基于高效液相色谱-二极管阵列检测器法的复康宁胶囊有效成分含量测定的方法学研究.pdf

【作者简介】*陈土振（1991），男，中药师【电子邮箱】DOI:10.13493/j.issn.1672-7878.2023.05-005基于高效液相色谱-二极管阵列检测器法的复康宁胶囊有效成分含量测定的方法学研究陈土振*广东省中医院，广 州 510170【摘要】目的：基于高效液相色谱-二极管阵列检测器法（high performance liquid chromatography-diode array detection，HPLC-DAD）构建复康宁胶囊有效成分的含量测定方法，为复康宁胶囊的质量评价提供依据。方法：采用HPLC-DAD，以Agilent C18 柱（250 mm4.6 mm，5 m）作为色谱柱，动相为乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），切换检测波长进行梯度洗脱，流速为 0.8 mL/min，柱温为 30；测定复康宁胶囊中野黄芩苷、野黄芩素、太子参环肽 B、车叶草苷酸和车叶草苷 5 种有效成分的含量。结果：分析结果显示，野黄芩苷、野黄芩素、太子参环肽 B、车叶草苷酸和车叶草苷的回归方程分别为 y6.983 5105x+268.7（R=0.999 9）、y6.113 7105x+412.6（R=0.999 8）、y5.345 6105x318.9（R=0.999 7）、y8.974 2105x374.4（R=0.999 6）和 y1.102 8106x439.8（R=0.999 7），并且 5 种有效成分的专属性、精密度、稳定性、重复性和回收率试验均非常良好；含量测定结果显示，复康宁胶囊中野黄芩苷、野黄芩素、太子参环肽 B、车叶草苷酸和车叶草苷的含量分别为19.87820.371 mg/g、10.78811.122 mg/g、1.7822.013 mg/g、0.7620.812 mg/g 和 1.0871.234 mg/g。结论：采用 HPLC-DAD 测定复康宁胶囊中野黄芩苷、野黄芩素、太子参环肽 B、车叶草苷酸和车叶草苷具有良好的专属性、精密度、稳定性、重复性和回收率，并且测定方法快速、简便、准确，是一种较好的复康宁胶囊质量控制方法。【关键词】高效液相色谱-二极管阵列检测器法；复康宁胶囊；含量测定【中图分类号】R 917【文献标志码】A【文章编号】1672-7878（2023）05-0470-05Methodological Study on the Assay of Effective Components in FukangningCapsules Based on HPLC-DADCHEN Tu-zhen*Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine,Guangzhou 510170,ChinaABSTRACTObjective:To establish a method for the assay of effective components in Fukangning Capsules basedon high performance liquid chromatography-diode array detection(HPLC-DAD),and provide a basis for the qualityevaluation of Fukangning Capsules.Methods:The HPLC-DAD was adopted,Agilent C18 column(250 mm4.6 mm,5m)was used as a chromatographic column,the mobile phase was acetonitrile(A)-0.1%phosphoric acid solution(B),the detection wavelength was switched for gradient elution,the flow rate was 0.8 mL/min,and the column temperaturewas 30.The contents of five effective components in Fukangning Capsules,including baicalin,scutellarin,heterophyllinB,desacetyl asperuloside acid and asperuloside,were determined.Results:The analysis results showed that the regressionequations for baicalin,scutellarin,heterophyllin