响应面法优化樱桃酵素的发酵工艺及抗氧化活性研究_王缎.pdf

响应面法优化樱桃酵素的发酵工艺及抗氧化活性研究王 缎，崔国庭，刘盈盈（河南科技大学，河南 洛阳 471003）摘 要：目的 研究樱桃酵素的发酵工艺和部分生物活性。方法 以超氧化物歧化酶（SOD）活性为响应值，采用单因素实验和Box-Behnken响应面设计优化樱桃酵素的发酵工艺，进一步测定樱桃酵素OH、DPPHO2清除能力和还原力等体外抗氧化能力，及SOD、脂肪酶和淀粉酶的活性。结果 采用酵母菌接种量1.1%、29条件下发酵12 h，获得樱桃酵素含有大量的SOD和少量的脂肪酶和淀粉酶，其中SOD活性最高可达40.76 U/ml；樱桃酵素DPPH自由基清除率最高可达91.45%，OH清除率和O2清除率初期达77.67%和75.04%，还原力为0.349，樱桃酵素的抗氧化活性随贮藏时间延长呈下降趋势。结论 本研究通过优化樱桃酵素的发酵工艺，并研究其抗氧化活性和酶活性，为樱桃的精深加工和综合开发利用提供了技术参考。关键词：樱桃酵素；Box-Behnken；抗氧化；超氧化物歧化酶中图分类号：TS255.3 TQ925 文献标识码：A 文章编号：1672-979X（2023）01-0013-05DOI：10.3969/j.issn.1672-979X.2023.01.003Optimization of Fermentation Technology and Antioxidant Activity of Cherry Enzyme by Response Surface MethodologyWANG Duan,CUI Guo-ting,LIU Ying-ying（Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China）Abstract:Objective To study the fermentation technology of cherry enzyme and some biological activities of cherry enzyme.Methods Using SOD activity as the response value,the fermentation process of cherry enzyme was optimized by single factor experiment and Box-Behnken response surface design.The scavenging ability and reducing power of OH,DPPH and O2were further determined,as well as the activities of SOD,lipase and amylase in vitro.Results The cherry enzyme containing a large amount of SOD and a small amount of lipase and amylase were obtained by using 1.1%yeast inoculation and fermentation at 29 for 12 h.The highest activity of SOD was 40.76 U/ml.The maximum DPPH free radical scavenging rate was 91.45%,the OH and O2scavenging rate was 77.67%and 75.4%at the initial stage,and the reducing power was 0.349.With the extension of storage time,the antioxidant activity of cherry enzyme decreased.Conclusion In this study,the fermentation process of cherry enzyme was optimized,and its antioxidant activity and enzyme activity were studied,which can provide technical reference for the intensive processing,comprehensive development and utilization of cherry.Key Words:cherry enzyme;Box-Behnken;antioxidant activity;SOD收稿日期：2021-12-14作者简介：王缎，硕士，研究方向为果蔬加工，E-mail:樱桃果实色泽鲜艳、酸甜可口、营养丰富，含有多种维生素和矿物元素，还有酚类、花色苷、黄酮、褪黑素（N-乙酰-5-甲氧基色胺）、谷胱甘肽和番茄红素等生物活性物质1-3。樱桃所含的生物活性成分能清除机体中的过量自由基，保护机体免受自由基伤害，有促进血液循环、抗氧化、健脑益气、抗病毒等多种生理功效，具有很高的营养价值和食疗作用4-5。