玉米KNOX基因家族鉴定及表达分析_王纪良.pdf

研究报告Research Report玉米 KNOX基因家族鉴定及表达分析王纪良姬祥卓金兵兵陈奋奇白明兴彭云玲*甘肃农业大学农学院,甘肃省干旱生境作物学重点实验室,甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室,兰州,730070*通信作者,摘要KNOX基因家族存在于大部分植物体中，是同源异型盒基因家族的一类，其编码的转录因子参与调控植物的模式形成、形态建成等生理活动。用含有 KNOX结构域的隐马尔可夫模型文件(PF03790,PF03791)作为探针结合 Hmmsearch 软件，对玉米(Zea mays L.)基因组中 KNOX家族成员进行了鉴定，并对其理化性质、亚细胞定位、系统进化树、基因在染色体定位、顺式作用元件和组织特异性表达模式进行了分析。通过hmmer 搜索鉴定出 16 个玉米 KNOX 基因，其蛋白的氨基酸数在 154484 之间，分子量在 16.352.9 kD 之间，等电点在 4.337.74 之间，其成员基因主要位于细胞核。根据玉米和拟南芥 KNOX 基因进化树分析，可将其分为 2 个进化分支。染色体定位结果表明，玉米 KNOX基因家族的 16 个家族成员分布于 9 条不同染色体。1 号染色体(Chr.01)分布 6 个成员，其中 2 个成员基因为串联重复基因。除 ZmKNOX8 和 ZmKNOX9 外，所有成员启动子区域都存在多个响应激素、光和逆境信号的 cis-element。此外，ZmKNOX14 和 ZmKNOX15 在嫩叶中表达量最高，可能与玉米叶细胞中次生细胞壁沉积作用有关。本研究为进一步了解 KNOX 的进化特征和功能提供参考。关键词玉米;KNOX;基因家族;生物信息学分析Identification and Expression Analysis of KNOX Gene Family in MaizeWang JiliangJi XiangzhuoJin BingbingChen FenqiBai MingxingPeng Yunling*Gansu Key Lab of Crop Improvement and Germplasm Enhancement,Key Laboratory of Arid Land Crop Science in Gansu Province,College of Agron-omy,Gansu Agricultural University,Lanzhou,730070*Corresponding author,DOI:10.13271 j.mpb.021.000708AbstractThe KNOX gene family exists in most plants and is a type of homeobox gene family.The transcriptionfactors encoded by it are involved in the regulation of plant pattern formation,morphogenesis and other physiologi-cal activities.Using the hidden Markov models(PF03790,PF03791)of the KNOX domain as probes,combinedwith hmmsearch software,the KNOX family members in the maize(Zea mays L.)genome were identified,andtheir physicochemical properties and subcellular location,Phylogenetic tree,gene location on chromosome,cis-el-ement and tissue-specific expression patterns were analyzed.A total of 16 maize KNOX genes were identified.Thenumber of amino acids in their protein ranges from 154 to 484,the molecular weight ranges from 16.3 to 52.9 kD,and the isoelectric point ranges from 4.33 to 7.74.The member genes are mainly located in the nucleus.Accordingto the analysis of the phylogenetic tree of KNOX genes in maize and Arabidopsis,they can be divided into two evo-lutionary branches.The chromosomal mapping results showed that the 16 maize KNOX genes family are distribut-ed on 9 different chromosomes.Chromosome 1(Chr.01)has 6 members,2 of which are tandem repeat genes.