青花椒抗性基因ZaMBF1家族的生物信息学分析和逆境响应研究.pdf

第 41 卷 第 4 期2023 年 8 月四川农业大学学报Journal of Sichuan Agricultural UniversityVol.41 No.4Aug.2023青花椒抗性基因ZaMBF1家族的生物信息学分析和逆境响应研究王寒葶，张雨，李豪，郑皓，田源成，朱舜棱，许博洋，王景燕，龚伟，惠文凯*（四川农业大学林学院长江上游林业生态工程四川省重点实验室，成都 611130）摘要：【目的】探究青花椒抗逆调控基因ZaMBF1基因家族特征和非生物胁迫下的表达模式，为青花椒抗性育种提供重要的基因来源和理论基础。【方法】结合近年发表的青花椒基因组数据，综合利用生物信息学研究方法和荧光定量 PCR 技术，解析了多蛋白侨联因子 MBF1 家族（multiprotein bridging factor 1）的核酸和蛋白序列特征，探究了ZaMBF1s 对盐胁迫和脱落酸处理后的响应模式。【结果】青花椒共有 3 个 MBF1 家族成员，分别为 ZaMBF1a、ZaMBF1b和ZaMBF1c。其中ZaMBF1a和ZaMBF1b编码序列长度均为429 bp，分别位于26号和32号染色体，而ZaMBF1c编码序列长度为453 bp，位于4号染色体；青花椒ZaMBF1s均为亲水性的不稳定蛋白，其核酸序列和对应的启动子序列均含有丰富的WRKY、bHLH等抗逆调控基因结合位点和顺式作用元件；ZaMBF1家族基因在NaCl外源处理3 h后即可快速响应，并在处理后12 h再次极显著上调，尤其是ZaMBF1c的上调最为显著；同时，外源处理12 h也是ZaMBF1家族基因响应ABA处理的重要时间点。【结论】青花椒ZaMBF1家族成员可以参与抗逆调控过程，并对外源盐和脱落酸处理具有显著响应。本研究所获结果对于探究ZaMBF1基因的分子功能，揭示青花椒抗逆性的调控机制提供了丰富的数据支撑。关键词：青花椒；盐胁迫；脱落酸处理；多蛋白侨联因子中图分类号：S718.3 文献标志码：A 文章编号：1000-2650（2023）04-0592-10Bioinformatics Analysis of the ZaMBF1 Family and Its Expression Pattern under Different Stresses in Zanthoxylum armatumWANG Hanting，ZHANG Yu，LI Hao，ZHENG Hao，TIAN Yuancheng，ZHU Shunling，XU Boyang，WANG Jingyan，GONG Wei，HUI Wenkai*（College of Forestry，Sichuan Agricultural University，Sichuan Province Key Laboratory of Ecological Forestry Engineering on the Upper Reaches of the Yangtze River，Chengdu 611130，China）Abstract:【Objective】To explore the characters of ZaMBF1 gene family and its expression patterns in different abiotic stresses，and provide an important gene source and theoretical basis for resistance breeding in Zanthoxylum armatum.【Method】According to the public genome data of Z.armatum，this study comprehensively conduct the bioinformatics analysis of ZaMBF1 family（multiprotein bridging factor 1），including nucleic acid and protein sequence characters，and the expression patterns of ZaMBF1s were also explored in response to salt stress and ABA treatment using quantitative reverse transcription PCR technology.