由于樱桃含水量高、果皮薄，采收期正值高温季节，采后呼吸旺盛、不耐贮运，易受机械损伤和微生物侵染而腐烂变质，造成经济损食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第1期 13失6，成为限制樱桃产业大规模发展的瓶颈。因此，樱桃产品的深加工是解决目前樱桃产业困境的方法之一。目前，国内外常见的樱桃加工产品有樱桃罐头7、果酒8、果汁9、果醋10、果脯11、果酱12等。食用植物酵素是以植物为原料，经微生物发酵制得含有特定生物活性成分的可食用的酵素产品，2017年中国生物发酵产业协会发布食用植物酵素标准13，2018年轻工业部颁布植物酵素的行业标准，明确了食用植物酵素的概念、感官标准和特征指标14。研究表明，植物酵素含有多种生物活性成分，如淀粉酶、脂肪酶、超氧化物歧化酶（SOD）等大分子物质，多酚类化合物、有机酸、-氨基丁酸、游离氨基酸等小分子化合物，具有抗氧化、抗衰老、增强身体免疫力等保健功能15-16。将樱桃制成樱桃酵素，是樱桃深加工过程中最有潜力的加工方式之一，不仅延长了樱桃产品的货架期，也提升了樱桃的附加值。本文以樱桃为原料，优化樱桃酵素的发酵工艺，并测定樱桃酵素的体外抗氧化能力和主要酶的生物活性，为樱桃酵素的进一步综合性开发、工业化生产和生物功能机制研究提供新的思路和理论基础。1 材料与方法1.1 材料与仪器樱桃、酵母（安琪酵母）（洛阳市大张超市）。乙二胺四乙酸（EDTA）、氯化钠Tris、邻苯三酚、氢氧化钠、可溶性淀粉、聚乙烯醇、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、水杨酸钠、硫酸亚铁、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、三羟甲基氨基甲烷等，试剂均为分析纯。L9Plus 双光束紫外可见分光光度计（上海仪电）；FA224电子天平（上海舜宇恒平）；JC-400A型生化培养箱（青岛精诚）；KH19A台式高性能高速离心机（湖南凯达）；HH-1电热恒温水浴锅（无锡玛瑞特）。1.2 方法1.2.1 制备樱桃酵素 挑选无腐烂的樱桃，清洗打浆后，接入0.1%2%酵母菌，于2045 条件下，静置发酵624 h，发酵液过滤，制得樱桃酵素成品。1.2.2 樱桃酵素发酵工艺优化 单因素试验：分别研究酵母菌接种量（0.1%，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%）、发酵时间（6，9，12，15，18，21，24 h）、发酵温度（20，25，30，35，40，45）3种单因素对樱桃酵素中SOD活性的影响。优化试验：在单因素试验基础上，以酵母菌接种量（A）、发酵时间（B）和发酵温度（C）为独立变量，以SOD活性为响应变量，采用Box-Benhnken响应面方法进行优化，获得酵素发酵的最佳工艺条件。因素和水平见表1。表1 Box-Behnken试验设计因素水平因 素编码水平-101A 接种量/%0.511.5B 时间/h61218C 温度/2530351.2.3 酶活性测定 SOD活性参照徐雅娟等17、淀粉酶活性参照宋阳等18、脂肪酶参照董银卯等19方法。1.2.4 超氧阴离子自由基（O2）清除能力测定 参照崔国庭等20方法。1.2.5 羟基自由基（OH）清除除能力测定 参照Xiong等21方法。1.2.6 DPPH清除能力测定 参照Cui等22方法。1.2.7 还原性测定 参照Yen等23方法。1.3 数据处理每组试验进行3 次重复，取其平均值，数据处理和图表绘制采用GraphPad.Prism 5.0软件，响应面数据分析处理、绘图采用Design-Expert 8.0.6软件。2 结果与分析2.1 单因素试验酵母接种量对樱桃酵素中SOD活性的影响见图1（A）。当酵母接种量0.1%1.0%时，樱桃酵素发酵液中SOD活性与酵母菌接种量呈正相关；当接种量超过1.0%，SOD活性与酵母菌接种量相关性不高；酵母菌接种量为1.0%时，SOD活性最高达31.13 U/ml。发酵时间对樱桃酵素中SOD活性的影响见图1（B）。发酵时间为612 h时，樱桃酵素中SOD活性随发酵时间延长逐步提高；超过12 h，SOD活性与发酵时间呈负相关；发酵时间为12 h时，樱桃酵素中SOD活性最高达33.15 U/ml。发酵温度对樱桃酵素中SOD活性的影响见图114 食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第1期（C）。发酵温度为20至30 时，樱桃酵素中SOD活性随温度升高而提高；升至45 时，SOD活性则呈下降趋势，可能由于发酵温度超出了酵母的最适发酵温度，酵母发酵能力降低导致；发酵温度为30 时，SOD活性达最高35.15 U/ml。因此，综合考虑选择酵母菌接种量为1.0%、发酵时间为12 h、发酵温度为30，在此基础上进一步优化发酵工艺条件。图1 接种量、发酵时间和发酵温度对SOD活性的影响2.2 响应面法优化2.2.1 Box-Behnken 试验设计和模型拟合 根据Box-Behnken 试验设计方案及结果见表2。