1、2023 年 6 月第 3 期139144甘肃农业大学学报 JOURNAL OF GANSU AGRICULTURAL UNIVERSITY第5 8卷双 月 刊河西地区玉米田棉铃虫对 2 种 Bt 蛋白的敏感性监测康慰君1,郭建国2,谢晓丽2,薛应钰1(1.甘肃农业大学植物保护学院,甘肃 兰州 730070;2.甘肃省农业科学院植物保护研究所,甘肃 兰州 730070)摘要:【目的】明确河西走廊棉铃虫对玉米Bt蛋白的敏感性,为科学监测棉铃虫的发生危害规律提供科学依据。【方法】饲料表面覆盖毒素法测定了河西走廊嘉峪关(JYG)、酒泉(JQ)、张掖(ZY)、武威(WW)4个棉铃虫地理种群对Cry1A
2、b和Cry1Ac蛋白的敏感性,计算LC50和LC99.【结果】JYG、JQ、ZY和WW种群对Cry1Ab的LC50分别为0.116 2、0.146 0、0.172 1、0.200 4 g/cm2,LC99分别为7.277 8、6.080 7、97.066 6和27.103 7 g/cm2;JYG、JQ、ZY 和 WW 地理种群对 Cry1Ac的 LC50分别为 0.105 0、0.255 4、0.017 2和 0.045 6 g/cm2,LC99分别为 0.159 8、11.795 3、1.190 4、7.470 9 g/cm2,其中JQ地理种群对Cry1Ac的LC50值显著高于其他地理种群.
3、【结论】河西走廊玉米棉铃虫对Cry1Ab和Cry1Ac蛋白的敏感性较高,暂未对Cry1Ab和Cry1Ac蛋白产生抗性。但应该持续加强监测,以避免Bt交互抗性产生应用风险.关键词:河西走廊;玉米;棉铃虫;Bt蛋白;敏感性中图分类号:S435.132 文献标志码:A 开放科学(资源服务)标识码(OSID):文章编号:1003-4315(2023)03-0139-06Sensitivity of cotton bollworms to two types of Bt proteins in cornfield of Hexi CorridorKANG Weijun1,GUO Jianguo2,XIE
4、 Xiaoli2,XUE Yingyu1(1.College of Plant Protection,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.Institute of Plant Protection,Gansu Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou 730070,China)Abstract:【Objective】The study aimed to determine the sensitivity of Bt proteins to the corn bollworm of He
5、xi Corridor,laying a scientific basis for monitoring the occurrence and damage of cotton bollworm.【Method】The susceptibility of four geographical populations of cotton bollworm in JYG,JQ,ZY,and WW in Hexi Corridor to Cry1Ab and Cry1Ac proteins was determined using Diet-overlay bioassays,and LC50 and
6、 LC99 were calculated.【Result】The results showed that the LC50 of Cry1Ab protein in JYG,JQ,ZY,and WW geographic populations were 0.116 2,0.146 0,0.172 1,and 0.200 4 g/cm2,respectively,while the LC99 of Cry1Ab were 7.277 8,6.080 7,97.066 6,and 27.103 7 g/cm2,respectively.The LC50 of Cry1Ac protein in