【Result】A total of three MBF1 members were detected in Z.armatum，named ZaMBF1a，ZaMBF1b and ZaMBF1c.Both the coding sequences of ZaMBF1a and ZaMBF1b were 429 bp and located on chromosomes No.26 and No.32，respectively.However，the coding sequence of ZaMBF1c was doi：10.16036/j.issn.1000-2650.202301203收稿日期：2023-01-05基金项目：国家重点研发计划项目（2020YFD1000700、2018YFD1000605）；四川省科技基金计划项目（2020YJ0130）；四川省“十四五”林木育种攻关项目（2021YFYZ0032）。作者简介:王寒葶，本科生，E-mail：。*责任作者：惠文凯，博士，硕士生导师，主要从事经济林重要性状的遗传调控机制研究，E-mail：。第 4 期王寒葶，等：青花椒抗性基因ZaMBF1家族的生物信息学分析和逆境响应研究453 bp，located on chromosome No.4.Besides，all of the ZaMBF1 were belonged to hydrophilic and unstable proteins，and it was enriched a plenty of WRKY，bHLH and other stress-resistant regulatory binding sites and cis-acting elements in the ZaMBF1s nucleic acid sequences and the corresponding promoter sequences.Meanwhile，the ZaMBF1 genes rapidly responded at 3 h after exogenous NaCl treatment，and were significantly up-regulated at 12 h once again，especially the ZaMBF1c.Additionally，the 12 h after exogenous treatment was also an crucial time point for ZaMBF1 family genes in response to ABA treatment.【Conclusion】The ZaMBF1 family members could be involved in stress regulation，and respond significantly to exogenous salt and ABA treatment.The present results will provide enough support for exploring the molecular functions of ZaMBF1 genes and revealing the regulatory mechanism of stress resistance in Zanthoxylum armatum.Keywords:Zanthoxylum armatum；salt stress；ABA treatment；MBF1竹叶花椒(Zanthoxylum armatum DC.)，又称青花椒，属芸香科(Rutaceae)花椒属(Zanthoxylum)落叶小乔木或灌木，主要分布于中国的西南地区及亚洲日本、韩国、印度等地，是重要的油料、香料、药食兼用的生态型经济林树种1-3。青花椒因其果皮具有特殊的麻味，口感幽香绵长，成为我国川渝地区不可或缺的重要调味品而深受消费者的青睐4。同时，青花椒的果实还可用于治疗胃痛、牙痛及发热等症状，具有一定的药用价值5-6。近年来，青花椒以其对高温、干旱和贫瘠等不良环境的良好耐受性和较高的经济价值，成为我国西南地区实施乡村振兴的主推特色经济树种之一2。然而，青花椒抗逆性相关的遗传调控机制暂未可知。现有研究仅报道了红花椒(Zanthoxylum bungeanum Maxim.)38个WRKY转录因子对干旱胁迫的响应模式7，但有关青花椒抗逆基因的研究鲜有报道。因此，探究青花椒抗逆性相关的重要调控基因是提高其适生推广范围，培育优质青花椒种质资源的重要步骤。多蛋白侨联因子(multiprotein bridging factor 1，MBF1)是一种螺旋-转角-螺旋类常见蛋白，作为抗逆过程重要的转录激活因子广泛分布于植物的各类组织部位8，通过在胞质和细胞核内往复穿梭，传递逆境应答信号9。拟南芥 MBF1 家族中包括MBF1a、MBF1b及MBF1c 3个成员10，它们都具有1个灵活可变的N端以及高度保守的螺旋-旋转-螺旋(helix-turn-helix，HTH)结构域11。