B,desacetyl asperuloside acid and asperuloside were y6.983 5105x+268.7(R=0.999 9),y6.113 7105x+412.6(R=0.999 8),y5.345 6105x318.9(R=0.999 7),y8.974 2105x374.4(R=0.999 6)and y1.102 8106x439.8(R=0.999 7),respectively,and the specificity,precision,stability,repeatability and recovery rate of the five effective components were all very good.The assay results showed that thecontents of baicalin,scutellarin,heterophyllin B,desacetyl asperuloside acid and asperuloside in Fukangning Capsuleswere 19.878-20.371 mg/g,10.788-11.122 mg/g,1.782-2.013 mg/g,0.762-0.812 mg/g and 1.087-1.234 mg/g,respectively.Conclusion:HPLC-DAD for the assay of baicalin,scutellarin,heterophyllin B,desacetyl asperuloside acid andasperuloside in Fukangning Capsules has good specificity,precision,stability,repeatability and recovery rate.This assaymethod is fast,simple and accurate,and is a good quality control method for Fukangning Capsules.KEY WORDShigh performance liquid chromatography-diode array detection;Fukangning Capsule;assayAnti Infect Pharm,2023,20(05):470-474抗 感 染 药 学Anti Infect Pharm 2023 May;20(05)陈土振.基于高效液相色谱-二极管阵列检测器法的复康宁胶囊有效成分含量测定的方法学研究470复康宁胶囊（原名为复康灵胶囊）处方由半枝莲、太子参、黄芪、醋莪术、白花蛇舌草、制何首乌等14 味中药组成，是广东省中医院研制的院内制剂，主要用于乳腺癌的治疗，可以通过调控乳腺癌多药耐药基因 p170 和 GST-的表达来增强化疗效果1。相关文献表明，半枝莲-白花蛇舌草通过多靶点、多通路发挥抗乳腺癌作用2，在复康宁胶囊组方中半枝莲和白花蛇舌草药材占比较高，对临床疗效起到重要作用。目前，对复康宁胶囊质量标准的研究还是空白，但有学者对处方中单味药材含量测定方法进行了检索和研究。王治阳等3采用高效液相色谱法同时测定了不同产地半枝莲中 8 个黄酮类成分的含量，肖承鸿等4采用 HPLC 波长切换法对太子参的指纹图谱进行了研究，高丹等5对白花蛇舌草中车叶草苷等成分进行了分离和含量测定。为了更好地控制复康宁胶囊的质量，保证其临床疗效，笔者基于高效液相色谱-二极管阵列检测器法（high performance liquid chromatography-diode arraydetection，HPLC-DAD）构建复康宁胶囊中野黄芩苷、野黄芩素（半枝莲中指标成分）、太子参环肽 B（太子参中指标成分）和车叶草苷酸、车叶草苷（白花蛇舌草中指标成分）等 5 种有效成分的含量测定方法，以期为复康宁胶囊的质量评价提供依据。1仪器与试药1.1仪器Agilent 1260 高效液相色谱仪（配二极管阵列检测器），美国 Agilent 公司；KQ 5200E 型超声波清洗器，昆山超声仪器公司；ME 104E 型电子天平，梅特勒-托利多。1.2试药复 康 宁 胶 囊（批 号 21071202、21071501、21071802）及其阴性对照样品均为医院制备；野黄芩苷对照品（批号 110842-202027，含量 98.2%）购自中国食品药品检定研究院；野黄芩素对照品（批号 MST201014，含量 98.6%）、太子参环肽 B 对照品（批号 MST200812，含量 99.8%）、车叶草苷酸对照品（批号 MST210122，含量 98.5%）和车叶草苷对照品（批号 MST201108，含量 99.4%），均购自成都曼思特生物科技有限公司。