可抑制口腔致病菌变异链球菌的乳酸菌筛选.pdf

中文科技期刊数据库（文摘版）医药卫生 15 可抑制口腔致病菌变异链球菌的乳酸菌筛选 武航婕 刘福存 武秀秀 汪 湛 南京医科大学康达学院，江苏 连云港 222000 摘要：摘要：人体口腔疾病危害颇多，口腔中的致病菌多种多样，乳酸菌的存在可以抑制口腔致病菌变异链球菌的生长，因此文章旨在筛选出能够抑制口腔致病菌变异链球菌生长的乳酸菌。采取自制泡菜水制作富集培养液，利用梯度稀释法对菌落进行初筛、复筛。将变异链球菌作为指示菌，通过牛津杯平板法筛选出对变异链球菌生长有抑制作用的乳酸菌 PZ3、PZ7，观察其位于培养基上的抑菌圈得到对变异链球菌生长的抑制作用最明显的乳酸菌 PZ-7，其抑菌圈直径为(270.25)mm。结果表明，乳酸菌 PZ-7 对口腔致病菌变异链球菌的生长具有抑制效果，能够很好地抑制牙菌斑的产生。关键词：关键词：变异链球菌；菌株筛选；乳酸菌；抑菌活性 中图分类号：中图分类号：R318.08 龋齿是人体口腔环境菌群失衡引起的一类疾病，其在儿童、青少年人群(614 岁)中高发，普遍认为龋齿的主要致病菌之一为变异链球菌1。变异链球菌是一种生长于人体口腔中的革兰氏阳性球菌，具有分泌酸性物质能使牙釉质被腐蚀的的特点，变异链球菌是牙菌斑的主要成分之一，具有极强的耐酸性2，从而腐蚀牙齿破坏口腔健康状况进而导致龋齿，然后将进一步影响日常生活以及心理情况。龋齿的治疗方法大不同于其他疾病，对于龋齿来说防大于治3，龋齿一旦发病将严重损坏牙齿破坏口腔健康。根据调查，现今人们对于龋齿的传统治疗方法为风险评估法4、抗生素药物治疗法5、机械去除法6、益生菌治疗法7。经研究发现，益生菌中的菌种乳酸菌能够有效地抑制口腔疾病龋齿主要致病菌即变异链球菌的生长，能够降低变异链球菌的数量，从而降低发病率予以治疗。世界卫生组织定义益生菌为一种活的细菌，当其使用量足够时，他们对人类和动物的健康有益8。乳酸菌是对我们人体非常有益的一种微生物，其于人体的口腔环境中大量存在，因此越来越多的人选择益生菌治疗法来治疗口腔疾病。相比于传统意义上的药物治疗、机械法治疗，益生菌法显然更加高效，作用明显，安全性极高。目前均有研究表明变异链球菌为龋齿主要致病菌，而能抑制其生长的微生物之一变为乳酸菌，因此本课题欲筛选出优质乳酸菌，探究所筛选的乳酸菌是否可以抑制变异链球菌的生长；探究其益生功能，确定其对人体口腔环境的益生作用，以此来减少龋齿的流行，为人们口腔健康状况提供保障，提升生活质量。1 实验部分 1.1 主要试剂 MRS 培养基、MRS 肉汤，BHI 培养基（脑心浸液培养基），CaCO3，厌氧产气袋（适用于 2.5 L 厌氧罐），革兰氏染色剂试剂盒，Taq DNA 聚合酶、d NTP 混合液、10PCR 反应预混液、Gel-red 核酸染料（10000）、40%丙烯酰胺，琼脂糖，以上试剂均为分析纯。变异链球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均由江苏省海洋资源开发研究院（连云港）提供。1.2 实验方法 1.2.1 乳酸菌的分离（1）样品采集：取自制泡菜水。（2）样品处理和富集：取出 10 mL 泡菜水，过滤后按 3%的接种量接入MRS 肉汤培养基，在 37、150r/min 条件下培养 12 h得到富集培养液。（3）平板初筛：富集培养液梯度稀释，按 10-3、10-4、10-5、10-6进行稀释，于初筛培养基均匀涂布，37无氧培养 24 h，选取长势良好、有明显溶钙圈的菌落，再次通过平板划线分离法进行分离纯化。（4）菌株复筛：将纯化后的单菌落接种于 MRS肉汤中培养，得到分离的乳酸菌。1.2.2 抑制口腔致病菌变异链球菌的筛选 以口腔致病菌变异链球菌为指示菌，分离的乳酸菌为指标菌，采用牛津杯平板法筛选出对变异链球菌中文科技期刊数据库（文摘版）医药卫生 16 有抑制作用、明显抑菌圈的乳酸菌菌株。1.2.3 菌株鉴定（1）细菌细胞形态：利用电子显微镜观察菌株个体形态，以及在 MRS 培养基上的菌落形态。