蛇毒检测方法及其应用的研究进展.pdf

通讯作者:.蛇毒检测方法及其应用的研究进展农继飞黄周黄正壮王威(.广西壮族自治区柳州市人民医院急诊医学科广西柳州.广西医科大学第一附属医院急诊医学科广西南宁)摘要 毒蛇咬伤在热带、亚热带地区是严重危害公共卫生安全的突出问题 长期以来蛇毒的性质仅简单分为神经毒、血循毒、细胞毒而蛇咬伤的鉴定单纯依赖于咬伤经过、病理变化和临床表现然而不少伤者病史不详且症状复杂病理变化滞后临床表现复杂或者类同使得咬伤蛇种的准确鉴定非常困难 上世纪后半叶起许多新兴技术和检测方法引进研究蛇毒和蛇伤鉴定领域如免疫电泳法、酶联免疫吸附试验法、聚合酶链反应、荧光免疫法、生物传感器、放射免疫分析、质谱法等蛇毒的性质、组分及作用被进一步认识检测灵敏度和特异度得到进一步提高 本文就国内外蛇毒检测方法技术的研究和发展进行综述关键词 蛇咬伤蛇毒检测蛋白质丰度抗体中图分类号.文献标识码 文章编号 ():./.(.).蛇咬伤严重威胁热带、亚热带国家和地区公共卫生安全 由于毒蛇咬伤导致较高的死亡率和致残率全球每年估计有 万例蛇咬伤患者有.万例相关死亡病例 蛇毒蛋白质组分及其丰度与蛇咬伤引起的症状密切相关快速鉴定毒蛇咬伤的种类对尽早获得最佳的临床治疗非常重要 蛇毒是由毒蛇的毒腺分泌的天然蛋白质其化学成分复杂多样主要毒性成分包括多肽、金属蛋白酶、出凝血酶类等 根据世界卫生组织的统计毒蛇咬伤的致残、致死在发展中国家仍然是普遍现象在使用抗蛇毒血清前仍普遍缺乏蛇毒检测的可行性实验方法 目前临床上对蛇咬伤的识别鉴定主要依赖于患者对蛇种形态的描述、咬伤部位的表现及全身症状、简单的检测如出凝血、血常规、尿常规等然而部分无毒蛇的外形类似有毒毒蛇临床上也遇到毒蛇“干咬”未排毒而不出现中毒的情况 此外这些诊断方法的局限性还在于患者描述错误或者毒蛇咬伤后症状出现需要一定时间血生化、尿液的检测缺乏特异性 蛇毒是高度复杂的混合物在同科、同属甚至不同科、不同属的蛇之间或某一蛇种在不同地域的蛇毒液成分和毒理作用仍存在一定的差异 因此进行致伤蛇种类的鉴定对毒蛇咬伤早期使用单价抗蛇毒血清的治疗效果至关重要 长期以来研究人员致力于开发一种稳定可靠、快捷简蛇 志 ()年第 卷第 期.便、有较好特异性的蛇毒鉴定方法目前有放射免疫测定、凝集测定、酶联免疫吸附试验()、荧光免疫测定、蛋白质组学技术等已被用于检测各种蛇毒液和毒素 其中:蛋白质组学技术对各区域的蛇毒蛋白质组分作了详尽研究 被用于咬伤患者微量蛇毒的检测 在已开发用于检测毒液/毒素的物种特异性方面 取得了重大进展尤其在蛇咬伤是主要医疗和社会问题的发展中国家应用于 抗体制备的杂交瘤技术和亲和色谱已被用于开发诊断目的物种特异性免疫试剂 本文就国内外对蛇毒组分的检测、鉴定方法及其应用作一综述重点介绍了检测蛇毒的蛋白质组学技术和 方法的最新进展 放射免疫分析法()是利用放射性同位素(如、等)标记抗原或者标记抗体来测定相对应抗原通过专用仪器监测标记抗原或标记抗原抗体复合物的代谢并计算出待测抗原的数量 年首次应用 固相 检测出澳大利亚虎蛇()咬伤死者和两个不明蛇咬伤组织内的蛇毒 年 等开发出单克隆抗体用于 竞争法检测蝰蛇咬伤患者体液内的毒素该法在体外检测的灵敏度高下限值达到 /在尿液中达到 /在血清中的浓度为 /但是该方法在检测眼镜蛇毒液时存在假阳性 虽然影响检测的因素还有待进一步研究但这是一项有潜在使用价值的技术 相比双抗体夹心 该方法操作步骤更简单所需体液量更少 但该方法使用放射性物质而且昂贵除了与 的短暂半衰期相关的问题外还需要专门和精密的读取设备来测量同位素水平被证明在临床患者 身 上 不 切 实 际 可 操 作 性 不 