环介导恒温扩增技术检测新型冠状病毒研究进展.pdf

第 28卷 第 4期新型冠状病毒感染（COVID-19）是一种严重急性呼吸系统综合征，自 2019 年底暴发以来，全球已报告确诊病例超过 7.62 亿，死亡病例超过 680 万。新型冠状病毒（SARS-CoV-2）是其病原体，基因组为单股正链 RNA，其中前三分之二编码相对保守的开 放 读 框（open reading frame，ORF）ORF1a 和ORF1b，后三分之一主要编码刺突蛋白 S（spike protein）、包膜蛋白 E（envelope protein）、外膜蛋白 M（membrane protein）和核衣壳蛋白 N（nucleocapsidprotein）4 种结构蛋白1。随着感染人群与扩散区域增加，SARS-CoV-2 的基因组持续进化，从阿尔法、贝塔、伽马、德尔塔、奥密克戎以及如今更为关注的XBB，病毒的传播及免疫逃逸能力不断增强。因此，研发快速便捷的高灵敏性、强特异性的检测技术对SARS-CoV-2 及突变株的早期筛查、诊断及精准防控意义重大。SARS-CoV-2 的实验室检测主要包括三大类方法：以病毒分离培养和鉴定为基础的病原学检测，以核酸检测为基础的分子生物学检测，以及以蛋白质检测为基础的免疫血清学检测2。病毒分离培养特异性强，但条件要求高且培养时间长；抗原抗体检测反应迅速，但灵敏度低、假阳性及假阴性率高3。目前实时荧光定量 PCR 技术（RT-PCR）应用最为广泛，但反应过程需专用仪器，且对实验室环境、人员及技术要求较高。相比之下，等温扩增技术无需昂贵的仪器，集成此技术的便携式检测设备更适用于现场及资源匮乏地区的检测。如环介导恒温扩增技术（loop mediated isothermal amplification，LAMP），核酸序列依赖的扩增技术（nucleicacid sequence based amplification，NASBA），重组聚合 酶 扩 增 技 术（recombinase polymerase amplifica环介导恒温扩增技术检测新型冠状病毒研究进展冯茹荔，刘迪，滕新栋（通信作者）（青岛国际旅行卫生保健中心，山东 青岛 266000）摘要新型冠状病毒（SARS-CoV-2）在全球范围的大流行对世界公共卫生体系提出了巨大挑战。环介导恒温扩增技术（loop mediated isothermal amplification，LAMP）作为一种灵敏度高、特异性强的检测技术，被认为是金标准 PCR 技术的可行替代方案。本文从原理、产物检测方法、在 SARS-CoV-2 检测中的应用及商品化试剂盒方面对 LAMP 技术进行详细阐述。关键词新型冠状病毒新型冠状病毒感染环介导恒温扩增技术中图分类号R446.5文献标识码Adoi10.3969/j.issn.1008-5777.2023.04.010Advances of Loop Mediated Isothermal Amplification in SARS-CoV-2 DetectionFeng Ruli，Liu Di，Teng Xindong（Corresponding Author）（Qingdao International Travel Health Care Center，Qingdao Shandong 266000，China）AbstractThe worldwide pandemic of SARS-CoV-2 poses a great challenge to the world public health system.Loop mediated isothermal amplification（LAMP）as a highly sensitive and specific detection technique and is nowrecognized as a viable alternative to gold-standard PCR.In this paper，we elaborate on LAMP technology in termsof principle，product