基金项目：本研究由国家级抗旱高产优质玉米新品种育种繁植与推广委托项目(XZ20200810)、中科院“西部之光”项目(20180504)和甘肃省玉米产业技术体系项目(GARS-02-04)共同资助引用格式：Wang J.L.,Ji X.Z.,Jin B.B.,Chen F.Q.,Bai M.X.,and Peng Y.L.,2023,Identification and expression analysis of KNOXgene family in maize,Fenzi Zhiwu Yuzhong(Molecular Plant Breeding),21(3):708-716.(王纪良,姬祥卓,金兵兵,陈奋奇,白明兴,彭云玲,2023,玉米 KNOX基因家族鉴定及表达分析,分子植物育种,21(3):708-716.)分子植物育种，2023 年，第 21 卷，第 3 期，第 708-716 页Molecular Plant Breeding,2023,Vol.21,No.3,708-716植物 KNOX(Knotted1-like homeobox)基因是同源异型盒基因家族(Homeobox gene family)中的一类(李春苑等,2009)。同源异型盒基因家族(Homeoboxgene family)成员编码产生的转录因子含有典型的同源异形盒结构域，这些转录因子广泛参与调控植物的模式形成、形态建成等活动(Gehring et al.,1994;Williams,1998;Mukherjee et al.,2009;Mallo et al.,2010)。典型的同源异型盒结构域由一个高度保守的长度为 180 bp 的 DNA 序列构成(Billeter et al.,1993)。在植物中，根据同源异型盒基因的系统发育关系和结构特征可将其分成 14 个类别，其中 HD-ZIP、HD-ZIP、HD-ZIP、HD-ZIP 属于 HD-ZIP 超家族，剩余 10 类除了具有同源异型盒结构域外，还具有其特征性的保守结构域(Mukherjee et al.,2009)。KNOX和 BEL 基因家族属于 TALE(Threeamino-acidloop extension)同源异型盒蛋白超家族(Chen et al.,2003;Hamant and Pautot,2010)。KNOX基因家族存在于大部分植物中(Mukher-jee et al.,2009)，根据结构域不同可将其分为 4 种类型：KNOX1、KNOX2、ELK 和 Homeobox KN(Finn etal.,2016)。根据 KNOX 基因的结构特征、表达方式以及进化树分析，又可分成两个亚家族：Class和Class，它们在植物生长发育过程中发挥着不同的调控作用(Kerstetter et al.,1994)。Class亚家族基因是维持和形成植物分生组织的一类重要基因，主要在植物的顶端分生组织表达，通过调控与植物器官形成相关的细胞分化，最终影响侧生器官形态建成(Vollbrecht et al.,2000;Tsuda et al.,2011)。与 Class相比，Class亚家族基因的表达部位相对广泛，在植物各器官中均有表达，它们主要参与调控植物器官分化以及次级细胞壁的生物合成(Li et al.,2011;2012;Furumizu et al.,2015)。玉米(Zea mays L.)是全球也是中国第一大作物，其产量在保障国家粮食安全中占有重要地位(赵久然等,2016,生物产业技术,(3):45-52)。玉米 KN1(Knotted-1)基因是植物中第一个被发现的同源异型盒基因(Vollbrecht et al.,1991)，随后在多种植物中鉴定出 KNOX 基因。例如，在拟南芥(Mukherjee et al.,2009)、水稻(Mukherjee et al.,2009)、番茄(叶曙光等,2017)和毛竹(徐秀荣等,2018)中分别鉴定出 8、13、8和 12 个 KNOX基因。研究玉米的 KNOX基因家族，有利于初步了解该家族基因在不同物种之间的进化关系及挖掘 KNOX基因家族的功能。目前，KNOX基因家族在玉米中尚未报道，本研究在全基因组水平对玉米 KNOX基因家族成员进行了分析，共鉴定和注释出 16 个玉米 KNOX 基因，并对其理化性质、亚细胞定位、系统进化树、染色体定位、cis-element 和组织特异性表达模式进行了分析。以期为进一步了解KNOX 的进化特征和功能提供参考。1结果与分析1.1玉米KNOX基因鉴定通过 hmmer 搜索并手动筛选含有 KNOX 结构域的基因，最终鉴定出 16 个玉米 KNOX 基因，其蛋白的氨基酸数在 154484 之间，分子量在 16.352.9kD之间，等电点在 4.337.74 之间(表 1)。