型中,基因重排发生在易位点附近,易位断点附近的片段被扩增、保留或删除,因此形成 ecDNA 和 HSR23。附加体是一种能够介导基因扩增的小型环状细胞外染色体,附加体模型认为,复制叉停滞可能导致复制叉塌陷,复制泡随后从染色体上脱落,形成附加体10。研究表明附加体可以结合形成 ecDNA 或整合到形成 HSR 的染色体中11。染色体碎裂模型认为,当发生染色体碎裂时,形成的片段随机重排,为 ecDNA 的形成提供了良好的环境24。ecDNA 被认为与肿瘤耐药、异质性产生有重要意义15,25。1.4 端粒环为了维持线性 DNA 基因组,生物体进化出许多与端粒相关的解决办法,包括端粒相关的反转录转座子、回文结构、发夹结构等26。端粒阵列可以通过各种机制来维持,例如端粒酶活性或重组,依赖重组的维持途径可能包括 t-loops 和 t-circles26。端粒阵列是线性 DNA 末端串联重复的序列,通常以单链悬垂结束27。其中 t-loops 是由端粒伸出物侵入端粒阵列的双区而产生的,而 t-circles 是由端粒阵列构成的染色体外环状 DNA,其长度为 738 bp 的倍数27-28。t-circles 形成后,它们可以通过滚环复制自主扩增,产生长的染色体外端粒重复序列,这些重复序列可以切回到染色体末端29。1.5 小多分散环状 DNAspcDNA 是指长度一般小于 10 kb,直径为 0.22 m 的 eccDNA,主要来源于多种基因组序列,尤其是重复序列30。关于 spcDNA 的形成机制尚不清楚,目前主要的学说有:同源重组、非同源重组、反转录转座和依赖于 DNA 连接酶的途径31-35。在基因 不 稳 定 的 细 胞 和 组 织 中 发 现 了 较 多 的spcDNA,而在基因稳定的人成纤维细胞中并没有发现 spcDNA,因此 spcDNA 被认为与遗传不稳定的细胞相关36。另外,自主复制 spcDNA 可能导致染色体结构和基因表达模式的改变,这在启动或增强基因组不稳定性方面发挥着重要作用36。1.6 微 DNA(microDNA)microDNA 最早由 Shibata 等37通过电子显微镜在小鼠胚胎大脑中发现。microDNA 长度为 100400 bp,主要来源于高基因密度、GC 含量和外显子密度的区域38。microDNA 会在 DNA 复制过程中因聚合酶滑移产生,或在 DNA 断裂或复制阻断形成38。双链 microDNA 可以通过微同源性介导的双链 DNA 断裂片段的环化产生或从单链 microDNA转化而来38。microDNA 的具体功能尚不清楚,Paulsen 等39通过构建 microDNA 模拟物进行研究,发现 它 可 以 表 达 功 能 性 的 小 调 控 RNA,提 示microDNA 可以调控基因表达。2 eccDNA 的研究方法2.1 测序技术在二代测序问世以前,人们通过光学显微镜和电子显微镜发现并观察到了染色体外环状 DNA12。荧光原位杂交(FISH)技术的发展,实现了在分裂中206 同济大学学报(医学版)第 44 卷期将 eccDNA 上的癌基因与染色体上的癌基因的区分,并可以观察其随疾病进展或治疗发生变化的情况25,40。在 1990 年代,利用不同状态 eccDNA 的不同物理特性(超螺旋或解螺旋等),学者可以利用二维凝胶电泳将其分离41。近年来,二代测序技术的发展为研究 eccDNA序列、描述其特征提供了依据。基于二代测序的eccDNA 检测策略主要应用于短读长、双端测序数据检 测。然 而,这 种 方 法 在 准 确 识 别 完 整 的eccDNA 和 eccDNA 结构方面存在局限性。随着第3 代测序技术(如长读测序和单细胞测序)的发展及其方法的改进(如 Circle-seq、4C-seq、PLAC-seq 和ATAC-seq),可以从各种角度以及单碱基对和单细胞分辨率进行研究25,42-45。在几项研究中,长读长测序方法已被用于检测从头组装 eccDNA 结构。这样可以更可靠地识别由几个不连续的基因组序列组成的含有重复和嵌合的 eccDNA46-47。有研究开发了关于 eccDNA 的数据库 CircleBase,用于 eccDNA的研究48。2.2 成像技术除了基于序列特异性探针且只能应用于死细胞的 FISH 之外,还开发了其他显微技术来对 eccDNA进行成像。