（2）16S rDNA基因鉴定：使用细菌 DNA 基因组提取试剂盒提取具有抑菌活性菌株的基因组，作为模板，进行 16S rDNA 的扩增，用 Bio-Rad GelDocTM EZ 凝胶成像分析仪分析结果。PCR 产物送至上海生工生物有限公司测序，对结果进行同源性比对，并使用 MEGA7.0 软件构建进化树分析。1.2.4 乳酸菌对变异链球菌的抑制效果（1）乳酸菌发酵液制备：将乳酸菌以 3%的接种量，37培养 24h，离心后取上清液，用 0.22 m 的微孔滤膜过滤得到乳酸菌无菌体发酵液。（2）指示菌的制备：取出 50 L 活化后的变异链球菌均匀涂布于 BHI 固体培养基上，并将活化后的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌取 50 L 分别均匀涂布于 LB 培养基上。（3）对变异链球菌生长的抑制效果：在人体中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌是最为常见的菌群之一，枯草芽孢杆菌会使得肠道中的游离氧迅速消耗，造成我们肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，从而间接抑制其它致病菌生长，所以我们选择这三种菌株来和变异链球菌做对比，做乳酸菌对变异链球菌生长的抑制，判断抑制效果。准备四份 200 L 处理后的发酵液作为实验组，四份200 L灭菌的MRS肉汤将其作为对照组。将实验组、对照组分别加入已准备好的指示菌平板中，进行牛津杯抑菌试验。37，24h 后对平板上的抑菌圈进行对比记录。2 结果与讨论 2.1 乳酸菌的筛选 取富集液 1 mL，将富集液按照菌液浓度从 10-3至10-6梯度稀释成不同浓度的菌液，然后把稀释后的菌液涂布在含 CaCO3的 MRS 培养基上，37厌氧培养 24 h，进行形态学观察，对其中有溶钙圈的菌落进行镜检，由于乳酸菌是革兰氏染色阳性细菌，在镜检时观察经革兰氏染色后的乳酸菌会呈现出蓝紫色；最终挑选出溶钙圈较大的 10 株菌株在 MRS 培养基上多次分离纯化。将从自制泡菜水中筛选得到的乳酸菌菌株编号为PZ1-PZ10。这 10 株菌株在 MRS 培养基中生长的菌落形态呈现出圆形，微白色、凸起、湿润、边缘整齐。2.2 对口腔致病菌变异链球菌的抑制 通过牛津杯法对10株疑似乳酸菌进行抑制口腔变异链球菌生长能力的检测，筛选得到对变异链球菌的生长具有抑制效果的 2 株乳酸菌，分别为 PZ3、PZ-7，其中菌株PZ-7对变异链球菌生长的抑制作用最为明显，其抑菌圈最为明显，直径达到了 27 mm（图 1），故选用此株做后续实验。图 1 牛津杯法不同乳酸菌发酵液对变异链球菌的抑菌效果 2.3 形态学特征 如图 2(A)，37培养 24h 后，乳酸菌菌株菌株PZ7 在 MRS 平板上的菌落形态呈现微白色，凸起，湿润，边缘整齐，菌落呈现出圆形。如图 2(B)，经过镜检菌株 PZ7 是革兰氏阳性菌，短杆状细菌。图 2 (A)菌株 PZ7 的菌落形态；(B)菌株 PZ7 的革兰氏染色 2.4 菌株 16S rDNA 的序列分析 以菌株 PZ7 基因组为模板，使用通用引物进行 PCR扩增，经 1%琼脂糖凝胶电泳检测，其片段大小约为1500bp，如图 3(A)。测序后，将菌株 PZ7 的基因序列提交 GenBank 数据库，进行同源性比对，菌株 PZ7 与Lactobacillus yonginensis 的同源性为 93%。构建的系统进化树（图 3(B），从进化树可以看出菌株 PZ7中文科技期刊数据库（文摘版）医药卫生 17 与 Lactobacillus yonginensis 亲缘关系最近。图 3 (A)16S rDNA PCR 产物 1%琼脂糖凝胶检测图；(B)菌株PZ7 系统进化树 2.5 乳酸菌对变异链球菌生长的影响 将培养24 h后的菌株PZ7发酵液，对变异链球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌生长的抑制效果分别进行对比。