研究表明，不同物种MBF1家族成员的数量和种类存在差异，常包含 28 个基因，且 MBF1c 是较为常见的组成部分12。据研究记载，MBF1蛋白首次在家蚕(Bombyx mori)中被鉴定为非DNA结合转录辅助因子，其蛋白N端具有与激活蛋白相结合的功能，而C端则有助于蛋白质的折叠以及功能性MBF1蛋白二聚体的形成，从而在转录因子BmFTZ-F1和TATA盒结合蛋白(TBP)之间形成桥梁，组成TATA盒蛋白相关因子(TAF)复合体参与RNA聚合酶II的转录过程13。随后的研究发现，MBF1蛋白在植物的根、茎、叶、花、果实和种子等不同的组织和器官中普遍表达14，但这3种MBF1家族基因在植物生长发育过程中的表达量存在一定差异10,15。马铃薯StMBF1c可以由外源激素SA、MJ和ABA诱导，同时，StMBF1c基因的表达量在青枯病的早期和中期显著上调16。拟南芥AtMBF1c基因的过表达可以将其开花的时间提前并增加结实量17-18。此外，高温、干旱、氧化、盐和病原体等非生物胁迫均能诱导MBF1基因的表达量显著提高，而MBF1基因的过表达也赋予植物对胁迫较强的抗性9。虽然，部分物种已经报道了MBF1基因的相关研究，但青花椒MBF1基因的遗传学信息尚未可知。盐碱、干旱等逆境条件严重制约了植物的生长发育，往往导致植物在生理生化、形态发育等方面受到显著影响19。因此，开展植物逆境响应研究，提高植物抗逆性，有利于提高植物的经济价值。同时，中国是全球第三大盐碱地分布地区，盐碱化土壤约有9.87108 hm2，占世界盐碱地面积的10%左右20，主要分布于东北、华北、西北、长江中下游及滨海等地21。盐碱地对农林植物生长、生理生化、细胞通透性、抗氧化系统以及光合作用等方面都有严重影响22，大大降低了农林植物的生产效益。现阶段，有关花椒耐盐性的研究相对较少。西北农林科技大学魏安智教授团队解析了红花椒在盐处理条件下稳定表达的内参基因23，印度学者分离了青花椒耐盐性相关的内生菌24，但响应青花椒盐胁迫的调控基因暂未可知，青花椒在盐碱地区的栽培适应能力未见报道。此外，近年来西南地区干旱频发，其593四川农业大学学报第 41 卷 范围和强度均呈增长趋势，对社会经济生产影响巨大，且严重危害了生态环境25。植物生长调节剂可通过改变植物形态、植物内化学物质含量等方式提高植物对干旱、水淹、高温以及低温等逆境胁迫的抵御能力26。其中，ABA作为重要的外源因子在植物逆境胁迫过程中发挥着重要作用。外源ABA可以提高植物体内渗透调节物质的含量，增强植物在干旱胁迫下的渗透调节能力27，从而使植物具有一定的抗旱性。因此，开展青花椒对于盐和ABA等外源处理的响应研究，对于提高植物的抗逆性和适生推广范围具有重要意义。本研究以1年生青花椒幼苗为研究材料，从已发表的青花椒基因组数据集中提取ZaMBF1家族成员，综合分析了青花椒ZaMBF1s的核酸与蛋白序列特征，并探究了ZaMBF1家族成员对盐胁迫和ABA处理的响应模式。所获研究结果为进一步解析ZaMBF1基因调控青花椒抗逆性的分子机制，培育优质青花椒种质资源提供了丰富的理论参考和数据支撑。1材料和方法1.1试验材料本研究选取1年生青花椒容器苗作为试验材料，苗高约4050 cm，所有材料放置于中国四川省成都市四川农业大学校内正常培养(北纬30.70，东经103.87)。1.2试验方法1.2.1青花椒ZaMBF1基因家族的筛选和分析本研究从FigShare数据库(https：/doi.org/10.6084/m9.fgshare.14400884.v1)获取青花椒基因组数据28，利用 iTAK_v1.6a 软件进行转录因子分析(https：/ ses)29。随后，从所获转录因子数据集中提取青花椒的ZaMBF1家族基因，并根据其对应的 gff3 文件利用 Seqkit 软件(https：/ ZaMBF1家族基因的CDS和DNA序列30。本研究利用在线生物信息学分析网站解析ZaMBF1 基因的内含子、外显子等基因结构信息(http：/gsds.gao-lab.org)31，利用 TBtools 软件绘制ZaMBF1基因的染色体定位图32。1.2.2青花椒ZaMBF1蛋白序列特征分析本研究利用各类在线生物信息学方法综合剖析了青花椒ZaMBF1家族成员的蛋白序列特征，具体包括：蛋白理化性质(http：/web.expasy.org/protparam/)；蛋白亚细胞定位分析(http：/psort1.hgc.jp/form.html)；蛋白疏水性分析(http：/web.expasy.org/protscale/)；蛋白三维结构预测(https：/swissmodel.expasy.org/)。1.2.3ZaMBF1家族的顺式作用元件与转录因子结合位点分析本研究利用Seqkit软件提取各ZaMBF1基因转录起始位点上游2 000 bp的序列作为启动子区域，利用 Plant-CARE 数据库进行顺式作用元件分析(http：/bioin formatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)33，并重点统计涉及非生物胁迫和植物激素相关的顺式调控元件。