运用Design expert 8.0.6软件对表2数据进行多元拟合分析，建立二次回归模型，获得酵素中SOD活性与主要因素之间方程式：Y=41.51+1.38A+0.33B-2.26C-1.18AB-0.52AC+0.7BC-4.1A2-4.8B2-9.12C2对模型进行回归方差分析，结果见表3，模型F=56.41、P值 0.05，表明试验误差不显著；R2=0.9864，表明用该模型获得预测值与试验测定数值之间吻合度较高、能准确预测樱桃酵素发酵过程中发酵时间、发酵温度和酵母菌接种量对酵素中SOD活性的影响。由表3可见，一次项A、C和二次项AA、BB和CC的P值均小于0.01，表明发酵时间、发酵温度和酵母菌接种量对SOD活性均有显著的影响；交互项AB、AC和BC的P值0.05，表明它们之间的交互作用影响不显著。表3 方差分析表方差来源 自由度 平方和均方F值P值显著性模型9634.5770.5156.41 0.0001*A115.3515.3512.280.0099*B10.860.860.690.4347 不显著C140.6840.6832.550.0007*AB15.595.594.470.0722 不显著AC11.071.070.860.3854 不显著BC11.951.951.560.2522 不显著AA170.9470.9456.760.0001*BB1979777.61 0.0001*CC1350.57 350.57 280.48 0.0001*残差78.751.25失拟项36.932.315.080.0752 不显著纯误差41.820.45总离差16643.32R20.9864注：*差异极显著（P0.01），下同表2 响应面实验方案与结果实验号ABCY接种量/%发酵时间/h发酵温度/SOD活性/Uml-111-1033.93210126.99300040.81400041.63500042.2560-1125.13700040.828-10123.899-11033.6510-1-1030.161101-128.651210-133.711300042.051401126.711511032.6916-10-128.54170-1-129.86食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第1期 152.2.2 响应曲面和等高线图分析使用Design-Expert 8.0.6 软件绘制响应面图和等高线图，见图2。由图2B、2D和2F可见，响应面曲线变化较剧烈，表明它们对响应值影响较大；等高线图显示两个因素之间的相互作用影响，图2A、2C和2F显示3个独立变量之间的交互作用不明显；结果与回归分析结果一致。2.3 验证性实验经Design-Expert 8.0.6 软件分析后获得该模型条件下樱桃酵素发酵的最佳条件：酵母菌接种量1.09%，29.35 条件下发酵12 h，获得的樱桃酵素含有的SOD活性预测值为41.78 U/ml。考虑实际发酵条件，将发酵工艺条件改良为酵母菌接种1.1%，29 条件下发酵12 h。在该条件下获得樱桃酵素，其所含SOD活性为40.76 U/ml（该值为相同条件下3次重复试验的平均值），与预测值相近，表明该模型可用于优化樱桃酵素的发酵工艺。2.4 樱桃酵素抗氧化活性樱桃酵素体外抗氧化试验结果见图3。由图3可见，樱桃酵素的DPPH自由基清除率最高可达91.45%，OH清除率和O2清除率初期达77.67%和75.04%，还原力为0.349，表明樱桃酵素具有良好的体外抗氧化活性。由图3A可见，樱桃酵素在室温或4 条件下贮藏012 d，其对OH清除率随着贮藏时间延长呈下降趋势，且室温下降更明显。樱桃酵素的DPPH自由基清除率（图3B）、O2清除率（图3C）和还原力（图3D）的变化在012 d的贮藏期内，无论是在室温条件还是4 均呈现相同的下降趋势。樱桃酵素含有维生素C（VC）、有机酸和多酚类化合等抗氧化活性物质，可能是其具有体外抗氧化能力的原因。研究认为24-26，酵素在发酵过程中产生的多酚类化合物、多糖、有机酸是酵素抗氧化活性升高的物质基础。随着贮藏时间延迟，可能由于其抗氧化成分如VC被氧化破坏、酚类物质被分解等引起了樱桃酵素体外抗氧化能力的下降，樱桃酵素的抗氧化能力变化的机制需要进一步深入研究。A.OH清除率；B.DPPH清除率；C.O2清除率；D.还原力图3 贮藏过程中樱桃酵素体外抗氧化能力的变化图2 各因素交互作用对SOD活性影响的响应面图与等高线图16 食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第1期2.5 樱桃酵素的酶活性樱桃酵素中含有多种具有生物活性的酶，本文对樱桃酵素中的淀粉酶、脂肪酶和SOD的活性进行评估，结果见图4。图4 樱桃酵素中SOD、脂肪酶和淀粉酶活性由图4可见，樱桃酵素中SOD酶活性最强，达40.6 U/ml；脂肪酶活性次之，可达3.56 U/ml；淀粉酶活性最弱，仅0.44 U/ml。SOD活性最高与樱桃酵素的发酵工艺有关，这与樱桃酵素具有较强的体外抗氧化活性的实验结果一致。脂肪酶和淀粉酶活性教弱，表明樱桃酵素对于协助消化脂肪和淀粉的能力有限。3 结论食用植物酵素含有特定的生物活性成分，具有多种生物学功能。本文根据Box-Behnken 试验设计方案优化了樱桃酵素的发酵工艺，并对其体外抗氧化活性和酶活性进行了初步的探索。