蒲公英根多糖的提取工艺优化.pdf

第 9 卷 第 4 期2023 年 8 月生物化工Biological Chemical EngineeringVol.9 No.4Aug.2023文章编号：2096-0387（2023）04-04蒲公英根多糖的提取工艺优化李霞（齐鲁医药学院，山东淄博 255300）摘 要：目的：探讨优选超声辅助酶法提取蒲公英根中多糖的工艺参数。方法：通过单因素试验，筛选出超声功率、超声时间、酶解时间及溶液 pH 进行正交试验设计，以蒲公英根中多糖提取率为指标。结果：最佳提取工艺为 A1B1C3D3，即超声提取时间为 30 min，超声的功率设置为 300 W，溶液 pH 为 5.0，复合酶作用时间为 120 min。在最佳提取工艺条件下，蒲公英根中多糖的平均提取率为 9.068%。结论：通过正交试验设计优选的蒲公英根多糖提取工艺稳定、可行，为获得一种尽可能简便易行、绿色环保、成本低的提取方法提供了参考。关键词：蒲公英根；多糖提取；超声辅助复合酶法中图分类号：R282 文献标识码：AOptimizationofPolysaccharidesExtractionProcessfromtheRootsofTaraxacum mongolicum LI Xia(Qilu Medical College,Zibo 255300,China)Abstract:Objective:To explore the optimal process parameters for ultrasonic assisted enzymatic extraction of polysaccharides from the roots of Taraxacum mongolicum.Methods:Through single factor experiment,the ultrasonic power,ultrasonic time,enzymatic hydrolysis time and solution pH are screened out for orthogonal experimental design,and the extraction rate of polysaccharides from the roots of Taraxacum mongolicum is used as the index.Results:The optimal extraction conditions is A1B1C3D3,which extraction time is 30 minutes,the ultrasound power is set to 300 W,the solution pH is 5.0,and the composite enzyme action time is 120 minutes.The average extraction rate of polysaccharide from the roots of Taraxacum mongolicum is 9.068%.Conclusion:The optimal extraction process of polysaccharide from Taraxacum mongolicum root by orthogonal design is stable and feasible.Providing a reference for obtaining a extraction method that is as simple,feasible,environmentally friendly,and cost-effective as possible.Keywords:roots of Taraxacum mongolicum;polysaccharide extraction;ultrasound-assisted compound enzyme method蒲公英属菊科，有清热解毒、利尿通淋、健胃消炎和保肝利胆的功效。蒲公英药效成分复杂，主要包括多糖类、黄酮类、甾醇类等。蒲公英中所含的多糖药理作用广泛，可以提高机体免疫力、降低血糖、抑菌、抗癌，也可以通过抗氧化作用起到保护肝脏的效果1。酶提取法可以提高提取率并维持多糖的活性，受到广泛关注。纤维素酶可以水解植物的细胞壁，让提取溶剂快速进入组织细胞中，因而提高了多糖的提取率，缩短了多糖的提取时间；木瓜蛋白酶可以水解糖蛋白和多糖中的游离蛋白，有利于植物多糖的提取。如徐澜等2采用木瓜蛋白酶对蒲公英进行酶解，多糖得率为 3.11%；WANG 等3利用纤维素酶提取蒲公英多糖，多糖得率达到了 20.67%。复合酶提取法能够更有效地提高多糖提取率，如刘珊珊等4以蒲公英根烘焙粉为样品，探究了单酶和双酶协同条件下多糖得率，结果表明双酶法多糖提取率为 32.97%0.13%，优于单酶法。目前测定植物多糖常用苯酚-硫酸法，该法方便、作者简介：李霞（1972），女，山东淄博人，本科，高级实验师，研究方向为中草药提取。李霞：蒲公英根多糖的提取工艺优化第 4 期75灵敏、稳定，适用于单糖、低聚糖和多糖的含量测定5。