7、 JYG,JQ,ZY,and WW geographic populations were 0.102 5,0.255 4,0.017 2,and DOI:10.13432/ki.jgsau.2023.03.018第一作者:康慰君,硕士研究生。E-mail:通信作者:郭建国,副研究员,主要从事植物保护研究。E-mail:薛应钰,教授,主要从事植物病原学研究。E-mail:基金项目:甘肃省科学技术厅重点研发计划项目(20YF8NA108);嘉峪关市科学技术局重点研发计划项目(21-21);甘肃省农业科学院农业科技创新专项(2019GAAS26)。收稿日期:2022-03-02;修回日期:2022
8、-04-06甘肃农业大学学报2023 年0.045 6 g/cm2,respectively,while the LC99 of Cry1Ac were 0.159 8,11.793 5,1.190 4,and 7.470 9 g/cm2,respectively.The LC50 of Cry1Ac in the JQ geographic population was significantly higher than that of other geographic populations.【Conclusion】In conclusion,the corn bollworm of He
9、xi Corridor is highly sensitive to Cry1Ab and Cry1Ac proteins,and has not yet developed resistance to them.However,monitoring should be continuously strengthened to avoid the creation of application risks due to cross-resistance.Key words:Hexi Corridor;corn;cotton bollworm;Bt protein;sensitivity棉铃虫
10、Helicoverpa armigera(Hbner)是世界十大植物害虫之一1。该成虫繁殖力强,不仅种间杂交能够产生对寄主适合度更高的种群,提高对逆境的适应性2;而且幼虫寄主范围广泛,取食棉花和玉米等50属170余种作物的繁殖器官3。常常引起棉花蕾铃脱落、玉米果穗“戴帽”、腐烂或霉变等典型症状。全球每年因棉铃虫造成作物经济产量损失巨大4,且为害玉米能够传播黄曲霉毒素与伏马菌素,严重威胁着人类和动物健康5。苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis Berliner)是全球开发转基因作物与杀虫剂、高效防治棉铃虫的一种革兰氏阳性细菌。该菌芽孢形成中产生的伴胞晶体蛋白如Cry1毒素能够
11、通过与受体结合而在昆虫中肠细胞的细胞膜上形成孔道,使中肠细胞的渗透平衡遭到破坏,并最终导致昆虫死亡。Cry1Ab和Cry1Ac 蛋白因其与棉铃虫中肠刷状缘膜囊泡体(BBMVs)的特异性结合力强6,早已成为转Bt抗虫作物开发应用的杀虫蛋白。由于Cry1Ab和Cry1Ac蛋白作用位点相同,棉铃虫对Cry1Ab和Cry1Ac能够产生交互抗性7-10。伴随Bt棉花的长期广泛种植,棉铃虫对Cry1Ac蛋白的适应性增强,显著降低了Bt棉花的杀虫效能,同时产生的交互抗性对Cry1Ab+玉米构成了潜在威胁,成为持续应用 Cry1Ab 和Cry1Ac蛋白,跨作物全局化生物防治棉铃虫的关键科学问题。全球监测数据表
12、明,种植Bt棉花与Bt玉米515 a后,棉铃虫对Cry1Ac抗性等位基因频率大幅增加11。例如:美洲棉铃虫对Cry1Ac的抗性等位基因频率由2000年的0.4310-3升高至2002年的1.3610-3,最大抗性比率由1993年的1.2倍上升至2004年的578倍12-13;澳洲棉铃虫对Cry1Ac的抗性等位基因频率由2002年的0.510-3升高到2016年的 33.010-3 14-15。相比美澳,中国棉铃虫 Cry1Ac抗性水平正在逐年增加16-17,黄河和长江流域的抗性水平较高18-20,西北内陆的抗性水平较低21。河西走廊是中国“丝绸之路经济带”上农作物种子精品繁育的黄金走廊,为国家