WoLF PSORT 亚细胞定位预测结果显示 15 个KNOX 基因位于细胞核，ZmKNOX5 基因同时位于细胞核、线粒体和细胞质中，1 个(ZmKNOX9)基因位于质膜；CELLO v.2.5 软件预测结果表明 14 个 KNOX基因位于细胞核，1 个(ZmKNOX9)基因位于细胞质，1个(ZmKNOX11)基因位于线粒体(表 1)。1.2玉米KNOX基因进化分析对玉米和拟南芥 KNOX基因家族成员的氨基酸序列进行了多序列比对和进化树构建(图 1)。结果表明，可将两个物种的 KNOX 分为个进化分支，即Class和 Class，Class包含 4 个拟南芥和 11 个玉米 KNOX、Class包含 4 个拟南芥和 5 个玉米KNOX。1.3玉米KNOX基因染色体定位染色体定位结果表明，玉米 KNOX基因家族的16 个家族成员分布于 9 条不同染色体上。其中，1 号染色体(Chr.01)上分布有 6 个家族成员，分布成员数量最多。5 号(Chr.05)和 9 号(Chr.09)染色体分别分布Except for ZmKNOX8 and ZmKNOX9,there are multiple cis-element responses to hormones,light and stress sig-nals in the promoter regions of all members.In addition,ZmKNOX14 and ZmKNOX15 expressed the highest levelsin young leaves,which may be related to the deposition of secondary cell walls in maize leaf cells.This study pro-vides a reference for further understanding of the evolutionary characteristics and functions of KNOX.KeywordsMaize;KNOX;Gene family;Bioinformatics analysis玉米 KNOX 基因家族鉴定及表达分析Identification and Expression Analysis of KNOX Gene Family in Maize709分子植物育种Molecular Plant Breeding图 1 拟南芥(AT)和玉米(Zm)的 KNOX 系统进化树Figure1PhylogenetictreeofKNOXs in Arabidopsis thaliana(AT)and maize(Zm)表 1 玉米 KNOX 理化性质,亚细胞定位Table 1 Physical and chemical characteristics,subcellular localization of KNOX genes in maize注:Nu:细胞核;Mt:线粒体;Cyto:细胞质;PM:质膜;a 和 b 表示基因亚细胞定位分别利用在线软件 WoLFPSORT 和 CELLO v.2.5分别预测Note:Nu:Nucleus;Mt:mitochondrion;Cyto:Cytoplasm;PM:Plasmamembrane;a and b indicated the subcellular localization of genewere predicted by using online software WoLF PSORT and CELLO v.2.5基因名称Gene nameZmKNOX1ZmKNOX2ZmKNOX3ZmKNOX4ZmKNOX5ZmKNOX6ZmKNOX7ZmKNOX8ZmKNOX9ZmKNOX10ZmKNOX11ZmKNOX12ZmKNOX13ZmKNOX14ZmKNOX15ZmKNOX16基因登录号Gene accession No.Zm00001d018742Zm00001d007842Zm00001d034212Zm00001d033859Zm00001d033861Zm00001d040611Zm00001d010948Zm00001d035439Zm00001d030994Zm00001d033404Zm00001d013559Zm00001d048471Zm00001d027431Zm00001d046568Zm00001d053749Zm00001d015549氨基酸数AA size351205484359360154307298425207163318310316304325分子量(kD)Molecularweight(kD)38.8021.3052.9039.8339.6416.3033.3332.6647.4423.3918.0134.7734.3434.5232.9835.65等电点Isoelectric