毒死蜱降解菌的分离鉴定及其降解条件的优化.pdf

农业与技术 资源环境毒死蜱降解菌的分离鉴定及其降解条件的优化李 辉(衡水学院湿地保护与研究中心 河北 衡水)摘 要:为了筛选出高效降解毒死蜱的菌株 从喷洒过毒死蜱农药的农田中采集土壤样品 采用稀释梯度法分离纯化降解毒死蜱的菌株 共分离筛选出 株能够降解毒死蜱的细菌 其中菌株 对毒死蜱的降解率达到 以上 经 测序结果比对发现 该菌株与 菌株序列相似度达到 初步鉴定该菌为类芽孢杆菌属 为了提高降解率 由单因素试验可知 该菌最适的培养温度是 培养液初始 是 最适培养转速是 为获得最优的降解条件 采用 试验设计及响应面法分析 确定毒死蜱初始浓度为 时 个因素对菌株 降解毒死蜱的影响从大到小依次为培养液的初始 值培养温度培养转速 其最优降解条件为培养温度、初始培养液 值 、培养转速 毒死蜱理论降解率可达 关键词:毒死蜱 降解菌 筛选 降解能力中图分类号:文献标识码:/收稿日期:基金项目:年度衡水学院校级课题(项目编号:)年度衡水市科技计划项目(项目编号:)作者简介:李辉()女 硕士 高级实验师 研究方向:应用微生物学 毒死蜱的化学名称为 二乙基三氯吡啶基硫代磷酸 其分子式为 在室温下稳定 呈白色粒状晶体 能够挥发 具有较轻的硫醇味 不溶于水 能溶于大多数有机溶剂 在碱性介质中容易分解 毒死蜱属于非内吸性的广谱有机磷杀虫剂、杀螨剂 是全球使用最广泛的杀虫剂之一 同时 毒死蜱是一种环境内分泌干扰物 低剂量残留具有明显的生物毒性 可以危害人体的内分泌、呼吸、神经或免疫系统 毒死蜱作为杀虫剂主要用于农业生产 大部分毒死蜱最终会进入土壤环境 其在土壤中自然降解缓慢、残留时间长 对土壤生态系统有着潜在危害 土壤中残留的毒死蜱也会通过渗漏和径流污染地下水和地表水 由于毒死蜱在许多国家和地区的土壤、水等环境中都有检测 所以其在环境中的残留和降解应得到高度重视目前 由于微生物降解法具有环境友好、无二次污染、使用便捷等优点 从而受到人类的青睐 因此 研究具有降解毒死蜱功能的微生物成为热点 微生物降解是通过微生物作用 利用微生物的新陈代谢将毒死蜱转化为小分子等无毒性或毒性小的物质 大量研究证明 在生态系统内微生物对毒死蜱的降解起着重要的作用 微生物具有在土壤中种类丰富、变异性强和易于繁殖等优势 是生物修复的重要部分 本研究采用微生物降解毒死蜱的方法 以长期受毒死蜱污染的种植地土壤为研究对象 在解磷菌分离筛选的基础上 开展毒死蜱降解菌的分离筛选 并对得到的降解菌进行形态特征、生理生化特性鉴定和 鉴定分析 选择毒死蜱作为目标降解物 研究所分离的菌株对毒死蜱的降解能力 并对降解菌株的毒死蜱降解条件进行优化 为毒死蜱高效降解菌的进一步开发和研究提供菌种资源和理论依据 试验材料与方法 试验材料 毒死蜱液体培养基葡萄糖 硫酸铵 氯化钠 硫酸镁 硫酸亚铁 硫酸锰 碳酸钙 氯化钾 毒死蜱 蒸馏水 固体培养基以上培养基加琼脂 值调至 于 灭菌 样品采集样品采集于长期受毒死蜱污染的种植地土壤 将新鲜土样放置于已灭菌的三角瓶中 并用封口膜封口 立即带回实验室 置于 冰箱保存 部分菌株 资源环境 农业与技术 来源于本中心从蚯蚓粪中分离得到 试验方法 菌种的选育采用上述液体培养基 加入 土壤样品 于、恒温振荡培养 采用梯度稀释法和平板划线法进行菌种的分离纯化 将富集菌液进行梯度稀释 选取 个梯度的菌悬液涂布到固体培养基上 每个梯度设 个重复 于 培养 选取具有溶磷圈的菌落进一步分离纯化 将得到的纯培养物转接到毒死蜱液体培养基中 于、恒温振荡培养 测培养液中农药的浓度 毒死蜱含量的测定采用紫外分光光度法检测毒死蜱的含量 先制备的毒死蜱标准液 分别吸取、的毒死蜱标准液到 的容量瓶中 后加蒸馏水定容到刻度线 震荡摇匀 处测 值 菌种 鉴定提取分离纯化菌株的 进行 扩增 将 产物进行测序 根据测序结果与 基因库比对 对菌株进行鉴定 