detection method，application in SARS-CoV-2 detection and commercialized kits.Key wordsSARS-CoV-2COVID-19Loop mediated isothermal amplification基金项目：山东省重点研发计划（重大科技创新工程）（2021CXGC011306）实验研究口岸卫生控制-35口岸卫生控制第 28卷 第 4期tion，RPA）等越来越受到研究人员的关注，也已在SARS-CoV-2 检测中有了较多应用4-5。本文着重介绍环介导恒温扩增技术（LAMP）在检测新型冠状病毒方面的研究进展。1LAMP 基本原理LAMP 技术是日本 Eiken Chemical Co.，Ltd.公司于 1998 年设计的一种新型高效核酸恒温扩增技术，能够在 6065恒温条件下，使用 46 条特异性引物集（针对靶基因 6 个不同区域设计），在链置换DNA 聚合酶的作用下实现核酸快速高效特异的扩增6。LAMP 不需要复杂的实验设备，1560 min 即可完成反应，灵敏度和扩增效率均高于普通 PCR，且定量 LAMP 与 PCR 检测 SARS-CoV-2 的特异性和准确度没有明显差异7-8。LAMP 技术需要 2 个内部引物 FIP、BIP，2 个外部引物 F3、B3，以及 2 个环介导引物 FL、BL。反应过程分为 3 个阶段：反应起始模板的产生、循环扩增阶段和延长再循环阶段。其中第一阶段是在内部引物、外部引物及具有链置换活性的 Bst DNA 聚合酶的作用下生成两端具有哑铃状结构的单链DNA 模板，后续阶段进行对模板的指数扩增和延伸置换反应，最终生成大量不同长度的花椰菜样结构的扩增产物9。2LAMP 技术产物检测方法目前常用的 LAMP 技术产物检测方法主要包括琼脂糖凝胶电泳、浊度法、比色检测、实时荧光、侧流层析和 AC 磁化率测定等。琼脂糖凝胶电泳是较为传统的方法，LAMP 产物电泳后可见各种长度的条带。浊度法是通过浊度仪检测或肉眼观察剧烈反应产生的焦磷酸镁沉淀而判断反应结果。橙绿变色染料（OG Dye）、pH 敏感染料酚红以及荧光染料钙黄绿素、SYTO、SYBR 绿色染料和 EvaGreen都是目前应用较为广泛的染料10。橙绿变色染料及 pH 敏感染料可在阳性反应时产生颜色变化，而荧光染料则是与双链 DNA 结合后发出特定长度的光。其中钙黄绿素较为特殊，是与 LAMP 反应产生的镁形成复合物并在 UV 光下变色11。AC 磁化率测定是利用便携式 AC 敏感度计测量流体力学体积的变化而判断反应结果12。此外，LAMP 技术与微流控芯片13、CRISPR14-15及测序技术16等新技术的联用可以进一步优化结果可视化、提高检测灵敏度。3LAMP 在检测 SARS-CoV-2 方面的应用3.1单基因为靶标ORF1ab 基因为靶标：基于 LAMP 的 SARS-CoV-2 快速检测技术 iLACO17以 ORF1ab 片段为靶标，通过 6 种特异性引物扩增并利用 SYBR（S7563）绿色染料观察结果，检测限低至 10 个拷贝。梁瑞英等18利用 LAMP 建立的可视化恒温 SARS-CoV-2 快速检测方法使用 80灭活 5 min 的临床样本，无需核酸提取，灵敏度最低可达 0.25 拷贝/L。该方法利用 OG 染料的显色特性，60反应 30 min 即可肉眼辨别结果：阳性样品为鲜艳的绿色，阴性样品为橙黄色。N 基因为靶标：靶向 N 基因的一步法单管 RT-LAMP 测定技术使用 pH 指示剂甲酚红在干燥培养箱或水浴锅中反应 40 min，也可使用荧光染料SYTO9 在 实 时 荧 光 定 量 PCR 仪 器 中 63 反 应50 min，检出限为 118.6 拷贝/25 L，并且与包括另外 4 种人类冠状病毒 OC43、229E、HKU-1 和 NL63在内的 17 种常见的人类呼吸道病毒没有交叉反应19。Cas12a 辅助 RT-LAMP/AuNP（CLAP）检测技术能在 40min内肉眼检测到低至 4 拷贝/L 的SARS-CoV-2 RNA，还可以通过使用普通的微板阅读 器 扩 展 为 高 通 量 检 测14。