point6.897.126.516.916.464.715.045.144.907.744.335.906.055.976.526.68亚细胞定位SubcellularlocalizationNua,bNua,bNua,bNua,bMta;Nua,b;CytoaNua,bNua,bNua,bPMa;CytobNua,bNua;MtbNua,bNua,bNua,bNua,bNua,b结构域组成Domain compositionKNOX1,KNOX2,ELK,HOXKNOX1,KNOX2KNOX1,KNOX2,ELK,HOXKNOX1,ELK,HOXKNOX1,KNOX2,ELK,HOXKNOX1,KNOX2KNOX1,KNOX2,ELK,HOXKNOX1,KNOX2,ELK,HOXKNOX2KNOX2,ELK,HOXKNOX1,KNOX2KNOX1,KNOX2,ELK,HOXKNOX1,KNOX2,HOXKNOX1,KNOX2,ELK,HOXKNOX1,KNOX2,ELK,HOXKNOX1,KNOX2,ELK,HOX有 2 个家族成员。2 号(Chr.02)、3 号(Chr.03)、4 号(Chr.04)、6 号(Chr.06)、7 号(Chr.07)和 8 号(Chr.08)染色体分别仅分布 1 个家族成员。玉米 KNOX基因家族成员中，ZmKNOX4 和Zm-KNOX5 分布于 1 号染色体，且相邻物理距离为21.26 kb，推断其为串联重复基因簇(Flagel and Wen-del,2009)。1.4 cis-element分析为了解 KNOX家族成员响应的信号，对其启动子区域响应激素、光和逆境信号的 cis-element 进行了预测(表 2)。除 ZmKNOX8 和 ZmKNOX9 外，其余所有成员启动子区域都存在多个响应激素和逆境信号的 cis-element。其中，9 个 KNOX 成员启动子区域存在响应脱落酸(abscisic acid,ABA)、7 个 KNOX 成员启动子区域响应生长素(auxin,IAA)、5 个 KNOX 成员启动子区域响应赤霉素(gibberellins,GA)，12 个KNOX 成员启动子区域响应茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)，4 个 KNOX 成员启动子区域响应水杨酸(salicylic acid,SA)，5 个 KNOX 成员启动子区域响应玉米素(Zeatin)。此外，分析发现 KNOX 启动子区域还存在多个响应植物防御和逆境信号的顺式作用元件，如防御和逆境(Defense and stress)存在于 5 个 KNOX 成员启动子区域，响应干旱(Drought)和低温(Low-tempera-710ture)胁迫的顺式作用元件分别存在于 7 个和 6 个KNOX 成员启动子区域。除 ZmKNOX8 和 ZmKNOX9外，其余成员启动子区域都存在响应光信号的 cis-el-ement。1.5组织特异性表达分析根据进化树分析结果，选取各进化分支代表基因共 11 个成员，利用荧光定量技术分析验证 11 个KNOX 基因在玉米根、老叶、嫩叶和中胚轴中的表达情况，获得其表达数据。数据表明，KNOX 基因在玉米各组织中有不同程度的表达(图 3)。其中，ZmKNOX12、ZmKNOX14 和 ZmKNOX15在各组织中有较高的表达量，ZmKNOX3、ZmKNOX4、ZmKNOX5、ZmKNOX6 和 ZmKNOX9 在各组织中表达量 较 低。ZmKNOX1、ZmKNOX3、ZmKNOX4、Zm-KNOX5、ZmKNOX6 和 ZmKNOX7 这 6 个基因均在中胚轴中表达量多于其他组织。ZmKNOX9 在各个组织中的表达量都较低。ZmKNOX12 在嫩叶、根和中胚轴中有较高的表达量，却在老叶中表达量较低。Zm-KNOX10、ZmKNOX14 和 ZmKNOX15 存在相似的表达模式，它们均在根中表达量最少，而在嫩叶中表达量最高。2讨论本研究在基因组范围内鉴定了玉米 KNOX 基因，共鉴定得到 16 个玉米 KNOX 家族成员，多于拟南芥(8 个)和水稻(13 个)的 KNOX 家族成员数，少于亚洲棉(23 个)(孙润润等,2019)和大豆(27 个)(李方正等,2012)的 KONX 家族成员，说明不同植物KNOX基因家族成员数量有较大差异。通常，基因重复是造成这种差异的主要原因，如部分重复和串联重复等(Flagel and Wendel,2009)。进化分析表明，玉米KNOX 中存在多个相似度高于 90%的基因，推断其为同源基因。然而，染色体位置分析表明仅有 2 个成员为串联重复。据此推断，玉米 KNOX 基因家族数目的扩增主要由部分重复导致。对拟南芥和玉米基因构建进化树分析，分析结果表明玉米的进化分支数也是 2 个，和其他植物进化分支数一致，表明多种植物中存在 2 个 KNOX 亚家族，即 Class 和 Class。