体外法研究低蛋白条件下添加尿素和硝酸钠对瘤胃微生物的影响.pdf

第 卷 第期家畜生态学报 年月 体外法研究低蛋白条件下添加尿素和硝酸钠对瘤胃微生物的影响 收稿日期 修改日期：基金项目国家自然科学基金项目（，）作者简介陈学宗（），男，甘肃临夏人，硕士研究生，从事反刍动物营养与饲料科学研究。：通讯作者郑琛（），男，陕西佳县人，副教授，博士，从事反刍动物营养研究。：；王敏（），男，江西萍乡人，研究员，博士，从事反刍动物营养研究。：陈学宗，郑琛，王敏，张秀敏，易思宇，周巨旺，高程（甘肃农业大学 动物科学技术学院，甘肃 兰州 ；中国科学院亚热带农业生态研究所，湖南 长沙 ）摘要试验旨在研究低蛋白条件下添加尿素和硝酸钠对体外模拟瘤胃甲烷和氢气产量、瘤胃发酵特征和微生物蛋白合成的影响。采用单因素试验设计，对照组以低蛋白饲粮为发酵底物，尿素组为发酵底物中添加 尿素，硝酸钠组为发酵底物中添加 硝酸钠，使用无氮人工瘤胃缓冲液进行体外发酵，每个组包含个重复，分批次发酵。瘤胃液来自只装有永久瘤胃瘘管的浏阳黑山羊，采用全自动体外模拟瘤胃发酵装置进行 的厌氧发酵。结果显示：添加尿素对底物体外干物质降解率（）、总产气量、甲烷和氢气产量没有显著影响（犘）：添加硝酸钠显著降低、总产气量和甲烷产量并显著提高氢气产量（犘）。添加尿素显著提高体外发酵液中氨态氮（）和微生物蛋白浓度（犘），但对总挥发性脂肪酸（）浓度、乙酸和丙酸的比例无显著影响（犘）；添加硝酸钠显著降低体外发酵液中氨态氮和总挥发性脂肪酸浓度以及乙酸和丁酸的比例（犘），并显著提高微生物蛋白浓度和丙酸比例（犘）。体外发酵模式下，低蛋白饲粮中添加尿素可促进微生物蛋白的合成，但对瘤胃发酵模式和甲烷生成无影响，而添加硝酸钠促使氢向丙酸合成和微生物蛋白合成途径迁移，进而减少甲烷生成。关键词低蛋白；尿素；硝酸钠；甲烷；体外发酵；微生物蛋白 中图分类号 文献标识码 文章编号 （）：氢是瘤胃内碳水化合物发酵过程中的重要中间体，反刍动物瘤胃内大部分氢被甲烷菌消耗合成甲烷，这也是造成反刍动物能量损失的主要途径。尿素含氮量高，价格低，来源广泛，常作为非蛋白氮饲料应用于反刍动物饲养中。尿素在瘤胃中被瘤胃微生物分泌的脲酶降解生成氨和 等物质，再被微生物利用合成微生物蛋白，而微生物蛋白合成过程会吸收一部分氢，这可能竞争用于合成甲烷的氢，进而抑制甲烷生成。硝酸盐类也是常用的非蛋白氮饲料，在反刍动物瘤胃内以 为主要的代谢途径降解为氨，生成的氨可进一步被瘤胃微生物利用合成微生物蛋白。硝酸盐在被还原过程需要供氢体的电子，进而与甲烷生成过程竞争氢。另外，硝酸盐还可能具有毒性，通过抑制甲烷菌活性以减少甲烷生成。与尿素相比，硝酸钠降解生成氨的过程更加缓慢，这更有利于微生物蛋白的合成，因此，硝酸盐可能具有更强的减少甲烷生成和促进微生物蛋白合成的能力。本试验通过体外法来研究尿素和硝酸钠对瘤胃微生物蛋白合成和抑制甲烷的影响。为增强瘤胃微生物对氮的利用效率和减少其他氮源对瘤胃发酵的影响，采用了无氮瘤胃缓冲液和低蛋白发酵底物。