ZaMBF1家族中的转录因子(TF)结合位点由植物转录调控图谱网站(http：/plantregmap.gao-lab.org/)预测并分析。1.2.4样本的处理和采集结合已有文献资料，本研究利用 100 mol/L NaCl溶液34和100 mol/L ABA35-36溶液分别喷施青花椒整株叶片，并在处理后0、3、6、9、12和24 h，取长势相近枝条上的叶片，分别用无水乙醇消毒过的剪刀在主干第3至第5个节点，剪取大小和长度基本一致的叶片，并迅速放入液氮中冷冻，采集完成后存放于-80超低温冰箱(Thermo，Waltham，MA，USA)保存备用。各样品采样时，每3株青花椒混合为1份样品重复，共采集3份独立的生物学重复。1.2.5RNA提取和ZaMBF1基因定量检测本研究取0.1 g左右冻存的样品研磨后，使用多糖多酚植物RNA提取试剂盒(Vazyme，南京，中国)按照说明书提取不同处理后各样品的总RNA，并使用PrimeScript first Strand cDNA合成试剂盒(TaKaRa，Japan)反转录后合成cDNA，每份RNA逆转录5份cDNA保存备用。此外，从已发表的基因组数据中提取 ZaMBF1 基因的编码序列，并利用 Primer Premier 5.0软件设计定量PCR检测引物(表1)，送至生工生物工程有限公司(成都，中国)合成引物备用。本 研 究 使 用 荧 光 定 量 PCR 系 统(Bio-Rad CFX96，德国)，以各处理的0 h作为对照样本，以青花椒ZaUBQ作为内参基因23，根据课题组前期青花椒基因荧光定量检测体系5，利用2-Ct法检测所筛选ZaMBF1基因在青花椒不同处理时间点的相对表达量，每个生物学重复设置3次技术重复。随后，利用 Microsoft Excel 2015 和 SPSS 22.0 软件统计和分析数据，利用GraphPad Prism 5绘制所获数据结果的柱形图。594第 4 期王寒葶，等：青花椒抗性基因ZaMBF1家族的生物信息学分析和逆境响应研究2结果与分析2.1青花椒ZaMBF1基因家族的筛选与分析根据青花椒基因组数据集的转录因子分析，本研究共获得3个青花椒ZaMBF1家族成员，拟南芥TAIR10 蛋白比对结果显示，这 3 个基因分别为ZaMBF1a、ZaMBF1b 和 ZaMBF1c(表 2)。其 中，ZaMBF1a 和 ZaMBF1b 基因编码序列长度均为429 bp，共编码142个氨基酸，而ZaMBF1c基因编码序列长度与氨基酸长度分别为453 bp和150 aa。此外，基因结构分析表明(图1)，ZaMBF1基因家 族 ZaMBF1a、ZaMBF1b 和 ZaMBF1c 分 布 于ZaChr26、ZaChr32和ZaChr4这3条不同的染色体。ZaMBF1a 与 ZaMBF1b 的外显子和内含子数量相同：外显子为4，内含子为3。而ZaMBF1c内含子较少，仅有2个外显子和1个内含子，整体基因长度约为ZaMBF1a和ZaMBF1b的三分之一。2.2青花椒ZaMBF1基因家族蛋白序列特征分析为了获取青花椒ZaMBF1家族基因的蛋白序列特征，本研究进行了多种生物信息学分析。结果表明(表3)，青花椒ZaMBF1家族成员的分子量、理论等电点以及不稳定性指数等理化指标差异相对较表1青花椒ZaMBF1基因家族定量检测引物列表Table 1List of primers for RT-qPCR analysis of ZaMBF1 gene family in Z.armatum基因名Gene nameZaMBF1aZaMBF1bZaMBF1cZaUBQ上游引物（5-3）Forward primers（5-3）GCTATCATGCAGGCTCGAACAGCAGGGATTGGACCGATCTCACGCTGAGGTGAGGCAGTTGATACATCGAAGATGGCCGTACATTG下游引物（5-3）Reverse primers（5-3）TCATATTCTTGAATCACCTGAGGCTCCTTCTCGTCTTTCTTCGTAGCGCCTTTTCCATCTTCGTCAAAACATCCTCTAAGCCTCAGCACCA左侧纵坐标为染色体长度，右侧纵坐标为基因长度。The left ordinate shows the chromosome length，and the right ordinate is the gene length.