拟南芥 KNOX 基因 Class亚家族有 4 个成员(KNAT1,KNAT2,KNAT6 和 STM)，玉米 Class亚家族有 11 个成员基因；拟南芥 KNOX 基因 Class亚家族也有 4 个成员(KNAT3,KNAT4,KNAT5 和KNAT7)，玉米 Class 亚家族基因成员数为 5，玉米 KNOX基图 2 玉米 KNOX 基因的染色体定位注:染色体左侧的数字代表基因与相邻基因或染色体起始(终止)位点间的物理距离(Mb);相邻 KNOX 间的物理距离小于 100 kb,为串联重复基因Figure 2 Chromosomal distribution of KNOX genes in maizeNote:Number in left side of chromosome indicated physical distance between a gene to adjacent gene or chromosomal starting(end-ing)site(Mb);The physical distance between adjacent KNOX is less than 100 kb,which is a tandem repeat gene玉米 KNOX 基因家族鉴定及表达分析Identification and Expression Analysis of KNOX Gene Family in Maize711分子植物育种Molecular Plant Breeding表 2 玉米 KNOX 基因启动子区对植物生长调节剂和逆境响应的顺式元件Table 2 cis-elements in response to hormone and stresses in promoter region of ZmKNOXs基因GeneZmKNOX1ZmKNOX2ZmKNOX3ZmKNOX4ZmKNOX5ZmKNOX6ZmKNOX7ZmKNOX10ZmKNOX11ZmKNOX12ZmKNOX13ZmKNOX14ZmKNOX15ZmKNOX16脱落酸ABA46-2-153223生长素Auxin21-1-1-111-赤霉素GA3-21-1-1-茉莉酸甲酯MeJA684222-262844-水杨酸SA1-2-1-1-玉米素Zeatin-1-11-11-光Light81373236616491防御和逆境Defense and Stress-1-11-11干旱Drought-2-131-21-1-低温Low-temperature11-12-21-因家族成员数量在 2 个分支中均多于拟南芥，说明在进化过程中玉米 KNOX 基因家族 Class 亚家族和 Class 亚家族成员均发生数量的扩增，Class亚家族的扩增数量要高于 Class，由此推断 KNOX家族 Class亚家族基因可能更容易发生基因重复。拟南芥和玉米的 KNOX 基因家族系统发育进化树表明，ZmKNOX4 和 KNAT1 有较高的同源性，Zm-KNOX14、ZmKNOX15、ZmKNOX16 和 KNAT3、KNAT4、KNAT5 具有较高同源性，它们之间可能具有相似的功能。玉米 KNOX 基因家族各成员的保守结构域存在差别，9 个成员基因含有 KNOX1、KNOX2、ELK 和HOX 这 4 个结构域，而其他 7 个成员基因缺少部分结构域，如 ZmKNOX13 缺失 ELK 结构域，ZmKNO-X2、ZmKNOX6 和 ZmKNOX11 缺失 ELK 和 HOX 结构域，ZmKNOX9 仅有 KNOX2 结构域，这些缺失部分保守结构域的基因可能是假基因，编码不完整的蛋白质，这种现象已经出现在许多植物基因家族进化过程中(Song et al.,1997;McDowell et al.,1998;Liu andEkramoddoullah,2004)，而且在植物的进化过程中，这些假基因为进化成新的基因提供可能性(Michel-more and Meyers,1998;Nair and Thomas,2007)。顺式作用元件(cis-element)是转录因子的结合位点，它们通过结合转录因子从而调控基因转录的精确起始和转录效率，顺式作用元件会影响基因的表达调控(李濯雪和陈信波,2015)。前人研究表明KNOX基因家族成员通过调控与植物器官形成相关的细胞分化，从而对植物生长发育中器官形态建成产生影响。cis-element 预测结果表明，玉米 KNOX基因家族成员启动子区域存在多个响应激素的顺式作用元件，这些元件广泛响应脱落酸、生长素、赤霉素、茉莉酸甲酯、水杨酸和玉米素，这些被响应的激素广泛不仅参与植物的生长发育，还在逆境响应过程中起重要的调控作用。其中，ABA 在植物响应多种非生物胁迫如干旱中的重要作用已被证实(Fujita et al.,2005)。JA 是调控植物抵抗生物胁迫的重要信号分子(Robert-Seilaniantz et al.,2001)。此外，本研究结果发现 KNOX 基因启动子区域还存在多个响应植物防御和逆境信号的顺式作用元件，这表明 KNOX 基因可能参与玉米对生物或非生物逆境的适应调控。除ZmKNOX8 和 ZmKNOX9 外，其余成员启动子区域都存在响应光信号的 cis-element。