殷 宏 等20建 立 的qRTLAMP 技术进一步提高了检测效率，30 min 内即可完成检测，最低检测限为 200 拷贝/L。RT-LAMP 耦合玻璃纳米孔数字计数方法21可用于快速检测 SARS-CoV-2。由于其固有的单分子敏感性，纳米孔传感器可以比批量光学方法更快地进行结果判断。RdRp 基因为靶标：WarmStart 比色可视逆转录-环介导等温扩增技术22靶向 RNA 依赖性 RNA聚 合 酶（Recombinant dependent RNA polymerase，RdRp）基因，无需复杂昂贵的设备即可在 30min内合成大量核酸，可使 pH 指示剂酚红染料从粉红色变为黄色。该技术的检测限为 1 拷贝/L，37 个阳性和 20 个阴性样品测试的灵敏度和特异性均达100%。3.2多基因为靶标ORF1ab 和 N 基因为靶标：针对 ORF1ab 和 N基因的 RT-LAMP 检测体系对 ORF1ab 基因的最低检测限为 600 拷贝/L，N 基因的最低检测限为 500拷贝/L23。Kzia Gomes de Oliveira 开发了一种由-36第 28卷 第 4期指尖陀螺手动控制的聚苯乙烯碳粉（PS-T）离心微流体结合 RT-LAMP 装置，72反应 10min即可通过肉眼观察检测结果24。LAMP-OSD 测定法使用寡核苷酸链置换（OSD）特异性探针序列的方式读取准确读数作为测定结果，可替代非特异性读取以减少等温方法经常出现的错误信号。通过使用荧光或比色侧流试纸条，可以鉴定出几十到数百个病毒粒子基因组 RNA25。集成芯片 IFAST RT-LAMP 设备平台13，使用表面张力辅助的不混溶过滤技术（IFAST）提取 RNA，通过 RT-LAMP 进行扩增和检测。可在 1h 内提取和检测 470 个拷贝/100L，肉眼观察颜色从粉红色变为黄色即可判断阳性结果。ORF1ab 和 S 基因为靶标：Yan 等26研发使用钙黄绿素直观可视检测 SARSCoV2 的实时浊度仪LAMP 法检测试剂，针对 ORF1ab 和 S 基因设计 5组特异性引物，63反应 20min即可实现对 SARS-CoV-2 的检测，反应的灵敏度分别为 20 和 200 拷贝/L，与 60 种其他呼吸道病原体无交叉反应，具有较高的特异性。nsp8 基 因 和 N 基 因 为 靶 标：RT-LAMP-CRISPR 技术27针对高表达的 nsp8 基因和 N 基因设计引物，检测限为 750 拷贝/mL。尽管 LOD 较高，但 RT-LAMP-CRISPR 检测显示诊断灵敏度和特异性分别为 98.6%和 100%，与实时 RT-PCR 检测相当（P=0.5）。N 基因和 E 基因为靶标：基于 CRISPR 的体外特 异 性 核 酸 检 测 方 法（in vitro Specific CRISPR-based Assay for Nucleic acids detection，iSCAN）15是一个灵敏、特异、易用、低成本的 SARS-CoV-2 端到端检测平台。该技术靶向 N 和 E 基因，可以检测到低至 10 个 RNA 拷贝。RT-LAMP-CRISPR-Cas12模块进一步与侧向流动相结合，可以实现高效的床旁 SARS-CoV-2 检测。RdRp、M 和 ORF1ab 基 因 为 靶 标：EduardoJuscamayta-Lpez 等28开发的 RT-LAMP 技术靶向RdRp、M 和 ORF1ab 基因。与 RT-qPCR 相比灵敏度 提 高 10 倍，诊 断 敏 感 性 和 特 异 性 值 分 别 为100.0%和 98.6%，且未观察到与其他呼吸道病原体的交叉反应，稳定性强。ORF1ab、S 和 N 基因为靶标：Huang 等29开发了一种基于 RT-LAMP 技术的 SARSCoV2 快速检测试剂盒，可在 20 min 完成检测，检测下限为 80 拷贝/mL。该技术无需专用仪器，使用比色变化肉眼即可观察结果。