大 年 等在前人的基础上比较 和 检测血浆中欧洲极北蝰蛇毒含量 灵敏度比 低没有突出优势 随着 的完善 无竞争优势 另外放射性同位素的处理和需要配备专用精密计数设备的使用限制了其在临床蛇毒常规诊断中的应用更适合作为一种实验室研究工具 酶联免疫吸附试验 是一种免疫学诊断技术是利用酶标记抗原或抗体与检测待测样品中的相应抗体或抗原结合 其基本原理是使抗原或抗体在保持免疫活性的条件下物理吸附到某种固相载体表面而蛋白质酶和相对应的抗体或抗原藕联成酶标抗体或抗原酶标抗体或抗原同时具备免疫活性和酶活性与固相载体表面的抗原或抗体结合后以酶为检测信号酶的反应底物加入后被酶催化产生有色产物产物的量与待测抗原或抗体的量成比例根据颜色深浅即可定性或采用专用酶标仪检测吸附信号作定量分析 使用生物素或亲和素放大信号进一步提高实验的灵敏度 由于其具有灵敏、特异和快速的优点 适用于检测大批量样本是得到国际公认的标准化诊断方法 等首次使用双抗体夹心 法检测蛇毒和蛇毒抗体模拟中毒的动物血清可检出 /的毒液并可检测咬伤患者 年后体内的蛇毒抗体 蛇毒抗原的交叉反应、非特异性反应性是影响 检测蛇毒及其抗体特异性和敏感性的重要因素 年等先利用单克隆抗体技术制备了美洲珊瑚蛇()蛇毒的单克隆抗体再用于构建夹心 检测方法发现 法使用单克隆抗体较使用多克隆抗体表现出更好的检测特异性 同时新加坡的 等针对 种常见的越南南部毒蛇采用经过亲和纯化的兔多克隆抗体构建夹心 方法并改装成可现场使用的设备检测蛇毒 亲和纯化其原理是将异种蛇毒藕联在蛋白层析亲和柱上然后让目的抗蛇毒血清流穿亲和层析柱流穿液即为针对该目的蛇毒的单特异性抗体()应用于该目的蛇毒的 法可检测到低至./的蛇毒且未与同科蛇毒发生交叉反应并在 例蛇咬伤患者的 份样本中初步评估表明该方法可以检测出人体样本中的毒液是临床上快速鉴定蛇咬伤的一种有效工具 在单克隆抗体技术和蛋白亲和层析技术制备单特异性抗体应用后 的敏感性和特异性得到较大提高同时使用具有更高亲和力的抗体不仅提高了灵敏度而且缩短了测定的孵育时间从而为临床诊断提供了快速的检测结果预包被好的聚乙烯酶标板可以冷藏储存备用进一步改进实验步骤可以将检测样品与酶标抗体共同孵育而不是连续孵育孵育时间可以进一步减少要求总的检测时间不到 经过验证 是一种可靠的方法因此在快速检测分析物方面得到了更好的评价 相比其他检测方法 更有临床实践应用的意义 液相色谱质谱法()可以有效分离分析复杂有机混合物其蛇 志 ()年第 卷第 期.中液相色谱仪具有较强的分离能力可有效分离混合有机物中的热不稳性及高沸点化合物再结合质谱仪强大的组分鉴定能力逐个分析分离出的有机物鉴定有机物的分子量、结构和浓度 由于 强大的电喷雾电离技术其质谱图简洁直观后期数据处理简单 因此 是分析有机物的必备工具 蛇毒是多种不同分子量的蛋白质、酶类、少量金属离子、碳水化合物及胺类的混合物其成分复杂具有多种生物学活性和药理作用 蛋白质组学技术用于研究不同蛇属或同一蛇属在不同地域的蛇毒蛋白进化、蛋白质结构与功能关系和毒蛇分类地位等都有一定的借鉴作用 随着蛋白质组学技术发展的成熟蛇毒蛋白质组学得到深入研究揭示了不同蛇毒蛋白质的组分 年澳大利亚的 等首次使用 技术对澳大利亚原产地棘蛇属()蛇毒进行分析 发现磷脂酶 毒素均存在于各棘蛇属且其蛋白质丰度均比较大对蛇毒的毒性大小发挥重要作用同时发现存在于棘蛇属的短链 神经毒素和来自于眼镜蛇科的短链 神经毒素在氨基酸序列上有高度同源性 年 等利用 技术首次对越南北部银环蛇、金环蛇毒组分进行分析发现 银环蛇毒素是银环蛇毒中蛋白质丰度最高的毒素达到 其次是 的三指毒素而金环蛇毒中不存在 银环蛇毒素其磷脂酶 丰度达到.