图1青花椒ZaMBF1基因家族基因结构Figure 1Gene structure of the ZaMBF1 gene family in Z.armatum表2青花椒ZaMBF1基因家族成员筛选结果Table 2Screening the members of ZaMBF1 gene family in Z.armatum基因名Gene nameZaMBF1aZaMBF1bZaMBF1c基因编号Gene IDZardc37022Zardc43131Zardc06390基因序列长度Length of gene/bp1 9601 916608编码序列长度Length of CDS/bp429429453氨基酸长度Number of amino acid/aa142142150拟南芥同源基因编号Homologous gene ID of ArabidopsisAT2G42680.1AT3G58680.1AT3G24500.1595四川农业大学学报第 41 卷 小，所有 ZaMBF1 蛋白总体均呈亲水性(图 2ac)。蛋白三维分析结果发现(图2di)，3个ZaMBF1蛋白均检测到MBF1结构域和螺旋-转角-螺旋结构域。其中，ZaMBF1a和ZaMBF1b中观察到类似的3D结构，暗示这些基因可能执行共享功能。而ZaMBF1c的蛋白三维结构具有明显差异，表明其可能与另外两种蛋白的功能存在差异。此外，蛋白亚细胞定位分析结果表明(表4)，3个ZaMBF1蛋白均可能位于细胞质内，而处于叶绿体基质和叶绿体类囊体膜的概率偏低。2.3ZaMBF1基因家族的顺式作用元件与转录因子结合位点分析为了进一步解析ZaMBF1家族可能的分子功能和表达模式，本研究从ZaMBF1基因组数据中分离出转录起始位点上游2 000 bp的启动子区域，预测分析各序列的顺式作用元件(图3)。结果表明，3种基因均存在丰富的响应光照、低温、干旱和低氧等胁迫反应的顺式调控元件。此外，在这些ZaMBF1家族基因的启动子区域中也检测到涉及茉莉酸(MeJA)、水杨酸(SA)等植物抗逆性相关激素的应答结合位点。青花椒ZaMBF1基因家族转录因子结合位点分析发现(图4)，大多数位点与WRKY、Trihelix、NAC、MYB、LBD和C2H2等调控植物逆境胁迫反应的基因家族有关。此外，应答植物抗逆的 ERFs 是ZaMBF1家族序列中最常见的结合位点，暗示乙烯信号通路和ZaMBF1蛋白之间可能存在较为强烈的相互作用。这些证据表明，ZaMBF1基因家族可能在植物对抗环境胁迫过程中发挥了极其重要的调控作用。2.4青花椒ZaMBF1表达量检测与分析经 NaCl 胁迫处理后，ZaMBF1a、ZaMBF1b 和ZaMBF1c的表达量均在3 h和12 h有不同程度的上调，其中ZaMBF1c的上调程度在三者中最高，其表达量在3 h和12 h大约是0 h的18倍和9倍(图5AC)。这些结果表明，ZaMBF1基因家族，尤其是ZaMBF1c基因，在响应盐胁迫过程中发挥着重要作用。同时，青花椒ZaMBF1家族成员对外源ABA处理也有较为明显的响应规律(图5DF)。虽然在ABA处理前期6 h内，ZaMBF1家族成员的表达量未检测到显著差异，但ABA处理后9 h，3者表达量则出现非常明显的上调，直至12 h表达量最高(约为0 h的79倍)，随后逐渐恢复到正常水平。上述结果表明，青花椒ZaMBF1基因家族能够较为明显地响应外源ABA诱导和NaCl胁迫。3讨论通过全基因组层面的转录因子分析，本研究获得了 3 个青花椒 ZaMBF1 基因家族成员，分别为ZaMBF1a、ZaMBF1b和ZaMBF1c。通过分析ZaMBF1家族基因结构发现，ZaMBF1a和ZaMBF1b基因结构具有较高的相似性，而ZaMBF1c的基因结构则与前两者都有一定的差异。此外，本研究发现，ZaMBF1a与ZaMBF1b蛋白序列特征同样具有较高的相似性，而ZaMBF1c蛋白序列特征也与前二者存在显著差异。据文献报道，部分研究将MBF1家族成员分为两大类，其中MBF1c为单独一类9，该结果与本研究内容一致。因此，结合ZaMBF1a和ZaMBF1b的蛋白和基因序列特征，本研究认为它们可能执行了冗余的共享功能，而ZaMBF1c基因相对独立性较高。为了探究不同ZaMBF1基因对外源逆境胁迫的响应模式，明确ZaMBF1家族成员对青花椒抗逆性的重要作用，本研究检测了青花椒幼苗对NaCl和ABA处理不同时间点的表达模式。本研究发现，表3青花椒ZaMBF1基因家族蛋白理化性质分析Table 3Analysis of physicochemical properties of ZaMBF1 in Z.armatum理化指标Physical and chemical index氨基酸数目分子式分子量理论等电点pI总原子数不稳定性指数脂肪族指数总体亲水性ZaMBF1a142C674H1 146N206O212S215 591.899.912 240 31.3783.24-0.792ZaMBF1b142C676H1 149N207O212S315 665.009.912 247 36.0880.49-0.819ZaMBF1c150C726H1 227N221O215S316 588.2610.152 392 46.0883.93-0.732596第 4 期王寒葶，等：青花椒抗性基因ZaMBF1家族的生物信息学分析和逆境响应研究ZaMBF1 基因家族对 2 组处理均有显著的响应规律，且在12 h呈极显著上调，尤其以ZaMBF1c的诱导效果更为明显。