试验结果表明，以酵母菌为发酵菌种，接种1.1%酵母菌，29 条件下发酵12 h，能获得含有SOD 活性为40.76 U/ml的樱桃酵素；所获得樱桃酵素含有大量的SOD和少量的脂肪酶和淀粉酶；对樱桃酵素OH清除能力、DPPH清除能力、O2清除能力和还原力研究表明，樱桃酵素具有体外抗氧化能力，其抗氧化能力随着贮藏时间的延长呈下降趋势。该研究为开发一种绿色健康的樱桃酵素提供理论依据。参考文献1 梁惜雯,徐冬颖,陈晨,等.草酸、水杨酸、茉莉酸甲酯处理对甜樱桃采后贮藏品质的影响J.包装工程,2022,43(7):18-25.2 洪理杰,范阳,刘秉珍,等.苦荞粗多糖涂膜处理对中国樱桃的保鲜效果J.食品工业科技,2021,42(14):296-301.3 梁秋萍,严学迎.基于熵权TOPSIS法的不同品种甜樱桃营养品质综合评价J.食品研究与开发,2021,42(16):59-64.4 Jagtap U B,Bapat V A.Wines from fruits other than grapes：current status and future prospectusJ.Food Biosci,2015,9:80-96.5 刘文丽,孙舒扬,贡汉生,等.不同酿酒酵母发酵的干红樱桃酒酒体成分及感官质量分析J.食品与发酵工业,2016,1(42):157-166.6 李国琴,武晋海,朱洪梅,等.甜樱桃采后保鲜技术的研究进展J.食品研究与开发,2021,42(20):191-197.7 汤薇,李同祥,李勇,等.一种樱桃罐头的加工工艺优化研究J.现代食品,2017,(23):118-121.8 杨雪,李明月,张雪楠,等.皂土对樱桃发酵酒品质的影响J.食品工业,2021,42(1):20-23.9 刘绪,向月,李欢,等.大樱桃果汁加工工艺研究J.食品与发酵科技,2021,57(1):83-85,98.10 刘宝祥,苏政波,马闯,等.樱桃果醋深层液态发酵工艺J.食品工业,2020,41(6):77-80.11 程焕,姚舒婷,智慧,等.樱桃番茄果脯糖煮液废水的回用工艺及其对果脯品质的影响J.中国食品学报,2021,21(1):115-125.12 朱丹实,魏立威,任晓俊,等.大豆种皮多糖对低糖型樱桃酱流变性质的影响J.中国食品学报,2020,20(10):142-149.13 中国生物发酵产业协会.食用植物酵素：T/CBFIA 08003-2017S.北京:中国标准出版社,2017:1-7.14 中华人民共和国工业和信息化部.植物酵素：QB/T5323-2018S.北京:中国轻工业出版社,2018:1-10.15 索婧怡,朱雨婕,陈磊.食用酵素的研究及发展前景分析J.食品与发酵工业,2020,46(19):271-283.16 刘加友,王振斌.微生物酵素食品研究进展J.食品与发酵工业,2016,42(1):273-276.17 徐雅娟,赵艳景,胡虹.邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性的研究J.西北民族大学学报(自然科学版),2006,32(6):1207-1209.18 宋阳,王亚琼,赵丽恋,等.基于淀粉酶活性检测的麦芽质量评价方法J.药学进展，2010,34(9):411-417.19 董银卯,何聪芬,王领,等.火龙果酵素生物活性的初步研究J.食品科技,2009,34(3):192-196.20 崔国庭,王缎,刘向丽,等.响应面法优化草莓酵素的发酵工艺及其生物活性初探J.食品工业科技,2018,39(9):143-148.21 Xiong S L,Li A,Huang N,et al.Antioxidant and immunoregulatory activity of different polysaccharide fractions from tuber of Ophiopogon japonicusJ.Carbohydr Polym,2011,86(3):1273-1280.22 Cui G,Zhang W,Zhang A,et al.Variation in antioxidant activities of polysaccharides from Fructus Jujubae in South Xinjiang areaJ.Int J Biol Macromol,2013,57:278-284.23 Yen W J,Chang L W,Duh P D.Antioxidant activity of peanut seed testa and its antioxidative componet,ethyl protocatechuateJ.Lwt-Food Sci Technol,2005,38(3):193-200.24 谢东东,张楠,孙英淇.不同种类水果酵素发酵特性及抗氧化特性的比较J.河南工业大学学报:自然科学版,2022,43(1):35-41.25 付龙威,汤晓娟,林祥娜,等.枇杷酵素自然发酵过程中有机酸及其抗氧化活性的研究J.食品研究与开发,2021,42(4):42-47,54.26 王霞,张虽栓.复合粗粮酵素液的研制及抗氧化活性J.粮食与油脂,2022,35(3):62-66.食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第1期 17