材料与方法试验材料尿素和硝酸钠从国药集团化学试剂有限公司购买，纯度。发酵底物为低蛋白饲粮，配方见表。试验设计采用单因素试验设计，对照组为低蛋白饲粮直接作为发酵底物（），尿素组与硝酸钠组分别在发酵底物中添加 尿素、硝酸钠（干物质基础；）。每组个重复，分批次发酵。表低蛋白发酵底物配方及营养水平 原料 配比 （）营养物质 营养水平 稻草 干物质 玉米 粗蛋白 豆粕 钙 麦麸 磷 酸性洗涤纤维 （）中性洗涤纤维 脂肪 总消化养分 预混料 注：预混料为每千克饲粮提供：铁 ，铜 ，钴 ，钾 ，锰 ，锌 ，钠 ，锰 ，多种维生素 ，。：，试验动物及饲养管理选用只安装永久性瘤胃瘘管的浏阳黑山羊（）作为瘤胃液供体动物。山羊单笼饲养，每只山羊每天饲喂精料和稻草各 （风干基础），精 饲 料 组 成 为 玉 米，豆 粕，麦 麸，食盐，石粉，预混料。每天分次（：和：）饲喂，自由饮水。体外瘤胃发酵流程为了避免其他来源的氮源对试验的干扰，参照 等配制无氮人工瘤胃缓冲液。其缓冲液配置 为：，加入蒸馏水充分溶解（温度），加入 刃天青，通（保持厌氧环境）。晨饲前采集只山羊瘤胃液并混合均匀，迅速装入保温瓶带回实验室，用层脱脂纱布过滤，过滤后的瘤胃液与人工瘤胃缓冲液以均匀混合，制成人工瘤胃培养液，在整个过程中，不断通入 以保持厌氧环境，并维持温度于。称取发酵底物转入 厌氧发酵瓶中，置于 的培养箱中预热，然后向每个发酵瓶中加入 人工瘤胃培养液，用全自动体外模拟瘤胃发酵系统进行体外发酵。根据发酵瓶顶部空间大小、压力与气体体积的转化系数对甲烷、氢气的产气量进行计算。样品采集 发酵终止，迅速测定每个发酵瓶中发酵液的，然后分别取 均匀发酵液用于测定微生物蛋白，均匀发酵液用于测定氨态氮和挥发性脂肪酸浓度。剩余发酵液用 目纱布过滤以收集固相发酵内容物，放置于铝盒中 烘干至恒重，根据发酵后干物质重量差计算干物质降解率（，）。测定指标及方法 用酸度计测定，挥发性脂肪酸含量用气质联用仪（，美国）测定。氨态氮浓度根据 的方法测定。微生物蛋白采用考马斯亮蓝法（）及多功能酶标仪（，北京龙跃生物有限公司）测定（波长 ）。数据分析数据用 及 软件的一般线性模型（）程序进行单因素方差（）分析，差异显著时用 法进行多重比较。犘 为差异显著，犘 为无显著差异。结果与分析尿素和硝酸钠对体外瘤胃发酵产气的影响从表可以看出，发酵底物添加尿素后对体外、总产气量、甲烷和氢气产量无显著影响（犘）。发酵底物添加硝酸钠后体外、总产气量和甲烷产量（）显著低于对照组和尿素组（犘）。第期陈学宗，等：体外法研究低蛋白条件下添加尿素和硝酸钠对瘤胃微生物的影响尿素和硝酸钠对体外瘤胃发酵参数和微生物蛋白合成的影响由表可知，发酵底物添加尿素显著提高体外发酵液、氨态氮和微生物蛋白浓度（犘）；而发酵底物添加硝酸钠后体外发酵液 和微生物蛋白浓度显著高于尿素组和对照组（犘），氨态氮浓度显著高于对照组而显著低于尿素组（犘）。