进而构建系统发育树 确定其分类地位 降解菌降解条件的优化毒死蜱降解菌降解条件试验 设计培养温度(、)培养液初始 值(、)培养转速(、)进行毒死蜱降解菌降解条件试验 响应面法优化毒死蜱降解菌的降解条件本试验利用 软件 对培养温度、培养初始 值和培养转速 个因素进行 因素 水平试验 以毒死蜱降解率为响应值 得出最佳降解条件 具体设计见表 表 试验因素与水平表水平因素培养温度/培养液初始 值 培养转速/()结果与分析 毒死蜱标准曲线用石油醚配制 的毒死蜱母液 经稀释配制成一系列浓度的毒死蜱标准液 在 处测定毒死蜱标准液的吸光度 以毒死蜱的浓度为纵坐标以吸光值为横坐标绘图 结果见图 线性回归方程为 相关系数为 表明毒死蜱的浓度和吸收值有较好的线性关系图 毒死蜱标准曲线 毒死蜱降解菌的鉴定通过形态学观察 菌落在固体培养基上为乳白色 湿润粘稠 有光泽 菌落比较大 菌落表面稍微凸起 后期菌落呈淡黄色 并在其周围有一层透明的黏液 如图 所示 该菌株经革兰氏染色后观察为弱阳性 菌体呈直或近直的杆状 产芽孢 芽孢呈椭圆形 如图 所示图 菌株 的菌落形态图 菌株 的菌体形态提取毒死蜱降解菌株的 进行 扩增 将 产物进行测序 根据测序结果与 基因库比对 该菌株与 序 农业与技术 资源环境列相似性达到 初步鉴定该菌株是类芽孢杆菌属 利用 软件构建系统发育树 确定其分类地位图 菌株 的系统发育树 培养条件对毒死蜱降解菌降解率的影响不同培养温度对菌株 降解毒死蜱效果的影响如图 所示 由图 可知 菌株 在最适培养温度时 对毒死蜱的降解率达到 当温度低于 时 菌株 的降解率随温度的升高而升高当温度高于 时 菌株 的降解率随温度的升高而降低 这可能与菌株 体内的毒死蜱降解酶的活性有关 在 时 该酶活性最大 温度高于和低于都会导致该酶活性降低图 不同培养温度对菌株 降解毒死蜱的影响菌株 对毒死蜱的降解率随初始 的变化如图 所示 菌株 对毒死蜱的降解率随初始培养液中酸性的减小而升高 而随初始培养液中碱性的增大而降低 由此可知 该菌对毒死蜱的降解作用最适宜在中性环境中进行 其体内毒死蜱降解酶的最适 值为 此时该菌对毒死蜱的降解率最大 可达 酸性或碱性的环境都会抑制该酶的活性图 不同培养液初始 值对菌株 降解毒死蜱的影响不同培养转速对菌株 降解毒死蜱的影响如图 所示 由图 可知 在 培养转速时 菌株 对毒死蜱的降解率达到 当培养转速低于时 菌株 对毒死蜱的降解率随培养转速的增大而升高 而当培养转速高于 时菌株 对毒死蜱的降解率随培养转速的增大而降低图 不同培养转速对菌株 降解毒死蜱的影响 响应面法优化毒死蜱降解菌的降解条件综合考虑 个因素对菌株 降解毒死蜱的影响在单因素试验的基础上 拟合建立描述响应值()与自变量间关系的多项式模型 借助 对表 中的数据进行多元回归分析 获得菌株 对培养温度、初始 值、培养转速的二元多次回归方程为降解率 由表 可以看出 零点试验点的毒死蜱降解率比较稳定 均在 之上表 菌株 的响应面分析试验设计及结果试验号培养温度/初始 值培养转速/()降解率/根据表 所得结论以及上述所建立的回归方程描述响应值()与各因素间的关系时 全体自变量与因变量间存在的线性关系显著 该多项式模型拟合 资源环境 农业与技术 方程校正决定系数 说明此模型即所建立的多项式模型方程可信度高 预测值与实际值拟合度好 能解释 的响应值变化 试验误差小且根据方差分析结果显示该模型显著(说明模型失拟误差项不显著 说明方程对试验拟合情况较好 误差小 因此该回归方程为菌株 用于降解毒死蜱提供了适宜的模型 由该试验结果的回归分析表 可知 该模型标准偏差()为 平均数为 变异系数()为 表明该模型具有较高的置信度能够有效反映真实值的情况 因此 该模型对菌株 降解毒死蜱条件的优化合理而有效 由表 中各因素的 值判断可知 对菌株 降解毒死蜱的影响从大到小依次为 即培养液的初始 