2方法与结果2.1色谱条件Agilent C18 色谱柱（250 mm4.6 mm，5 m）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），切换检测波长进行梯度洗脱(335 nm：012 min 16%A，1222 min16%A28%A；204 nm：2236 min，28%A38%A；238 nm：3646 min 38%A42%A，4655 min42%A16%A）；流速 0.8 mL/min；柱温 30；进样体积 10 L。2.2溶液的制备2.2.1混合对照品溶液分别精密称取适量的野黄芩苷、野黄芩素、太子参环肽 B、车叶草苷酸和车叶草苷对照品，先用 50%甲醇溶解定容制得不同浓度的单一对照品溶液，再分别精密吸取适量体积的上述单一对照品溶液，置于同一容量瓶中，加 50%甲醇稀释定容，制得质量浓度为野黄芩苷0.973 2 mg/mL、野黄芩素 0.509 2 mg/mL、太子参环肽 B 0.084 4 mg/mL、车叶草苷酸 0.037 6 mg/mL、车叶草苷 0.051 8 mg/mL 的混合对照品溶液。2.2.2供试品溶液取复康宁胶囊适量，除壳后将内容物研细过 80 目筛，精密称取 1.0 g 的细粉，加50 mL 的 50%甲醇，称定质量，超声提取 30 min，放置于室温，再称定质量，用 50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。2.2.3阴性对照溶液根据复康宁胶囊的处方工艺，分别制备适量的不含半枝莲、太子参和白花蛇舌草的阴性对照样品，并按“2.2.2”项下方法进行处理，制得 3 种阴性对照溶液。2.3专属性试验取混合对照品溶液、供试品溶液和 3 种阴性对照溶液，按照“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图显示，供试品溶液的色谱图和混合对照品溶液的色谱图有保留时间相同的色谱峰，而阴性对照溶液的色谱图在对应位置无色谱峰出现。此外，各组分色谱峰分离度较好，相互之间无干扰，按各组分色谱峰计算理论塔板数都不低于 3 500，表明专属性较好。详见图 1。2.4线性关系考察采用 50%甲醇作为稀释溶剂将“2.1.1”项下制得的混合对照品溶液，分别稀释 0、2、5、10、15、20 倍，得到一系列不同浓度的混合对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件分别取 10 L 进样，记录色谱峰面积。分别以进样浓度 x（g/mL）为横坐标，峰面积 y 为纵坐标，进行线性回归，得回归方程。详见表 1。2.5精密度实验精密吸取“2.2.1”项下的混合对照品溶液 10 L，ISSN 1672-7878/CN 32-1726/R Anti Infect Pharm 抗 感 染 药 学 2023 May;20(05)www.抗感染药学.com Tel:86-0512-87806307471051015202530354045505520018016014012010080604020012345a对照品电子强度(V/mV）保留时间（t/min）051015202530354045505520018016014012010080604020012345b供试品0510152025303540455055200180160140120100806040200345c缺半枝莲阴性对照05101520253035404550552001801601401201008060402002145d缺太子参阴性对照0510152025303540455055200180160140120100806040200213e缺白花蛇舌草阴性对照注：1 为野黄芩苷；2 为野黄芩素；3 为太子参环肽；4 为车叶草苷酸；5 为车叶草苷。图 1供试品、阴性对照品和对照品的 HPLC 色谱图注入液相色谱仪，连续 6 次进样测定峰面积，分别计算 RSD。结果显示野黄芩苷、野黄芩素、太子参环肽 B、车叶草苷酸和车叶草苷的 RSD 值分别为0.77%、0.89%、1.12%、1.08%和 1.25%，均 小 于2.00%，提示该方法的精密度良好。2.6稳定性试验取同一份供试品溶液，在制备后的第 0、2、4、8、12、24 h 分别进样 10 L，测定野黄芩苷、野黄芩素、太子参环肽 B、车叶草苷酸和车叶草苷的峰面积，计算出 RSD 值分别是 0.67%、0.92%、0.78%、1.06%和 1.22%，提示在该检测条件下供试品溶液在 24 h内是稳定的。2.7重复性试验取同一批次复康宁胶囊（批号 21071202），按照“2.2.1”项下供试品溶液制备方法平行制备 6 份，在相同的色谱条件下测定 5 种指标成分的含量和RSD 值，结果显示，野黄芩苷、野黄芩素、太子参环肽 B、车叶草苷酸和车叶草苷含量的 RSD 值分别为 0.91%、0.99%、1.13%、1.24%和 1.30%，提示该方法的重复性良好。