Epstein-Barr 病毒载体和质粒已用于与eccDNA 特异性重组,以引入 lac 操纵子重复序列,这些重复序列与 lac 阻遏物 绿色荧光蛋白(GFP)融合 蛋 白 特 异 性 结 合49-50,实 现 eccDNA 的 可视化。最近,一项基于靶向 eccDNA 断点序列的导向RNA 技术,利用催化死亡的 Cas9 和带有荧光报告分子的结合位点,使该种 RNA 可以定位活细胞中的特定 eccDNA,可以发现癌细胞中 eccDNA 的转录活性中心51。此外,一些 eccDNA 与序列无关的成像可通过电子显微镜进行。最新的显像方法可以使用结构照明显微镜对荧光标记 eccDNA 进行高分辨率显微观察52,或使用原子力显微镜对天然形式 eccDNA 进行高分辨率显微观察53。2.3 细胞模型系统由于存在许多具有在 eccDNA 上扩增的明确致癌基因的癌细胞系。例如,结肠直肠癌细胞系COLO320-DM 和 COLO320-HSR 分别携带 ecDNA和 HSR 形式的 MYC 基因。因此,这些细胞系经常用于癌症中 eccDNA 行为的比较研究,因为它们可以比较染色体和 eccDNA 扩增的癌基因的差异54。然而,为了进一步了解和研究 eccDNA 在细胞和组织中的功能影响,开发模拟这些的细胞和动物模型也很重要。2.4 特定 eccDNA 的构建除了在癌细胞中的 eccDNA 之外,开发 eccDNA研究模型的另一个主要挑战是在体内和体外产生特定的 eccDNA。eccDNA 不能通过典型的依赖大肠杆菌的 DNA 克隆工作流程在体外大量生产,因为eccDNA 不具有原核复制起点或选择标志。相反,eccDNA 可以直接合成。2007 年发明的连接酶辅助小环积累(ligase-assisted minicircle accu-mulation,LAMA)方法可用于生产共价闭合小环状 DNA55。LAMA 方法依赖于变性、退火和连接的循环,并已用于合成编码具有基因抑制作用的小调节 RNA 的microDNA39。最近的一项进展是应用 CRISPR-Cas9 基因组编辑来生成 eccDNA。如前所述,有证据表明,双链断裂(double-strand breaks,DSBs)出现在染色体中后,可以产生内源性 eccDNAs4,56。因此,有学者通过引导 RNA 将 Cas9 核酸内切酶靶向特定遗传位点,使其产生 DSB,这会产生 DNA 的染色体外片段,并且该片段有可能在体内被环化,目前该方法被广泛用于通过在同一染色体的两个位点同时切割来进行基因缺失57。基于此原理,CRISPR-Cas9 策略在细胞培养中成功实施,在人体细胞中产生了大小不等的内源性 eccDNAs57。CRISPR-Cas9 适应性强且高效,但 CRISPR-Cas9 诱导的 eccDNA 在细胞中的长期稳定性尚未得到很好的表征57。尽管如此,CRISPR-Cas9 仍是一种很有前途的工具,可用于对各种大小的内源性 eccDNA 进行功能研究。3 eccDNA 在肿瘤相关领域中的应用3.1 eccDNA 对于肿瘤发生发展的调控在线粒体 DNA 中,mtDNA 编码 2 个 rRNA、22个 tRNA 和 13 个线粒体蛋白亚基58,参与多种细胞活动。mtDNA 变异已经被证实与癌症进展相关。mtDNA 中 的 突 变 具 有 导 致 活 性 氧 类(reactive oxygen species,ROS)水平增加的能力,随后氧化磷酸化和线粒体呼吸的恶化导致可修饰 DNA 的氧化应激,这可能与肿瘤的发生发展有关59。Ishikawa等60使用细胞质杂交技术将转移性差的小鼠肿瘤细胞系中的内源性 mtDNA 替换为来自高度转移性306 第 4 期朱亚茹 等:染色体外环状 DNA 在肿瘤中的研究进展细胞系的 mtDNA,发现受体肿瘤细胞获得了植入的mtDNA 的转移潜力,用 ROS 清除剂预处理高转移性肿瘤细胞抑制了它们在小鼠中的转移潜能,这些结果表明,mtDNA 突变可以通过增强肿瘤细胞的转移潜能来促进肿瘤进展。Jin 等61的研究表明,线粒体 NADH 脱氢酶亚基 3(MTND3)的突变与胃癌进展相关。Akouchekian 等59的研究表明,ND1 的突变与结直肠癌的进展相关。