而且有银环蛇毒中不存在的乙酰胆碱酯酶 这与国内的张经硕等对江西产地的银环蛇和金环蛇蛇毒的蛋白质丰度的检测有差别提示即使同一蛇种的蛇毒在不同地域其不同毒素的蛋白质丰度有差异最终导致其毒性有地域差异 张经硕等同时发现在金环蛇毒中并没有银环蛇的重要神经毒素(银环蛇毒素和短神经毒素同源物)等比较了亚洲 个不同地域的金环蛇毒发现其磷脂酶、三指毒素等的蛋白质丰度及金属蛋白酶存在不同程度的差异马来西亚产地的金环蛇毒磷脂酶 的丰度是.而中国大陆产地的金环蛇毒磷脂酶 则是.以半数致死剂量()计算其对小鼠的毒性也有差异其中以印度尼西亚产地的最高(./)最低的是缅甸产地(./)等对国内眼镜蛇科的中华眼镜蛇毒和银环蛇毒的蛋白质谱进行质谱比较鉴定发现三指毒素和磷脂酶 蛋白质家族在这两种蛇毒中的丰度最高并对其毒性起主导作用同时发现少部分毒素不能被免疫完全捕获指出制备这两种蛇毒的商业抗蛇毒血清时应增强这部分蛇毒的免疫应答 蛋白质组学研究技术提示了针对不同地域原产地的蛇毒蛇毒组分和蛋白质丰度差异的研究可以使抗蛇毒血清的研制更需要有针对性 有研究发现在针对银环蛇毒、眼镜王蛇毒中毒的实验动物中利用针对 银环蛇毒素产生的高剂量抗蛇毒血清就可以达到中和目的提示 银环蛇毒素在银环蛇粗毒中的蛋白质丰度较高这也与其毒性最大有关 迄今为止许多蛇毒的蛋白质组学研究报道了蛇毒组成和含量的地理差异观点普遍认同的原因是毒蛇适应特定地域食性结构长期进化的结果 等利用蛋白质组学技术对中国台湾和中国大陆的银环蛇蛇毒蛋白质家族进行比较发现同是银环蛇种而不同地域的蛇毒对小鼠的半数致死量()有差别推测地缘隔绝影响了两地蛇毒成分的进化同时也比较了两地针对银环蛇毒(神经毒)的抗蛇毒血清指出相比多效价抗蛇毒血清单效价抗蛇毒血清的效价更高 在蛇伤鉴定中若咬伤部位的浆液或患者血清鉴定出某一蛇种的特异性蛋白可以鉴定为该蛇种咬伤经过 多年的发展蛋白质组学技术的发展可以快速鉴定和大批量量化蛇毒中的蛋白质家族对蛇毒的进化趋势、地理差异和医学意义有重大贡献聚合酶链反应法()是一种用于放大扩增目的 或 片段的分子生物学技术将目的 或者 于体外复制 的最大特点是能将微量的基因片段大幅增加 等提出蛇毒中含有分泌上皮细胞分泌上皮细胞是在蛇毒注毒过程中释放出来的他们创新性将 技术扩增小鼠被眼镜蛇咬伤部位的渗出物 片段得到了一小段区别于当地眼镜王蛇、金环蛇、圆斑蝰蛇和红口腹蛇的眼镜蛇毒毒素编码基因中的 片段他们也是第一个使用 通过实验小鼠模型将泰国眼镜蛇()的毒液与其他泰国物种的毒液区分开来 的 研 究 小 组 李 其 斌 等从 眼 镜 王 蛇()毒腺中提取 经 扩增后得到眼镜王蛇蛇毒 神经毒素()的基因序列经基因库计算机技术分析其信号肽与眼镜蛇树属、海蛇属完全同源 等对中华眼镜蛇和银环蛇的毒腺转录本进行测序构建了眼镜蛇和银环蛇的基因文库发现不仅高丰度毒素家族而且低丰度的毒素都处于快速适应性进化中蛇 志 ()年第 卷第 期.可以对不同毒蛇的毒素基因起源、进化作溯源研究但蛇咬伤患者的血液中存在毒液浓度极低毒蛇咬伤部位的腺上皮细胞有可能不足导致未能检测到毒素编码基因同时这可能不适用于临床但对回顾性确认诊断有价值荧 光 免 疫 分 析()是基于酶标记的免疫反应物与经高活性的酶催化底物显色或发光方法完成定量分析目的的一种非放射性标记免疫分析技术 荧光法被引入到免疫学分析中以提高免疫分析的灵敏度 甲基伞状基磷酸酯广泛用于与碱性磷酸盐类配合使用的荧光底物 年 和 针对中美洲蝮蛇()的肌毒素制作出 种单克隆抗体并用 种抗体分别作捕获抗体和荧光素标记的检测抗体该方法的检出限约为./等依照此方法设计了马抗蝰蛇粗毒作捕获抗体兔抗蝰蛇粗毒作为检测抗体山羊抗兔 