13、粮棉补给和丰产增收发挥着重要作用。然而,随着作物结构调整优化,棉花/玉米比例呈现几何指数减少。20162020年间,酒泉、张掖和武威棉花/玉米生产尺度为1 2、1 1 600和1 18022。这种生产尺度为棉铃虫提供了丰富食源和优良栖境,致使棉铃虫灾难性暴发,每年造成作物经济产量损失巨大,尤其是成虫羽化高峰期重叠、交流释放的适合度潜能,使棉铃虫成为玉米的优势害虫23-24。2019 年起,国家批准了若干个转Cry1Ab/Cry1Ab+玉米抗虫品种进入西北玉米区生产应用中。开放转Bt玉米在河西走廊地区的种植可能导致现有转Bt棉花上棉铃虫的自然庇护所比例降低,棉铃虫将面临来自转Bt棉花与转Bt玉米
14、的多种蛋白的选择压力。当不明确田间种群抗性水平时,将Bt棉花与Bt玉米规模化种植,转Cry1Ab+玉米的杀虫效能很可能因为转Cry1Ac+棉花的交互抗性流动而有所折损,产生应用风险。因此,亟需开展河西走廊玉米棉铃虫对Bt蛋白的敏感性监测工作。1材料与方法1.1供试材料Bt蛋白:5.22 mg/mL Cry1Ab蛋白、4.14mg/mL Cry1Ac蛋白,北京绽诺思特生物科技有限公司生产(http:/)。仪器:eppendorf Multlpette M4移液器(艾本德(上海)国际贸易有限公司);人工气候箱:SANYO MLR-351H。玉米田棉铃虫地理种群:2021年8月上、中旬分别人工采集嘉
15、峪关新城镇新城村(JYG)、酒泉肃州区总寨镇总寨村(JQ)、甘肃省农业科学院张掖试验场(ZY)、张掖甘州区沙井镇沙井村(ZY)、张掖甘州140第 3 期康慰君等:河西地区玉米田棉铃虫对2种Bt蛋白的敏感性监测区党寨镇下寨村(ZY)、武威凉州区吴家井镇农场村(WW)、武威凉州区清源镇清源村(WW)和武威凉州区永昌镇白云村(WW)玉米田中包裹56龄幼虫的玉米雌穗500个,迅速运回室内剥去苞叶、挑选虫龄相对一致的高龄幼虫,单头放入装有10 g人工饲料的料杯、放入30孔塑料托盘中,(261)、RH(7010)%和光周期16L 8D气候箱内培养,每日检查更换饲料直至化蛹,鉴别雌雄后,每个地区种群分别按
16、2020等量混合配对法交配产卵,(261)、RH(7010)%和光周期16L 8D气候箱饲养,孵化的初孵幼虫根据采集地点命名为JYG、JQ、ZY和WW种群,备用。生测平板:参考梁革梅等26改进的饲料配方。试验前先将15 g白糖加入160 mL 50 温水溶化,加入60 g玉米粉、30 g黄豆粉、27 g酵母粉混匀,再加入KOH溶液5 mL、10%甲醛溶液4.5 mL和6%乙酸溶液 12 mL 拌匀至糊状;然后,再将 5 g 琼脂粉、0.55 g 山梨酸和 0.55 g 对羟基苯甲酸甲酯加入到250 mL开水中轻煮2 min,倒入面糊中混匀;最后,依次加入1.9 g抗坏血酸、4.5 mL维生素复
17、合液、0.75 g金霉素眼膏和0.2 mL0.1%噻菌灵,混匀制备成液态饲料,65 水浴保温备用。1.2试验方法生测方法采用饲料表面覆盖毒素法26。首先,用无菌注射器吸取液态饲料、每孔注入0.75 mL至24孔板冷却后,制备成24孔生测平板饲料;然后,用灭 菌 水 将 5.22 mg/mL Cry1Ab 和 4.14 mg/mL Cry1Ac 母液由高到低稀释成浓度为 3.16、1.00、0.316、0.10、0.0316、0.01 g/mL的溶液,以等量灭菌水为空白对照;其次,用M4移液器2.5 mL量程,调到 50 L50 次档位,由低到高顺序吸取各浓度Cry1Ab和Cry1Ac溶液、单穴
18、滴定50 L至24孔生测平板饲料上,自然阴干制备成空白对照(CK)和0.01、0.031 6、0.10、0.316、1.00、3.16 g/mL的带毒饲料,每种蛋白的每个浓度各滴定4个24孔板,即每个处理4次重复,需接种96头幼虫;最后,毛笔轻挑JYG、JQ、ZY和WW种群的初孵幼虫,接种于上述空白对照和带毒饲料平板上,每孔接入1头幼虫,加盖装有吹塑纸的盖子,防治幼虫逃跑,用橡皮筋十字交叉法系紧后,置于(261)、RH(7010)%和光周期16L 8D的气候箱饲养7 d后,检查记载存活的幼虫数量,分别计算LC50与LC99。1.3数据分析Microsoft Office Excel 2010计