Horibe 等62在肺癌细胞中的研究发现抗顺铂(CDDP)的肺癌细胞中的mtDNA 突变导致线粒体功能丧失、内在 ROS 水平上调和凋亡蛋白抑制剂的表达,这导致对 CDDP 的敏感性降低,即 mtDNA 突变在获得 CDDP 抗性中起作用。在染色体外 DNA 中,ecDNA 具有促进癌基因扩增,提高肿瘤异质性和调节肿瘤转移和侵袭等多种作用。(1)ecDNA 促进癌基因扩增。癌基因的扩增是肿瘤发生的驱动因素,已经在 ecDNA 上发现了大量的癌基因,其扩增显著增加了总体癌基因的表达25。Vogt 等63在晚期神经胶质瘤细胞中反复观察到 EGFR 基因在 ecDNA 内的扩增。Reader 等64在淋巴瘤患者的样本中确定了依赖ecDNA 扩增的促进肿瘤细胞增殖的 REL 基因,并且在最初的淋巴结活检中并未发现 REL 扩增,但REL 阳性的 ecDNA 却是复发时唯一可检测到的继发畸变,提示 ecDNA 与淋巴瘤复发的相关性。Rodon 等65在急性非淋巴细胞白血病患者样本中发现了通过 ecDNA 扩增的癌基因 MYC。此外,还有许多癌基因已经在 ecDNA 中被发现,如 GBAs、ZNF713、JMRPS17、SEPT14、VOPP1、CCNE1、PEGFRA、CyclinD2 等16,25,66。(2)ecDNA 提高肿瘤异质性。肿瘤异质性在推动肿瘤进展方面有重要作用67。在有丝分裂过程中,ecDNA 由于没有着丝粒而分离不均匀,使得子细胞含有不同拷贝数的ecDNA,ecDNA 上的癌基因不均匀分配与扩增可以增加细胞亚群,以促使肿瘤更有效地适应环境条件的变化25。有学者通过数学模型研究和患者样本,结果表明 ecDNA 扩增会比通过染色体(如 HSR)更能有效地增加癌基因拷贝数25。Xu 等68通过对脑肿瘤患者样本的研究发现,虽然相同的癌基因在诊断和复发时被扩增,但它们在不同的 ecDNA 中被扩增,这表明 ecDNA 很容易进化,从而迅速增加肿瘤异质性。(3)ecDNA 调节肿瘤转移和侵袭。ecDNA 已被证明与肿瘤的转移增强和不良预后有关。ecDNA 可以被封装在细胞外囊泡中,可作为癌细胞的信使,将致癌信息传递给其他细胞,ecDNA可以介导细胞的自分泌和旁分泌信号,这可能是促进肿瘤侵袭性和抗药性的原因69。Zhou 等70通过对干细胞样肿瘤起始细胞(stem-like tumor initiating cells,STIC)细胞进行研究,发现辐照过的 STIC 细胞可以通过旁分泌的方式促进细胞侵袭和血管生成以促进肿瘤发展。此外,ecDNA 上携带的多种癌基因也有促进肿瘤转移和侵袭的作用17。Durant 等71发现,端粒替代延长机制(alterna-tive longening of telomeres,ALT)在胃癌、中枢神经系统恶性肿瘤中发挥着重要作用,提示 t-circle 可能与肿瘤进展相关。Schmidt 等72通过比较正常细胞与癌细胞,发现肿瘤细胞中的 spcDNA 明显高于正常组织,且在肿瘤中发现的 Alu 和 L1 序列的数量直接依赖于spcDNA 的数量。Autiero 等73发现与乳腺癌相关的 PIP 基因的 3 区域参与了 spcDNA 的形成,这是首次发现的明确基因区域参与 spcDNA 的形成,也提示了 spcDNA 与肿瘤的相关性。Kumar 等74的研究表明,肺癌和卵巢癌患者在肿瘤切除后表现出循环 microDNA 长度的减少,提示 microDNA 在肿瘤中的作用,此外,该研究表明循环 microDNA 可能在细胞间通信中发挥作用。3.2 eccDNA 可作为肿瘤标志物存在细胞 外 游 离 eccDNA 比 线 性 无 细 胞 DNA(cfDNA)更稳定,并且已在癌症患者的癌组织和外周血中检测到,表明它们可能作新型生物标志物活检用于早期发现疾病、监测药物治疗反应和癌症存活74。Turner 等25的研究表明,ecDNA 的量随肿瘤种类而异,而与肿瘤原发性与转移性状态、是否经过放疗无关。Xu 等68的研究发现在肿瘤诊断与复发时 eccDNA 的差别。Schmidt 等72发现肿瘤细胞中的 spcDNA 明显高于正常组织。Mehanna 等75证实,microDNA 与细胞对药物的敏感性和抗性相关。