值培养温度培养转速表 菌株 响应分析试验回归分析结果方差来源平方和自由度 均方 值 值 培养温度 值 培养转速 培养温度培养转速 其最优降解条件为培养温度为、初始培养液 值为 、培养转速为 毒死蜱理论降解率可达 目前 微生物降解技术比较有前景 微生物可以代谢农药为自身提供能源 或者微生物自身能够分泌降解农药的酶 李文华从苹果园中筛选到 株对毒死蜱存在较高降解效果的降解菌 其中菌株 的降解力较强 研究了其降解毒死蜱的培养条件 结果发现培养温度为 时 时该菌株毒死蜱降解率可达 提取该菌的胞内酶粗酶液 分别测定在 和 时 该菌的毒死蜱降解率分别为 和 有研究表明 多粘类芽孢杆菌对高残人参中各部位农药残留降解作用不同 并且对生长期、休眠期人参农药残留动态降解效果均有显著影响 刘瑾研究发现 工程菌 能够对含有毒死蜱培养物起到脱毒的作用 这表明该工程菌具有降解毒死蜱的作用 宋胜男等研究发现 人参内生多粘类芽孢杆菌接种 后对培养基中毒死蜱降解率为 人参内生多粘类芽孢杆菌对田间栽培人参根和茎叶中毒死蜱降解率分别为 农业与技术 资源环境 等从被农药污染的农田中筛选得到 株能够降解毒死蜱的菌株 经培养 对毒死蜱的降解率分别可达 和 安霞等筛选地生防细菌 对 种常用杀虫剂(合成拟除虫菊酯类的高效氯氰菊酯、有机磷类的毒死蜱、烟碱类的吡虫啉)的降解率 在原药含量为时 菌株 对 种农药的降解率分别为、和 肖艳萍从自然生态环境中筛选出具有毒死蜱降解能力的 复合微生物菌剂 可应用于毒死蜱污染的有机物及土壤的无毒化修复 国内外有关毒死蜱降解菌的研究较多 但利用类芽孢杆菌降解毒死蜱的研究少见 而有关类芽孢杆菌作为一株生防菌的研究较多 其在降解毒死蜱的效果和机理方面研究很少 本论文筛选到的这株类芽孢杆菌降解毒死蜱效果明显且起效快 培养 其毒死蜱降解率达到 左右这表明该菌株有很好的开发利用前景 今后将把研究重点放在降解毒死蜱机理上 为构建高效农药降解菌剂提供优质的菌种资源 对生态农业发展和保护生态环境起到重要的作用参考文献 .():.():.(.).():.():.:.():.:.袁敏 唐美珍 罗彦鹤 等.盐胁迫下甲维盐毒死蜱对菜田土壤微生物生态效应研究.农业环境科学学报 ():.李怡 武春媛 李玮 等.株毒死蜱降解菌的分离鉴定及其混合降解特性研究.热带作物学报 ():.蒋秋悦.毒死蜱降解菌的分离、鉴定以及联合植物促生菌对土壤的改良.上海:上海师范大学.张群 马晨 张月 等.一株可同时降解毒死蜱和联苯菊酯降解菌的筛选鉴定及其降解特性初探.农药 ():.王金花.毒死蜱降解微生物的筛选及其降解特性研究.泰安:山东农业大学.梁金钟 梅剑秋 王翼雪.果蔬中残留有机磷农药降解菌的选育及鉴定.食品工业科技 ():.():.于婷 董庆龙 刘嘉芬 等.嗜铁细菌 的分离鉴定及其对毒死蜱的降解特性研究.环境科学学报 ():.顾欣 刘文辉 杨环羽 等.有机磷农药广谱降解菌 菌株(.)的筛选、鉴定与降解特性分析.西北农业学报 ():.孙建波 张洪宇 龚忠阔 等.毒死蜱降解菌株的分离鉴定及降解条件优化.食品工业科技 ():.陈琳 祁静 李祖明 等.白菜叶际细菌多样性与毒死蜱降解菌筛选及分离鉴定.食品工业科技 ():.段海明.一株蜡状芽孢杆菌降解毒死蜱的影响因素研究.安全与环境学报 ():.李文华.毒死蜱降解菌的分离、筛选及其降解条件的优化.泰安:山东农业大学.高飞.多粘类芽孢杆菌对人参农药残留动态降解及皂苷动态累积的影响.长春:吉林农业大学.刘瑾.利用细菌生物氧化作用制备锰基键电池电极材料及降解毒死蜱的研究.武汉:华中农业大学.宋胜男 郜玉钢 张雪 等.人参内生多粘类芽孢杆菌对 种农药降解的影响.农药 ():.():.安霞 赵蕾.一株农药降解生防细菌的分离与鉴定.微生物学通报 ():.肖艳萍.复合微生物秸秆腐熟菌剂的筛选及其对毒死蜱残留的影响.昆明:云南农业大学.(责任编辑 常阳阳)