19、算河西走廊玉米棉 铃 虫 JYG、JQ、ZY 和 WW 种 群 对 Cry1Ab 和Cry1Ac蛋白的死亡率和校正死亡率,DPS数据处理系统 V 9.50 软件的数量型数据机值分析法,计算JYG、JQ、ZY和WW种群对Cry1Ab和Cry1Ac的蛋白的LC50和LC99及95%置信区间。2结果与分析2.1棉铃虫对Cry1Ab蛋白的敏感性由表1表明,河西走廊玉米棉铃虫JYG、JQ、ZY和 WW 地理种群对 Cry1Ab 蛋白的 LC50值分别为0.116 2(0.066 00.204 7)、0.146 0(0.092 30.230 9)、0.172 1(0.085 40.347 1)、0.200
20、 4(0.146 50.274 1),LC99值分别为7.277 8(2.235 523.692 8)、6.080 7(2.382 415.519 8)、97.066 6(9.274 51 015.901)、27.103 7 g/cm2(11.513 163.806 5)。LC50值高低顺序依次为 WWZYJQJYG,LC99值高低顺序依次均为 ZYWWJYGJQ。2.2棉铃虫对Cry1Ac蛋白的敏感性结果表明(表 2),河西走廊玉米棉铃虫 JYG、JQ、ZY和WW地理种群对Cry1Ac蛋白的LC50分别为 0.105 0(0.002 20.051 2)、0.255 4(0.166 00.39
21、3 0)、0.017 2 g/cm2(0.008 70.034 0)、0.045 6 g/cm2(0.035 50.061 0),LC99分 别 为0.159 8(0.064 40.396 4)、11.795 3(4.357 431.929 4)、1.190 4(0.645 92.194 1)、7.470 9 g/cm2(4.623 212.072 4)。LC50值高低顺序依次为JQWWZYJYG,LC99值高低顺序依次均为ZYWWJYGJQ。其中JQ地理种群的LC50值显著高于其他3个地理种群。3讨论棉铃虫对Bt蛋白的敏感性直接影响着转Bt作物的防治效果,事关应用转Bt作物控制棉铃虫的全局。
22、本研究首次发现:河西走廊玉米地发生的棉铃虫 对 Cry1Ab 蛋 白 的 LC50值 范 围 在 0.116 20.200 4 g/cm2之 间,LC99值 范 围 在 6.080 7141甘肃农业大学学报2023 年97.066 6 g/cm2之间;对Cry1Ac蛋白的LC50值范围在0.010 50.255 4 g/cm2之间,对Cry1Ac蛋白的LC99值在0.159 811.795 3 g/cm2之间。近年来对国内各棉区棉铃虫的抗性发展情况报道不少,其中黄河流域和长江流域棉区棉铃虫对Bt蛋白的抗性水平较高17-19,而西北内陆棉区棉铃虫对Bt的抗性水平较低21,例如20042005年陈
23、海燕等测定的河南、河北和新疆采集的棉铃虫种群对 Cry1Ac 蛋白的LC50值范围为河南地理种群:0.1970.131 g/cm2,河北地理种群:0.0660.106 g/cm2,新疆地里种群:0.0250.029 g/cm2;20072009年张洋等测定的河北、河南和山东的棉铃虫种群对Cry1Ac蛋白的LC50值范围为河北地理种群:0.4670.509 g/cm2,河南地理种群:0.2090.314 g/cm2,山东地理种群:0.2240.258 g/cm2;2012年潘利东等测定了河北、湖北和安徽棉铃虫种群对Cry1Ac蛋白的LC50值范围为河北邱县地理种群:14.38 g/cm2,湖北枣
24、阳地理种群:6.94 g/cm2,湖北枣阳荆州地理种群:5.89 g/cm2,安徽地理种群:3.64 g/cm2;2014年刘艳27测定了北疆棉花种植区棉铃虫对Cry1Ac毒蛋白的LC50范围为1.227.31 g/cm2。本研究对河西走廊制种基地棉铃虫各地理种群的敏感性检测结果中LC50值最高在0.25左右,与20042005年河南、河北,20072009年河南地、山东等地的检测结果相接近,说明河西走廊玉米棉铃虫对Cry1Ab和Cry1Ac蛋白的敏感性较高,尤其对Cry1Ac蛋白的敏感性高于Cry1Ab蛋白。此外,由于Cry1Ab和Cry1Ac作用位点相同,且Cry1Ac蛋白与BBMVs的结