基于此，本文以多糖总提取率为考察指标，通过单因素实验和正交试验设计优选超声辅助复合酶法的最佳提取工艺。1 材料与方法 1.1 仪器UV-2550 分光光度计，日本岛津株式会社；FA2204B 电子天平，上海精科天美科学仪器有限公司；XL-20B 密封型摇摆式粉碎机，广州市旭朗机械设备有限公司；KQ-800KDE 高功率数控超声波清洗器、SHB-III 循环水式多用真空泵，上海申生科技有限公司。1.2 试剂蒲公英根粉末样品，产自云南，将蒲公英根干燥、去杂、粉碎、过筛后制得。无水葡萄糖标准品，HPLC 99%，上海诗丹德标准技术服务有限公司；乙醇、苯酚，分析纯，莱阳市康德化工有限公司；柠檬酸、磷酸氢二钠，分析纯，天津恒兴化学试剂有限公司；纤维素酶（10 万 U/g）、木瓜蛋白酶（10 万 U/g），南宁庞博生物工程有限公司。1.3 实验方法1.3.1 标准曲线的绘制精密称取干燥恒重的葡萄糖对照品 0.020 1 g，加入蒸馏水定容至 10 mL，得到 2 mg/mL 的葡萄糖标准溶液。吸取 2.0 mL 葡萄糖标准溶液于 25 mL 容量瓶中，加水稀释至刻度，之后准确吸取 1.0 mL 到干燥洁净的具塞试管中，加入 5%苯酚溶液 1.0 mL，摇晃均匀后迅速滴入浓硫酸 5.0 mL，充分混合均匀，冷却到室温后静置 30 min，测得最大吸收波长为 488 nm。分别吸取葡萄糖标准溶液 1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL 和 3.5 mL 于 25 mL 容量瓶中，加水定容至刻度。分别吸取 1.0 mL 不同浓度的葡萄糖溶液到具塞试管中，加入 5%苯酚溶液 1.0 mL，摇晃均匀后迅速滴入浓硫酸 5.0 mL，充分混合均匀，冷却到室温后静置 30 min；另取 1.0 mL 水，用相同方法操作作为空白对照。用紫外可见分光光度计在波长 488 nm 处测定吸光度，以吸光度对葡萄糖浓度作图，得到标准曲线，如图 1 所示。线性回归方程 y=1.791 4x+0.063 5，R2=0.999 6。0.00.10.20.30.40.50.60.000.050.100.150.200.250.30吸光度浓度/（mg/mL）图 1 苯酚-硫酸法测得的葡萄糖标准曲线1.3.2 供试品的制备蒲公英根粉末 2.0 g 加适量蒸馏水，用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液调节 pH 值。超声波处理一段时间后，加入适量纤维素酶悬液和木瓜蛋白酶悬液，酶解适当时间后进行高温灭酶，冷却过滤，收集滤液，减压浓缩，浓缩后的液体加入四倍量的 95%乙醇溶液，冷藏静置 12 h，抽滤后取固形物，干燥得蒲公英根粗多糖。1.3.3 供试品溶液吸光度的测定称取 100 mg 粗多糖，加水定容至 50 mL 后吸取2.0 mL 样品溶液加水定容至 25 mL，得到供试品溶液。吸取 1.0 mL 供试品溶液到具塞试管中，加入 5%苯酚溶液 1.0 mL 摇匀，迅速滴入浓硫酸 5.0 mL，充分混匀。冷却至室温，放置 30 min，在波长 488 nm 处测定吸光度。按照公式（1）计算多糖提取率。100%cD vYm=（1）式中，Y 为蒲公英根多糖的提取率，%；c 为供试品多糖浓度，mg/mL；D 为稀释倍数；v 为多糖提取液体积，mL；m 为蒲公英根样品粉末质量，mg。1.3.4 单因素实验（1）最佳超声时间。取蒲公英根粉末 2.0 g，料液质量比 1 30，pH 为 5.0，超声功率 300 W，酶各2 mL（均为 200 U/mL），酶解时间 90 min，温度 55，分别超声 20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，计算多糖提取率。（2）最佳超声功率。取蒲公英根粉末 2.0 g，料液质量比 1 30，pH 为 5.0，超声时间 30 min，酶各2 mL，酶解时间 90 min，温度 55，超声功率分别设76生物化工2023 年定为 200 W、250 W、300 W、350 W、400 W，计算多糖提取率。（3）最佳酶用量。取蒲公英根粉末 2.0 g，料液质量比 1 30，pH 为 5.0，超声功率 350 W，超声时间 30 min，酶解时间 90 min，温度 55，两种酶各取 1.0 mL、1.5mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL，计算多糖提取率。（4）最佳 pH。取蒲公英根粉末 2.0 g，料液质量比 1 30，超声功率 350 W，超声 30 min，酶解时间90 min，温度55，酶各2 mL，pH分别调整为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，计算多糖提取率。（5）复合酶解时间。取蒲公英根粉末 2.0 g，料液质量比 1 30，pH 为 5.0，超声功率 350 W，温度 55，超声 30 min，酶各 2 mL，分别酶解 30 min、60 min、90 min、120 min、150 min，计算多糖提取率。