发酵底物添加尿素和硝酸钠对体外发酵液总挥发性脂肪酸浓度无显著影响，也没有改变乙酸和戊酸的百分比（犘），但与对照组和尿素组相比，硝酸钠显著提高体外发酵液丙酸百分比且降低丁酸、异丁酸和异戊酸的百分比（犘）。表添加尿素和硝酸钠对 体外瘤胃发酵干物质降解率和气体产量的影响 项目 对照组 尿素组 硝酸钠组 标准误 犘值犘 干物质降解率 总产气量 （）甲烷产量 （）氢气产量 （）注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（犘）。下表同。：（犘）表添加尿素和硝酸钠对体外模拟瘤胃发酵氨态氮、挥发性脂肪酸和微生物蛋白的影响 犻 狀狏 犻 狋 狉 狅 ，项目 对照组 尿素组 硝酸钠组 标准误 犘值犘 氨态氮（）微生物蛋白（）总挥发性脂肪酸 （）乙丙比 挥发性脂肪酸比例 乙酸 丙酸 丁酸 异丁酸 戊酸 异戊酸 讨论能量和氮源可共同影响饲粮的可发酵程度，进而影响饲粮营养物质消化率和气体产量 。张娇娇等研究添加不同比例缓释尿素对模拟体外瘤胃发酵的影响，发现缓释尿素添加量为时，和总产气量最高。张苏江等 研究表明，尿素添加量超过 时，总产气量显著降低。王荣等 研究添加不同比例的硝酸钠对模拟体外瘤胃发酵的影响，结果表明，硝酸钠添加量为 时显著降低了底物降解速率和总产气量。本试验中，在发酵底物中添加尿素没有显著影响干物质降解率和总产气量，而添加硝酸钠显著降低干物质降解率和总产气量，这表明硝酸钠抑制了瘤胃微生物对底物的降解，而尿素不影响瘤胃微生物对底物降解。尿素和饲料碳水化合物在细菌酶的作用下生成氨、二氧化碳以及挥发性脂肪酸和酮酸。氨和酮酸被细菌利用转化成氨基酸，进而在细菌酶的作用下合成微生物蛋白。研究表明，当氨态氮浓度为 时，微生物能够充分利用氨态氮合成菌体蛋白 。在本研究中，尿素组与硝酸钠组体外发酵液氨态氮浓度均处于该浓度值，这有助于微生物蛋白合成。本试验中，添加尿素和硝酸钠显著提高体外发酵液氨态氮浓度和微生物蛋白含量，这说明添加尿素和硝酸钠促进了瘤胃微生物蛋白合成。然而，与尿素相比，添加硝酸钠显著降低体外发酵液氨态氮浓度，提高了微生物蛋白含量，可能是硝酸根降解为氨的过程要缓慢，这更有利于微生家畜生态学报第 卷物对氨的充分利用，促进了微生物蛋白的合成，进而减少氨态氮浓度。在低蛋白条件下添加尿素和硝酸钠都有助于微生物蛋白合成，且硝酸钠比尿素具备更好的促微生物蛋白合成能力。甲烷是主要的温室气体之一，且动物胃肠道甲烷排放占全球甲烷排放的比例约为 。反刍动物瘤胃中的细菌和真菌等微生物分解饲料有机物产生、氢气和甲酸、甲醇等初级发酵产物，甲烷菌利用这些发酵产物获得其生长所需要的能量并代谢生成甲烷。等 通过对比尿素和硝酸钠的试验发现，硝酸钠比尿素能有效的抑制奶牛甲烷排放。本试验中，与对照组相比，添加尿素尽管促进了瘤胃微生物蛋白合成，但并没有影响体外发酵甲烷产量。硝酸钠组体外发酵的甲烷产量显著低于对照组和尿素组，这可能是因为硝酸盐类作为电子受体与甲烷菌竞争氢，减少甲烷合成的底物，从而抑制甲烷的产生 。所以在低蛋白条件下添加尿素对甲烷的生成没有产生抑制，而添加硝酸钠能有效的抑制甲烷生成。