25、合力强于Cry1Ab蛋白,促使棉铃虫易对Cry1Ab和Cry1Ac蛋白产生交互抗性。例如:Cry1Ac单边筛选5代、11代、28代和210代后,棉铃虫对Cry1Ac蛋白的抗性增加13倍、123倍、564倍和606倍,同时对Cry1Ab蛋白的抗性增加5倍、46倍、48倍和100倍7-10。此类研究表明,棉铃虫若对Cry1Ac产生抗性,必对Cry1Ab产生交互抗性。本次研究测定的棉铃虫敏感性水平较高,尚未表1河西走廊玉米棉铃虫对Cry1Ab蛋白的敏感性Table 1Sensitivity of corn earworm to Cry1Ab protein in Hexi Corridor种群Pop
26、ulationJYGJQZYWW回归方程Regression equationy=1.294 8x+6.210 2y=1.436 3x+6.200 3y=0.845 6x+5.646 2y=1.091 6x+5.762 1相关系数Correlation coefficient0.961 40.973 30.940 20.987 2LC50/(g cm-2)0.116 2 a0.146 0 a0.172 1 a0.200 4 aLC50的95%置信区间LC50 confidence interval0.066 00.204 70.092 30.230 90.085 40.347 10.146 5
27、0.274 1LC99/(g cm-2)7.277 8 a6.080 7 a97.066 6 a27.103 7 aLC99的95%置信区间LC99 confidence interval2.235 523.692 82.382 415.519 89.274 51015.90 111.513 163.806 5同列不同小写字母表示不同地理种群间差异显著(P0.05)。Different minuscule in the same column indicate significant difference(P0.05).表2河西走廊玉米棉铃虫对Cry1Ac蛋白的敏感性Table 2Sensit
28、ivity of corn earworm to Cry1Ac protein in Hexi Corridor种群PopulationJYGJQZYWW回归方程Regression equationy=1.969 3x+8.894 7y=1.397 7x+5.828 4y=1.264 8x+7.230 6y=1.054 8x+6.405 1相关系数Correlation coefficient0.905 40.976 90.975 10.993 4LC50(g/cm2)0.010 5 b0.255 4 a0.017 2 b0.046 5 bLC50的95%置信区间LC50 confidenc
29、e interval0.002 20.051 20.166 00.393 00.008 70.034 00.035 50.061 0LC99(g/cm2)0.159 8 a11.795 3 a1.190 4 a7.470 9 aLC99的95%置信区间LC99 confidence interval0.064 40.396 44.357 431.929 40.645 92.194 14.623 212.072 4同列不同小写字母表示不同地理种群间差异显著(P0.05)。Different minuscule in the same column indicate significant dif
30、ference(P0.05).142第 3 期康慰君等:河西地区玉米田棉铃虫对2种Bt蛋白的敏感性监测发现河西地区棉铃虫种群对Cry1Ab和Cry1Ac蛋白存在明显的交互抗性的现象,但测定结果显示,WW和JQ地理种群对Cry1Ab和Cry1Ac蛋白产生抗性的风险性较高,因此应该持续加强监测,以避免Bt交互抗性产生应用风险。4结论河西走廊地区棉铃虫对Cry1Ab和Cry1Ac蛋白的敏感性水平较高,且对Cry1Ac蛋白的敏感性高于Cry1Ab蛋白,尚未发现存在交互抗性的现象,因此在河西走廊地区应用转Cry1Ab+或转Cry1Ac+基因的作物防治棉铃虫,暂无防效折损风险。但是应该持续加强监测,进一步
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