说明 KNOX 基因广泛参与玉米植株光形态建成。通过对 KNOX 家族在玉米不同组织中基因表达量分析可得，家族不同成员均呈现组织特异表达。其 中，ZmKNOX1、ZmKNOX3、ZmKNOX4、ZmKNOX5、ZmKNOX6 和 ZmKNOX7 这 6 个基因均在中胚轴中表达量高于其他组织，它们都属于 Class亚家族，根据前人研究(Vollbrecht et al.,2000;Tsuda et al.,2011)，Class亚家族基因是维持和形成植物分生组织的一类重要基因，主要表达于植物的顶端分生组织中。由此可推测 ZmKNOX Class 亚家族可以通过调控中胚轴细胞的分化，最终影响玉米中胚轴的形态建成。ZmKNOX12、ZmKNOX14 和 ZmKNOX15 在各组织中712图 3 ZmKNOX 组织特异性表达分析注:差异显著性分析用 t-test 法统计;*:P0.05;*:P0.01;R:根;OL:老叶;YL:嫩叶;Mes:中胚轴Figure 3 Tissue specific expression analysis of ZmKNOXNote:t-test was used to analyze the difference significance;*:P0.05;*:P0.01;R:Root;OL:Old leaf;YL:Young leaf;Mes:Me-socotyl均有较高的表达量，它们 3 个基因属于 Class 亚家族，这与前人研究的 Class 亚家族基因的表达部位较广泛这一现象相吻合(Li et al.,2011;2012;Furu-mizu et al.,2015)，同时，ZmKNOX14 和 ZmKNOX15在嫩叶中的表达量较高，且与拟南芥 KNAT3 和KNAT4 亲缘关系较近，由拟南芥基因功能推测(Wang et al.,2020)，ZmKNOX14 和 ZmKNOX15 可能参与玉米叶细胞中次生细胞壁沉积作用，进而影响玉米叶片的生长发育。综上所述，与拟南芥相比，玉米 KNOX基因家族成员数目发生了较为明显的扩增现象，其主要由部分重复导致。多个成员基因缺少部分保守结构域，可能是假基因，为进化成新的基因提供可能性。多个家族成员可能参与玉米发育和逆境适应过程，其中玉米 KNOX Class亚家族基因在中胚轴中表达量高于其他组织，表明其与中胚轴发育存在密切关系;Zm-KNOX14 和 ZmKNOX15 可能与玉米叶细胞中次生细胞壁沉积作用有关，将来可进一步深入研究。3材料与方法3.1试验材料玉米自交系品种 B73 由甘肃农业大学农学院玉米课题组提供。3.2玉米KNOX基因家族成员的鉴定本研究通过构建隐马尔可夫模型(hidden mar-kov models,HMM)的方法搜索玉米中 KNOX 基因家族成员。首先从 Ensembl(http:/plants.ensembl.org/index.html)数据库下载玉米 B73 第 4 版基因组数据，然后从 Pfam 31.0 database(http:/pfam.xfam.org/)中下载含有 KNOX 结构域的隐马尔可夫模型文件，其登录号为 PF03790，PF03791，结合本地化 HMM(http:/www.hmmer.org/)的 Hmmsearch 软件搜索玉米中候选 KNOX 基因家族成员，阈值为 E1e-5。将搜索到的基因用 SMART(http:/smart.embl-heidelberg.de/)、NCBI CDD(https:/www.n cbi.nlm.nih.gov/cdd/)和 pfam(http:/pfam.xfam.org/)等在线软件确定候选成员中是否含有 KNOX 结构域。以上筛选确定的玉米 KNOX家族基因用于进一步的分析研究。3.3玉米KNOX基因家族的生物信息学分析通过 ExPASy ProtParam(https:/web.expasy.org/protparam/)在线软件对筛选出的玉米 KNOX基因家族进行理化性质分析。利用在线软件 WoLF PSORT玉米 KNOX 基因家族鉴定及表达分析Identification and Expression Analysis of KNOX Gene Family in Maize713分子植物育种Molecular Plant Breeding表 3 Real-time PCR 反应体系Table 3 Real-time PCR reaction system试剂ReagentTB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2)PCR Forward Primer(10 mol/L)PCR Reverse Primer(10 mol/L)ROX Reference Dye(50)cDNA TemplateddH2O总计Total使用量(L)Usage amount(L)10.00.80.80.42.06.020.0(https:/wolfpsort.hgc.jp/)和 CELLO v.2.5(http:/cello.life.nctu.edu.tw/)分别预测 KNOX 基因家族的亚细胞定位。