2.8回收率试验取已知含量的复康宁胶囊（批号 21071202），除去胶囊壳，将内容物研细过 80 目筛，精密称定细粉约 0.5 g，做 6 份平行，分别准确加入适量的混合对表 1 各组分线性关系考察结果待测组分野黄芩苷野黄芩素太子参环肽车叶草苷酸车叶草苷回归方程y6.983 5105x268.7y6.113 7105x412.6y5.345 6105x318.9y8.974 2105x374.4y1.102 8106x439.8R 值0.999 90.999 80.999 70.999 60.999 7线性范围（/gmL1）48.66973.225.46509.24.2284.41.8837.62.5951.8ISSN 1672-7878/CN 32-1726/R Anti Infect Pharm 抗 感 染 药 学 2023 May;20(05)www.抗感染药学.com Tel:[phone]电子强度(V/mV）电子强度(V/mV）电子强度(V/mV）电子强度(V/mV）保留时间（t/min）保留时间（t/min）保留时间（t/min）保留时间（t/min）472组分野黄芩苷野黄芩素太子参环肽 B车叶草苷酸车叶草苷样品（mg/g）9.756 59.845 69.837 29.786 49.912 79.864 15.177 25.156 35.162 45.194 25.158 35.207 10.863 80.838 50.865 40.828 70.845 50.876 20.385 60.381 60.382 60.384 50.383 30.381 80.532 80.531 20.529 70.534 40.532 60.531 8添加量（w/mg）9.732 19.732 19.732 19.732 19.732 19.732 15.092 25.092 25.092 25.092 25.092 25.092 20.844 00.844 00.844 00.844 00.844 00.844 00.376 40.376 40.376 40.376 40.376 40.376 40.518 50.518 50.518 50.518 50.518 50.518 5测得量（w/mg）19.568 119.435 819.621 319.684 219.552 119.487 710.234 610.282 310.312 410.285 410.241 210.289 81.701 51.682 11.698 81.672 81.685 21.712 50.756 40.760 20.763 10.755 20.758 80.752 11.042 51.051 21.038 91.048 81.045 71.041 3回收率（%）9.756 598.54100.53101.7099.0598.8999.32100.66101.1499.9899.8299.8199.2599.9598.74100.0199.4999.0998.51100.58101.0998.4999.7698.3898.30100.2998.2199.2198.9698.26平均值（%）99.92100.1299.4299.4798.87RSD（%）1.270.660.501.190.82表 25 种成分的加样回收率试验结果（n=6）照品溶液，按照上述供试品制备方法和色谱条件进行检测，结果显示，野黄芩苷、野黄芩素、太子参环肽 B、车叶草苷酸和车叶草苷的平均回收率分别为99.92%（RSD=1.27%）、100.12%（RSD=0.66%）、99.42%（RSD=0.50%）、99.47%（RSD=1.19%）和98.87%（RSD=0.82%），提示该方法的准确度良好。详见表 2。2.9样品测定取 3 批复康宁胶囊（批号 21071202、21071501、21071802），按照上述供试品制备方法和色谱条件进行检测，做 3 次平行，根据峰面积计算各待测组分的含量（mg/g）。详见表 3。3讨论3.1检测成分的选择复康宁胶囊包含 14 味中药，其中处方用药占比最高的药材是太子参、半枝莲、黄芪、薏苡仁、醋莪术和白花蛇舌草，该药主要用于治疗乳腺癌患者。半枝莲-白花蛇舌草配伍具有较好的抗乳腺癌作用，应将该 2 味中药包含的有效成分作为重要检测指标6-7。笔者在前期实验中对其他中药指标成分进行了探索，根据出峰情况结合制剂质量评价综合考虑后，选择太子参、半枝莲和白花蛇舌草中的有效成分野黄芩苷、野黄芩素、太子参环肽 B、车叶草苷酸和车叶草苷作为复康宁胶囊质量控制的检ISSN 1672-7878/CN 32-1726/R Anti Infect Pharm 抗 感 染 药 学 2023 May;20(05)www.