在前列腺癌与子宫内膜癌中,都发现了 mtDNA与肿瘤风险的相关性25,76。以上均提示了 eccDNA作为肿瘤诊断与预后判断的标志物的可能性。并且,端粒长度的维持对于癌细胞的无限增殖至关重要,肿瘤细胞可以通过端粒酶和端粒延伸替代机制维持端粒长度77。端粒酶活性增加导致端粒长度增加,最终达到平台期,伴随着端粒长度异质406 同济大学学报(医学版)第 44 卷性的产生和 t-circles 的增加78。Yu 等79在高危神经母细胞瘤(high risk neuroblastoma,HRNB)中也证实了高水平的 t-circles 与肿瘤的主动端粒修剪相关,且无论端粒长度分布如何,在端粒酶和 ALT 阳性肿瘤中都观察到这一特征。这些研究均提示,t-circles 与肿瘤进展的相关性及可作为肿瘤标志物的可能性。此外,研究通过对肺癌与乳腺癌的研究发现肿瘤细胞可以释放特定 microDNA,提示其与肿瘤的关系74。Mehanna 等75通过对永生化淋巴母细胞系(LCL)使用甲氨蝶呤和 L-天冬酰胺酶进行研究,发现在用两种化疗药物处理的 LCL 中产生了大量的 microDNA,且化疗敏感样本显示出比化疗抗性样本更多的 microDNA,推测 microDNA 是化疗过程中细胞凋亡的产物,且有作为诊断标志物的潜力。3.3 eccDNA 在临床中的其他作用除作为肿瘤标志物的作用外,eccDNA 可能是肿瘤治疗的靶点。Shimizu 等50的研究表明,用低剂量羟基脲(HU)治疗可以消除 DM 并恢复癌细胞表型。对 eccDNA 的研究在指导肿瘤用药中也具有一定意义。研究表明,胶质瘤细胞中的 eccDNA 携带的 EGFR 突变体会随用药情况发生可逆性变化,因此提出 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors,TKI)每日给药不是最佳方法,这种给药方式很难达到足够的肿瘤内 EGFR 抑制水平。与连续给药相比,使用更高剂量的 EGFR TKI 进行脉冲间歇治疗可能会导致更好的靶点抑制,甚至可能降低毒性40。4 总结与展望虽然 eccDNA 发现已久,但其来源、功能仍尚未完全探究明确。随着研究方法与技术的进展,eccDNA 与肿瘤的相关性更加显现,主要体现在肿瘤癌基因表达、异质性产生、肿瘤转移与侵袭等方面。此外,在 肿 瘤 组 织 与 外 周 血 中 检 测 到 了eccDNA,提示其作为生物标志物的可能性。未来仍然需要探索的方向有:eccDNA 的产生、复制、消除、调控机制。与此同时,关于 eccDNA 的数据库仍然较少,无法为 eccDNA 的研究提供更多参考,这也是未来仍需发展的一个方向。【参考文献】1 JACOB F,WOLLMAN E L.Analysis of genetic liai-son groups of various donating strains of Escherichia coli K12J.C R Hebd Seances Acad Sci 1957,245(21):1840-1843.2 HOTTA Y,BASSEL A.Molecular size and circularity of DNA in cells of mammals and higher plantsJ.Proc Natl Acad Sci USA,1965,53(2):356-362.3 COHEN S,MCHALI M.Formation of extrachromo-somal circles from telomeric DNA in Xenopus laevisJ.EMBO Rep,2002,3(12):1168-1174.4 MLLER H D,PARSONS L,JRGENSEN T S,et al.Extrachromosomal circular DNA is common in yeastJ.Proc Natl Acad Sci USA,2015,112(24):E3114-E3122.5 WANG M,CHEN X Z,YU F,et al.Extrachromo-somal circular 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