1.3.6 正交实验根据单因素实验结果，确定超声功率、超声时间、酶解时间及溶液 pH 为影响较大的四个因素，设计L9(34)正交实验优化蒲公英根中多糖的提取工艺，实验参数如表 1 所示。表 1 正交实验设计表水平超声功率/W超声时间/min酶解时间/min溶液 pH130030604.0235040904.53400501205.02 结果与分析2.1 单因素实验2.1.1 最佳超声时间如图 2 所示，多糖提取率随超声时间延长呈先升高后降低趋势，40 min 时提取率最高；超声时间过长会破坏局部多糖的结构，使粗多糖提取率下降，因此选择超声时间 30 min、40 min、50 min 进行正交实验。2.1.2 最佳超声功率如图3所示，超声功率从200 W增加到350 W时，多糖快速溶出，提取率随功率增加逐渐上涨，当功率超过 350 W 时，得率骤然降低。因此，选取超声功率为 300 W、350 W、400 W 进行正交实验。0123456789200250300350400提取率/%超声功率/W图 3 超声功率对多糖提取率的影响2.1.3 最佳酶用量如图 4 所示，复合酶用量从 2.0 mL 提高到 4.0 mL 时，多糖提取率明显升高。继续增加酶用量，提取率基本不变，因此确定复合酶用量为 4.0 mL，即纤维素酶、蛋白酶用量各 2.0 mL。0123456782.03.04.05.06.0提取率/%复合酶用量/mL图 4 复合酶用量对多糖提取率的影响2.1.4 最佳 pH 如图 5 所示，pH 为 4.5 时粗多糖提取率达到最01234567892030405060提取率/%超声时间/min图 2 超声时间对多糖提取率的影响0123456783.03.54.04.55.0提取率/%pH值图 5 不同 pH 值对多糖提取率的影响李霞：蒲公英根多糖的提取工艺优化第 4 期77大值，增大 pH，多糖提取率反而下降。因此，选择 pH值为 4.0、4.5、5.0 进行正交实验。2.1.5 复合酶解时间如图 6 所示，酶解 90 min 时多糖提取率最高，酶作用时间过长多糖提取率反而下降，因此复合酶作用最佳时间为 90 min，选择酶解时间为 60 min、90 min、120 min 进行正交实验。012345678306090120150提取率/%酶解时间/min图 6 酶解时间对多糖提取率的影响2.2 正交实验如表 2 所示，根据 K 值可得最佳提取工艺组合为 A1B1C3D3，即超声波功率 300 W，超声时间 30 min，复合酶作用时间 120 min，溶液 pH 5.0。而根据多糖提取率结果，最佳组合为 A3B1C3D2，即超声波功率 400 W，超声时间 30 min，复合酶作用时间 120 min，溶液 pH 4.5。通过比较极差可得，四个因素对多糖提取率的影响排序为超声功率溶液 pH 超声时 间酶解时间。2.3 验证为进一步验证最佳工艺条件，在 A1B1C3D3的条件下进行 3 次重复性验证试验，得到多糖平均提取率为9.068%。另外对编号 7 的组合进行 3 次重复性实验，得到多糖平均提取率为 8.970%。因此，最佳工艺组合确定为 A1B1C3D3。3 结论基于单因素实验结果，设计 L9(34)的正交实验优化蒲公英根多糖提取工艺，结果表明，对提取效果影响最大的是超声功率，其次是溶液 pH 及超声时间，而酶解时间的影响较小；超声辅助复合酶提取蒲公英根多糖最佳工艺为 A1B1C3D3，即超声作用时间 30 min，超声波功率 300 W，溶液 pH5.0，复合酶作用时间 120 min。在最佳条件下，平行试验三次，得到蒲公英根中多糖平均提取率为 9.068%。参考文献1 谢士敏,周长征.蒲公英药理作用及临床应用研究进展 J.辽宁中医药大学学报,2020,22(5):138-142.2 徐澜,王明华,渠娟娟,等.酶解法提取蒲公英多糖工艺 J.食品研究与开发,2016,37(5):46-51.3 WANG H B.Cellulase-assisted extraction and antibacterial activity of polysaccharides from the dandelion Taraxacum officinaleJ.Carbohydrate Polymers,2014,103:140-142.4 刘珊珊,刘亚琼,张琦,等.双酶提取蒲公英根多糖工艺优化及其抗氧化性研究 J.食品科学技术学报,2019,37(6):108-115.5 李计萍.中药新药研究中多糖含量测定方法探讨 J.中国中药杂志,2014,39(17):3392-3394.表 2 正交实验结果编号A超声功率/WB超声时间/minC酶解时间/minD溶液 pH多糖提取率/%111117.20212227.54313336.86421237.91522318.32623124.84731328.96832136.86933215.62K17.2008.0236.3007.047K27.0237.5737.0237.113K37.1475.7738.0477.210R0.1772.2501.7470.163