瘤胃微生物降解碳水化合物时，糖酵解过程伴随着 的循环利用和氢气生成，当瘤胃内甲烷合 成 受 阻 时，会 导 致 氢 气 的 累 积，进 而 抑 制 的再氧化，使微生物正常发酵功能受阻。硝酸盐在瘤胃内还原过程的中间代谢产物亚硝酸盐对甲烷菌具有毒性，从而抑制甲烷生产，减少了对氢的消耗 ，从而导致氢气累积。这也是本试验添加尿素没有改变体外发酵氢气产量而硝酸钠显著提高体外发酵氢气产量的主要原因。瘤胃内甲烷生成的变化通常会伴随着瘤胃发酵模式的改变。本试验中，添加尿素没有对体外发酵液总挥发性脂肪酸浓度和乙丙比以及甲烷产量产生影响，因而没有改变体外瘤胃发酵模式。但硝酸钠显著降低体外发酵液总挥发性脂肪酸浓度和乙丙比，主要是因为硝酸盐类可以有效抑制底物降解和甲烷生成，使氢气消耗量减少，导致氢气累积，这会促进氢向其他消耗途径迁移，主要体现为生成更多的丙酸 。由此可见，在低蛋白条件下添加尿素并没有改变体外瘤胃发酵模式，而硝酸钠使体外瘤胃发酵模式从乙酸生成型向丙酸生成型转变。结论在低蛋白水平下，发酵底物中添加尿素能够提高体外发酵液中氨态氮浓度并促进微生物蛋白合成，但没有影响到甲烷生成和瘤胃发酵模式；发酵底物添加硝酸钠抑制了体外发酵中的甲烷生成，提高丙酸和微生物蛋白合成。参考文献：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：张娇娇，李珊珊，白彦福，等饲用缓释尿素对模拟瘤胃体外发酵的影响 家畜生态学报，（）：，（）：张苏江，谭青，郭雪峰，等饲料添加尿素对羊瘤胃液、和产气量的影响 西北农业学报，（）：王荣，谭利伟，王敏，等硝酸钠和 溴乙烷磺酸钠对山羊体外瘤胃发酵甲烷、氢气和挥发性脂肪酸生成的影响 动物营养学报，（）：吴琼，姜宁，张爱忠，等反刍动物瘤胃尿素缓释剂的研究进展 中国畜牧杂志，（）：，第期陈学宗，等：体外法研究低蛋白条件下添加尿素和硝酸钠对瘤胃微生物的影响 ，：，（）：，：，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：张秀敏，王荣，马志远，等反刍家畜胃肠道甲烷排放与减排策略 农业环境科学学报，（）：，（）：，（）：犈 犳 犳 犲 犮 狋 狊狅 犳犝 狉 犲 犪犪 狀 犱犛 狅 犱 犻 狌 犿犖 犻 狋 狉 犪 狋 犲犛 狌 狆 狆 犾 犲 犿 犲 狀 狋 犪 狋 犻 狅 狀狋 狅犔 狅 狑犘 狉 狅 狋 犲 犻 狀犇 犻 犲 狋 狅 狀犻 狀狏 犻 狋 狉 狅犚 狌 犿 犲 狀犕 犻 犮 狉 狅 犫 犻 犪 犾 ，（犆 狅 犾 犾 犲 犵 犲狅 犳犃 狀 犻 犿 犪 犾犛 犮 犻 犲 狀 犮 犲犪 狀 犱犜 犲 犮 犺 狀 狅 犾 狅 犵 狔，犌 犪 狀 狊 狌犃 犵 狉 犻 犮 狌 犾 狋 狌 狉 犪 犾犝 狀 犻 狏 犲 狉 狊 犻 狋 狔，犔 犪 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