对拟南芥和玉米 KNOX 基因进行氨基酸序列比对及进化分析：首先利用软件 ClustalX2.0 对 KNOX基因氨基酸进行多序列比对(Larkin et al.,2007)，然后用软件 MEGA 7.0(http:/)，以近邻结相邻(neighbor-joining,NJ)构建系统进化树。执行参数为泊松模型(Poission Model)和 1 000 次重复有根树(Bootstrap replicated 1 000 times)。玉米 KNOX 染色体位置信息和启动子区域序列(上游 1 500 bp)下载自玉米基因组网站 MaizeGDB(https:/www.maizegdb.org/)，利用软件 MapDraw 进行染色体物理位置可视化分析(刘仁虎和孟金陵,2003)。玉米 KNOX 基因家族顺式作用元件(cis-ele-ment)预测：在玉米基因组网站 MaizeGDB(https:/www.maizegdb.org/)下载玉米 KNOX 基因家族的启动子区域序列(-1 500-1 bp)，利用在线数据库 PlantCARE(http:/bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plan-tcare/html/)预测玉米 KNOX 基因家族顺式作用元件(Lescot et al.,2002)。3.4玉米材料与处理挑选籽粒大小一致的 B73 种子，用次氯酸钠(0.5%)消毒 10 min，消毒完成后用蒸馏水冲洗 3 次至完全冲洗掉种子表面所残留的次氯酸钠，然后将种子表面的附着水用滤纸吸干。最后用蒸馏水浸种24 h 后播种于盛有蛭石的塑料花盆中，每盆播 5 粒种子，共种植 4 盆。置于人工模拟气候培养箱内进行培养(光照/黑暗 14 h/10 h,温度 25/20,光照强度 500 mol m-2 s-1,相对湿度 60%)。在三叶一心期时进行采样，分别采取幼苗的根、中胚轴、未完全展开的第四叶作为嫩叶和完全展开的第一片叶作为老叶。3.5基因表达分析按照 RNA 试剂盒(Tiangen,Shanghai,China)的提取步骤，分别提取根、老叶、嫩叶和中胚轴的总RNA，用凝胶电泳和超微量分光光度计(P200+,Plex-tech,USA)检测 RNA 质量。提取的总 RNA 用FastK-ing cDNA(Tiangen,Shanghai,China)反转录为 cDNA。使用 SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(Tiangen,Shanghai,China)，在 QuantStudio 5 Real-Time PCR 仪(Thermo Scientific,Massachusetts,USA)上进行荧光定量分析，PCR 反应体系已列出(表3)。引物设计使用DNAMAN 软件，内参基因 Actin 引物，KNOX 基因引物序列已列出(表 4)。PCR 反应结束后运用 2-Ct方法表 4 KNOX 引物序列Table 4 Primer sequence of KNOX基因登录号Gene accession No.ActinZm00001d018742Zm00001d034212Zm00001d033859Zm00001d033861Zm00001d040611Zm00001d010948Zm00001d030994Zm00001d033404Zm00001d048471Zm00001d046568Zm00001d053749正向引物(5-3)Forward primer sequence(5-3)TTGAGGTAGGATGAGACTGGTGGGAGCTGCACTACAAGGAGGACAAGGAGCTCAAGCACTTTCCATCTCCGGAAGGTCGCGCAGCTCAACTCCATTACCGCTACAAGGAGGAGCTGACAGCTGAAGGAGATGCTGCTGGGGTGATGATGCTGACCAGTCTCCGACGAAGATGAGCAAGACACCACCAGCATCCTCAAGCCTGGCGACACTGCTTCTACAACAGAGGGTGAACGGTCCT反向引物(5-3)Reverse primer sequence(5-3)GGAGTGAAGCAGATGATTCCGTTTCCTCTGGTTGATGAGGCCACTTGTAGTGCAGCTCGCTCTTGGTCCACACCATGTTGAGGAGCTGCTTCTTGAGCTTTCCTTTCCTCACCGGAGTAGCCTCACCTTGTCCTCCTCTTGACATAGACCGGCACCTCTCCAGAGGCTGCTCAGGTAGAGGGTTGACGTCTGGGAGTTTTTTGTCCGACGAGGATGACGTTTGCGCATGATCTCTTCC714(Livak and Schmittgen,2001)计算基因的相对表达量。3.6统计分析用 Microsoft Excel 软件整理