我们在观察变异链球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的生长状况时，发现其发酵液均具有一定的抑菌活性，但是对变异链球菌生长的抑制效果最为显著，抑菌圈直径达到 28 mm，而大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径分别为 12 mm、18 mm、15 mm，见表 1。结果表明乳酸菌PZ7对变异链球菌的生长有很好的抑制效果，能够有效的控制牙菌斑的产生。表 1 乳酸菌 PZ7 对不同菌株的抑制效果 菌株名称 抑菌圈直径(mm)变异链球菌 280.34 大肠杆菌 120.30 金黄色葡萄球菌 180.25 枯草芽孢杆菌 150.27 3 结论 经过实验，从自制泡菜水中筛选出一株能够抑制口腔致病菌变异链球菌生长的乳酸菌：PZ7。首先用含CaCO3的 MRS 培养基从经过富集的泡菜水中筛选出 10株乳酸菌菌株，这些乳酸菌菌株均有溶钙圈且是革兰氏阳性，接下来对这 10 株乳酸菌菌株进行抑制变异链球菌生长的试验，经观察其中有两株乳酸菌具有抑制变异链球菌生长的效果，分别是 PZ-3、PZ-7，它们抑菌圈直径分别为 210.30 mm、270.25 mm。其中，乳酸菌菌株 PZ-7 的抑菌效果最好，因此我们选择菌株PZ7 进行下一步实验。通过观察得到菌株形态特征以及16S rDNA 基因序列比对分析确定该菌株为永宁乳杆菌(Lactobacillus yonginensis)。进一步对这菌株永宁乳杆菌的抑菌效果进行研究，对四株指示菌生长状况的抑制效果进行比较，分别是变异链球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌，乳酸菌 PZ-7 对四株指示菌均有抑制效果，但是对变异链球菌生长的抑制效果最佳，抑菌圈直径达到 28 mm。因此，我们判断乳酸菌菌株 PZ-7 对口腔致病菌变异链球菌的生长有很好的抑制效果，能够有效的控制牙菌斑的产生，对我们下一步使用乳酸菌清除牙菌斑的试验有一定的研究意义。参考文献 1李雨含,李嘉鑫,张诗铭等.变异链球菌噬菌体在龋病防治中的研究进展J.口腔疾病防治,2021,29(03):184-188.2陈冬茹,林焕彩.变异链球菌致龋机制研究新进展J.四川大学学报(医学版),2022,53(02):208-213.3黄思妺.口腔乳酸杆菌的分离鉴定及其益生功能的研究D.军事科学院,2018.4Margherita Fontana,Domenick T.Zero.Assessing patients caries riskJ.The Journal of the American Dental Association,2006,137(9):268-274.5Gannam CV,Chin KL,Gandhi RP.Caries risk assessment.Gen Dent.2018 Nov-Dec;66(6):12-17.6沙国萌,陈冠军,陈彤等.抗生素耐药性的研究进展与 控 制 策 略 J.微 生 物 学 通 报,2020,47(10):3369-3379.7张金磊,陈兴煌.乳酸菌发酵液在食品贮藏保鲜中的 应 用 研 究 进 展 J.中 国 调 味 品,2020,45(10):158-162.8Elizabeth Krall Kaye.Daily Intake of Probiotic Lactobacilli May Reduce Caries Risk in Young ChildrenJ.The Journal of Evidence-Based Dental Practice,2017,17(3):126-130.9彭悦,孟祥晨,朱德全,等.对口腔变异链球菌具有抑 制 作 用 的 乳 杆 菌 的 筛 选 J.食 品 科 技,2014,39(7):5.10林丽萍,梁敬钰,吕晔.毛冬青中有效成分的分离及其对两种主要口腔致病菌的抑制作用J.药物评价研究,2013(6):4.基金项目：南京医科大学康达学院大学生创新创业训练项目重点项目（编号：202113980YJ02）。