与此类似，大麦HvMBF1c基因在受到NaCl胁迫后表达量也呈现显著上调37。百合LlMBF1c基因对于热处理具有高度响应性38。过表达AtMBF1c能够增强拟南芥在高温胁迫下的耐受性17，同时在ABA处理后AtMBF1c的表达量显著上升39。综上可知，MBF1家族成员在不同物种的各类逆境胁迫中均发挥了重要功能，且MBF1c的响应效果最为明显，该结果与本研究内容一致。因此，在后续的研究中，可利用过表达遗传转化和突变体功能验证，重点解析青花椒ZaMBF1c在逆境胁迫中的重要分子功能，为培育抗逆性强、适生范围广的表4青花椒ZaMBF1蛋白亚细胞定位分析Table 4Analysis of the subcellular localization of ZaMBF1s in Z.armatum亚细胞位置Subcellular localization细胞质微体叶绿体基质叶绿体类囊体膜可信度Confidence levelZaMBF1a0.4500.3000.2000.200ZaMBF1b0.4500.3000.1000.000ZaMBF1c0.6500.2000.2000.200ac：ZaMBF1蛋白亲水性分析；di为ZaMBF1蛋白三维结构模型，其中红色为-螺旋（-helix），蓝色为-转角（-turns），黄色为-折叠（-sheets）。a-c：Analysis of hydrophilicity of ZaMBF1s；d-i represent the 3D structural model of ZaMBF1s，with-helix（-helix）in red，-turn angle in blue（-turns）and-fold（-sheets）in yellow.图2青花椒ZaMBF1家族蛋白亲水性分析与蛋白三维结构分析Figure 2Analysis of hydrophilicity and 3D structure of ZaMBF1 proteins in Z.armatum597四川农业大学学报第 41 卷 优质青花椒种质资源奠定丰富的理论基础。此外，为了探究ZaMBF1基因家族参与青花椒抗逆性可能的互作蛋白和遗传调控机制，本研究进一步解析了ZaMBF1s基因的转录因子结合位点和顺势作用元件。已有研究表明，转录因子是一种具有特殊结构且能行使调控基因表达功能的蛋白质分子40。转录因子与基因启动子序列中的顺式元件结合，发挥调控基因的表达，控制植物生长发育以及对环境快速反应的作用41-42。因此，启动子序列上的顺式作用元件是各类转录因子识别并发挥转录调控作用的重要识别位点43。本研究顺式作用元件分析结果发现，青花椒的ZaMBF1基因家族启动ac：分别为ZaMBF1a、ZaMBF1b和ZaMBF1c的顺式作用元件统计结果。其中，柱形图为各类顺式作用元件的数量，横坐标为顺式作用元件数，纵坐标为顺式作用元件种类，饼图为各类顺式作用元件的占比。a-c：The statistical results of cis-acting elements of ZaMBF1a，ZaMBF1b and ZaMBF1c，respectively.The bar chart represents the number of cis-acting elements，the abscissa represents the number of cis-acting elements，the ordinate represents the type of cis-acting elements，and the pie chart represents the proportion of various cis-acting elements.图3青花椒ZaMBF1基因家族的顺式作用元件分析Figure 3Cis-acting elements analysis of the ZaMBF1 gene family in Z.armatum横坐标为3个ZaMBF1基因中转录因子结合位点，纵坐标为不同转录因子结合位点占比。The abscissa is the transcription factor binding sites in the three ZaMBF1 genes，and the ordinate is the proportion of binding sites for different transcription factors.