碱性磷酸酶结合物用于放大层级信号将该方法用于 种来自蝰蛇科蝮亚科和眼镜蛇科的蛇毒检测交叉反应除了眼镜蛇科的毒液外所有其他毒液都显示出不同程度的交叉反应 但该方法存在的问题包括偶联剂的不稳定和终点测定时间的不确切同时蛇毒的排毒量较小注入活体内后被代谢减少该方法在体内的灵敏度和特异度均达不到实验要求 免疫传感器 免疫传感器即生物传感器也称光学免疫传感器其关键的信息转换器采用光敏原件利用光学原理工作 生物识别分子(蛋白抗原等)被固化在传感器上通过与光学元件中的光相互作用导致光学信号改变通过检测光学硅芯片上分子膜厚度的物理变化导致的光学信号来检测免疫反应所以可对检测对象进行分析测定 典型且成功的方法是 等将兔 抗 银环蛇毒素的抗体固定在光学活性硅片上抗原(毒素)在硅晶体表面被捕获和添加底物使光学发生变化并放大信号硅检测表面技术能够直观地看到抗体薄膜光学厚度的物理变化 该方法可检测到样品缓冲液中低至 /的 银环蛇毒素以及全血或血浆中低至 /的 银环蛇毒素并同时用 银环蛇毒素、眼镜蛇神经毒素及细胞毒素作比较没有交叉反应 相比生物传感器更方便于携带检测时间可缩短至 更适合于现场快速检测但是这个方法对毒素的检测是半定量的 问题与展望 蛋白质组学技术可鉴定出蛇毒粗毒中不同的蛇毒蛋白家族质谱分析中发现含量最丰富的蛋白质家族和其他次要蛋白家族和酶如 氨基酸氧化酶、神经生长因子和金属蛋白酶、乙酰胆碱酯酶等蛋白质组成分与所测试的蛇毒液酶活性和毒性相关对深入研究蛇毒的毒理学和药理学有重要意义质谱法可以快速、简单、流程化鉴定蛋白质可有效鉴定蛇毒成分在蛇伤鉴定中起重要作用 掌握各种蛇毒的蛋白质图谱及各组分的抗原性能发现其中的交叉反应蛇毒蛋白家族有利于制备更有针对蛇毒免疫原性的抗蛇毒血清 由于蛇毒蛋白的同源性所研制的单克隆抗体与相关和不相关蛇种的毒液抗原可能表现出一定程度的交叉反应 目前荧光底物促进了用于实验室研究的高灵敏度荧光免疫分析的发展夹心 法是蛇毒定量检测最可靠的方法达到皮克()级别水平但是需要预先制备针对蛇毒的捕获抗体和检测抗体 单一毒液成分的检测可以减少交叉反应但部分蛇的排毒量较小同时由于体内的代谢过程毒液成分有可能发生降解而降解后的毒素可能无法被特异性抗体识别因此针对某一特定地区流行的主要毒蛇研制单特异性多克隆抗体并采用亲和层析法去除交叉反应的毒液抗体作为免疫试剂将是检测毒液的最佳途径 尽管已有多篇关于毒液免疫检测方法的报道但目前仅有澳大利亚开发出商业的蛇咬伤快速诊断试剂盒这与毒液免疫检测的交叉反应普遍存在有关 制备单克隆抗体和单特异性抗体理论上可以减少交叉反应提高敏感性其精确性、灵敏性有较好的临床应用前景参考文献 .():.张经硕向平沈敏.中国境内 种常见蛇毒的蛋白质组学研究.蛇志():.():.:.:.蛇 志 ()年第 卷第 期.():.():.().():.():.().():.(/):./():.():.:.:.().:.():.().():.李其斌渡庆次贺博金城记代彦等.法分子克隆及序列分析广西产眼镜王蛇蛇毒 神经毒素基因.中华急诊医学杂志():.().():.().():.():.(/):.声 明 为了适应科技期刊的发展趋势和我国信息化建设的需要扩大学术交流渠道本刊已许可北京万方数据、中国学术期刊(光盘版)电子杂志社等在中国知网及其系列数据库产品中以数字化方式复制、汇编、发行、信息网络传播本刊全文 其作者文章著作权使用费与本刊稿酬一次性给付(已在收取发表费时折减)作者向本刊提交文章发表的行为即视为同意我社上述声明 如作者不同意请务必在投稿时注明本刊将作适当处理 特此声明蛇志编辑部蛇 志 ()年第 卷第 期.