4LAMP 商品化试剂盒由四川大学华西医院联合成都博奥晶芯生物科技有限公司、清华大学共同设计开发的“六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒（恒温扩增芯片）（国械注准 20203400178）30可以检测包括 SARS-CoV-2 在内的 19 种呼吸道常见病毒。此外，武汉中帜生物科技股份有限公司的“新型冠状病毒 2019-nCoV 核酸检测试剂盒（RNA 恒温扩增-金探针层析法）”，杭州优思达生物技术有限公司的“新型冠状病毒2019-nCoV 核酸检测试剂盒（恒温扩增-实时荧光法）”以及上海伯杰医疗科技有限公司的“新型冠状病毒 2019-nCoV 核酸检测试剂盒（恒温 CRISPR法）”均已获批。国外也有包括 iAMP COVID-19Detection Kit、Sherlock CRISPR SARS-CoV-2 kit、Color Genenomics SARS-CoV-2 RT-LAMP Diagnostic Assay、AQ-TOP COVID-19 rapid detection Kit、Pro-AmpRT SARS-CoV-2 Test 等在内的多种试剂盒获批31。5总结与展望过去 3 年的新冠病毒感染疫情凸显了公共卫生对疾病监测及快速检测的需求，现实证明，准确快速的诊断策略对于最大限度地减少或根除传染病的传播具有决定性作用。LAMP 技术依赖内外部引物和链置换 DNA 聚合酶扩增病原体的特异性DNA 序列，特异性强、灵敏度高，且无需精密检测仪器，成本低廉，更适用于机场、火车站、边境、基层社区门诊等条件有限地区的快速人群筛查及床旁检测。但是 LAMP 仍存在一定的不足，比如大部分方法中还需要核酸提取步骤，并不能仅仅使用导热板完成检测；在两步法实验过程中，开盖操作易造成气溶胶污染，产生假阳性结果；肉眼根据颜色变化判断阴阳性，存在较大个体主观差异；大部分指示剂不具有靶标序列特异性，易产生假阳性结果；引物设计繁琐，且 SARS-CoV-2 仍在持续进化，这使得设计一组完全保守的靶标引物极为困难。因此，LAMP 技术的发展还不够成熟，需要采取更多措施来弥补当前的不足。目前，SARS-CoV-2 在人群中的影响及检测量正逐渐变小，但其它呼吸道、消化道传染病以及病媒传播疾病等仍普遍存在，这都是 LAMP 技术进一冯茹荔，等.环介导恒温扩增技术检测新型冠状病毒研究进展-37口岸卫生控制第 28卷 第 4期步发展和完善的广阔土壤。对这些流行病的基于LAMP 技术的探索也会为未来应对突发疾病提供基础。参考文献1 Chan JF，Kok KH，Zhu Z，et al.Genomic characterization of the 2019 novel human-pathogenic coronavirusisolated from a patient with atypical pneumonia after visiting WuhanJ.Emerg Microbes Infect，2020，9（1）：221-236.2 王雪宁，朱元首，江何伟，等.新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的检测技术 J.生命的化学，2020，40（8）：1258-1269.3 Taleghani N，Taghipour F.Diagnosis of COVID-19 forcontrolling the pandemic：A review of the state-of-the-art J.Biosens Bioelectron，2021，174：112830.4 De Felice M，De Falco M，Zappi D，et al.Isothermalamplification-assisted diagnostics for COVID-19J.Biosens Bioelectron，2022，205：114101.5 Boonbanjong P，Treerattrakoon K，Waiwinya W，et al.Isothermal 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