图4青花椒ZaMBF1基因家族转录因子结合位点分析Figure 4Analysis of transcription factor binding sites of the ZaMBF1 gene family in Z.armatum598第 4 期王寒葶，等：青花椒抗性基因ZaMBF1家族的生物信息学分析和逆境响应研究子区域富含低温、干旱和低氧等胁迫反应以及茉莉酸(MeJA)、水杨酸(SA)等响应植物逆境的顺式调控元件，暗示ZaMBF1家族可能显著参与了青花椒应答外源逆境的过程。已有研究发现，茉莉酸(jasmonic acid，JA)是普遍存在于植物体内的一种植物激素，能促使细胞中的初生代谢向次生代谢转变，可激发植物产生防御反应，诱导抗病和抗逆相关基因表达44。而水杨酸(salicylic acid，SA)是提高植物抗病的关键激素之一，SA可作为植物抗逆反应所需的信号分子来激活植物防御保护机制，在植物抗逆过程中起着关键作用26。此外，ZaMBF1家族的编码序列上共有 382 个转录因子结合位点，包括WRKY、Trihelix、NAC、MYB、LBD和C2H2等。研究表明，WRKY可在植物受到外界环境胁迫时，通过诱发各类免疫与防御机制提高自身的抗逆能力45-46。Trihelix在参与光调控、植物形态建成以及对生物和非生物胁迫应答等方面发挥着重要的作用47。NAC、LBD和C2H2在植物的生长发育及逆境调节等生理活动中起着关键作用48-50。MYB通过调节 ABA 和 MAPK 信号转导途径提高植物的抗逆性51。综合上述分析结果可知，青花椒ZaMBF1基因家族可能在植物抗逆性过程中发挥着显著的调控作用。在后期研究中，可利用酵母单/双杂交，双萤光素酶检测系统等现代分子遗传学方法，进一步解析青花椒ZaMBF1家族参与植物抗逆性的互作蛋白和上游调控因子，为揭示青花椒抗逆性的分子机制提供数据参考。4结论本研究重点解析了青花椒ZaMBF1基因家族成员的蛋白理化性质、蛋白三维结构、亚细胞定位、转录因子结合位点以及启动子区域的顺式作用元件，并利用荧光定量PCR技术检测了青花椒对NaCl胁迫和ABA处理的应答模式。青花椒的ZaMBF1基横坐标为处理后不同时间，纵坐标为相对于0 h的表达量。不同小写字母代表显著差异，P0.05。The abscissa is different times after treatment，the ordinate is expression relative to 0 h，and different lower case letters represent significant differences at P0.05 level.图5不同处理下ZaMBF1基因的响应模式分析Figure 5Analysis of the response patterns of ZaMBF1 genes under different treatments599四川农业大学学报第 41 卷 因家族具有 3 个成员，其中 ZaMBF1a 和 ZaMBF1b相似性较高。生物信息学预测分析结果显示，所有成员均为定位于细胞质且具有亲水性的不稳定蛋白，富含WRKY、bHLH以及ERF等抗逆相关调控通路的结合位点。此外，青花椒ZaMBF1基因家族对NaCl和ABA诱导均有显著响应，且在12 h存在明显上调，且ZaMBF1c的响应效果相对最为明显。本研究所获结果为培育抗逆性强、适生范围广的优质青花椒种质资源提供了基因来源和理论基础。参考文献：1 FENG S J，LIU Z S，HU Y，et al.Genomic analysis reveals the genetic diversity，population structure，evolutionary history and relationships of Chinese pepperJ.Horticulture Research，2020，7：158.2 DONG Z F，ZHAO X L，LIU J J，et al.Detection and simultaneous differentiation of three co-infected viruses in Zanthoxylum armatum J.Plants，2022，11（9）：1242.3 OKAGU I U，NDEFO J C，AHAM E C，et al.Zanthoxylum species：a comprehensive review of traditional uses，phytochemistry，pharmacological and 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