抗感染药学.com Tel:86-0512-87806307473表 3复康宁胶囊各组分含量测定结果（n=3）批号210712022107150121071802野黄芩苷（mg/g）19.8780.1420.1520.1820.3710.19野黄芩素（mg/g）10.7880.0911.1220.1110.9760.13太子参环肽 B（mg/g）1.7820.061.8940.082.0130.09车叶草苷酸（mg/g）0.7880.020.7620.030.8120.03车叶草苷（mg/g）1.1450.051.0870.041.2340.06测成分。3.2流动相的选择为了保证各检测组分色谱峰基线平稳并有良好的分离效果，本研究考察了甲醇-水、甲醇-磷酸、乙腈-冰醋酸、乙腈-磷酸和乙腈-水等不同流动相体系，发现乙腈-磷酸溶剂体系效果最为理想，在此基础上又对磷酸溶液浓度和流动相梯度洗脱比例进行了探索，最终确定了“2.1”项下的流动相和梯度洗脱条件。3.3供试品溶液制备方法的选择本研究考察了不同提取溶剂（甲醇、50%甲醇、30%甲醇、30%乙醇、50%乙醇、乙醇）、不同提取方法（超声、水浴回流、索氏提取）和不同提取时间（15、30、45、60 min）对各待测组分提取率和色谱峰分离效果的影响，最终确定了“2.2.2”项下的供试品溶液制备方法。4小结本研究建立了 HPLC 波长切换法同时测定复康宁胶囊中 5 种有效成分的含量，并对其进行了方法学考察，结果提示该方法稳定可行。运用此方法的 3 批样品的检验结果显示，复康宁胶囊中野黄芩苷含量为 19.87820.371 mg/g、野黄芩素含量为10.78811.122 mg/g、太子参环肽 B 含量为 1.7822.013 mg/g、车叶草苷酸含量为 0.7620.812 mg/g、车叶草苷含量为 1.0871.234 mg/g，测定出不同批次复康宁胶囊各组分的含量波动范围较小，质量较稳定，故该方法可成为一种复康宁胶囊质量控制的有效方法。参考文献1 陈前军，张蓉，司徒红林，等.复康灵胶囊对乳腺癌多药耐药基因 p170、GST-影响的临床研究J.中国药房，2008（21）：1650-1652.2许晶，石凤芹，杜可心，等.基于网络药理学探讨“半枝莲-白花蛇舌草”抗乳腺癌的作用机制J.中国中药杂志，2020，45（18）：4448-4454.3王治阳，安华.HPLC 同时测定不同产地半枝莲中 8 个黄酮类成分的含量J.中国现代中药，2017，19（7）：978-982.4肖承鸿，徐荣，周涛，等.基于波长切换技术的太子参UHPLC 指纹图谱研究J.中药材，2020，43（12）：2971-2976.5 高丹，赵呈呈，李海燕，等.白花蛇舌草中车叶草苷的提取分离及含量测定的研究J.药物分析杂志，2010，30（9）：1654-1657.6 杜江洋，徐元，王楠，等.白花蛇舌草-半枝莲药对组分诱导三阴性乳腺癌细胞凋亡的机制J.中国实验方剂学杂志，2018，24（17）：99-107.7 莫宗成，王敏，罗先钦，等.白花蛇舌草半枝莲配伍抗肿瘤作用研究J.天然产物研究与开发，2016，28（2）：210-215.（收稿日期：2022-11-28责任编辑：董雁）70-75.30 Grippa E,Valla R,Battinelli L,et al.Inhibition of Candida rugosa lipase by berberine and structurally related alkaloids,evaluated by high-performance liquid chromatographyJ.Biosci Biotechnol Biochem,1999,63(9):1557-1562.31 许懿.小檗碱与氟康唑协同抗耐药白念珠菌作用的蛋白质组学研究D.上海：第二军医大学，2007.32 许懿.小檗碱与氟康唑协同抗耐药白念珠菌的作用机制研究D.上海：第二军医大学，2010.33 严孝金.以线粒体为靶点的小檗碱药理活性研究D.北京：清华大学，2017.34 Shitan N,Tanaka M,Terai K,et al.Human MDR1 andMRP1 recognize berberine as their transport substrateJ.Biosci Biotechnol Biochem,2007,71(1):242-245.（收稿日期：2023-02-27责任编辑：丁龙其）（上接第 457 页）ISSN 1672-7878/CN 32-1726/R Anti Infect Pharm 抗 感 染 药 学 2023 May;20(05)www.抗感染药学.com Tel:86-0512-87806307474