黄芪提取物调节IL-6_STAT3信号通路治疗马兜铃酸Ⅰ诱导肝肾损伤小鼠模型的效果观察.pdf

?：黄芪提取物调节 信号通路治疗马兜铃酸诱导肝肾损伤小鼠模型的效果观察朱 哿 瑞，皮 亚 妮，王静，黄恺，彭渊，陈 高 峰，刘 成 海，陶 艳 艳上 海 中 医 药 大 学 附 属 曙 光 医 院 肝 病 研 究 所，上 海；上 海 中 医 药 大 学 中 医 药 国 际 标 准 化 研 究所，上 海；上 海 市 中 医 临 床 重 点 实 验 室，上 海；肝 肾 疾 病 病 证 教 育 部 重 点 实 验 室（上 海中 医 药 大 学），上 海通 信 作 者：陶 艳 艳，（：）摘 要：目 的 探讨黄芪提取物（）改善马兜铃酸（）致小鼠急性肝、肾损伤效果及其调控 信号通路的作用机制。方 法 健康雄性 小鼠 只，采用简单随机分组法分为正常组（）、模型组（）、组（）和 乙酰半胱氨酸（）组（）。模型组小鼠以 腹腔注射，次，持续 。正常组小鼠腹腔注射相同容积羧甲基纤维素钠。组、组 腹腔注射，次，持续 ；第 天分别按 、小鼠体质量剂量灌胃，次，持续。为阳性对照药。给药造模结束后，处死小鼠并收集血清及肝、肾组织。试剂盒检测血清、肌酐（）、尿素氮（）水平；染色观察肝、肾组织病理；荧光 及免疫组化分析肝、肾组织中 表达量；酶联免疫吸附实验检测肝、肾组织 、及 表达水平。计量资料多组间比较采用单因素方差分析，进一步两组间比较采用 检验。结 果与正常组小鼠相比，模型组小鼠肾体比上升（）；与模型组相比，组、和 水平显著降低（值分别为、，值均 ）；染色结果表明，可有效减轻 导致的肝、肾组织结构破坏和炎性细胞浸润；荧光 及免疫组化染色结果表明，可减少肝、肾组织 表达；酶联免疫吸附检测发现，可下调、及 表达。与 效应相似，两者间无明显差异。结 论 对 所致急性肝、肾损伤有保护作用，其部分作用机制可能与抑制 信号通路激活，减轻炎症反应有关。关 键 词：马兜铃酸；化学性与药物性肝损伤；急性肾损伤；转录因子；黄芪基 金 项 目：上海市科委科技支撑项目（）；上海市中医药三年行动计划（），（，；，；，；，）：，（：）：（）（）朱 哿 瑞，等黄 芪 提 取 物 调 节 信 号 通 路 治 疗 马 兜 铃 酸诱 导 肝 肾 损 伤小 鼠 模 型 的 效 果 观 察 ，（）；，（），（），（），（）；（），（），（），（），（，）；，：；：（）；（）马 兜 铃 酸 主 要 存 在 于 马 兜 铃 属 和 细 辛 属 植 物中，如 马 兜 铃、天 仙 藤、广 防 已 等。研 究证 明，马兜 铃 酸 具 有 免 疫 激 活、抗 炎、肾 毒 性、致 癌 性 和 致 突 变等 作 用。笔 者 团 队 前 期 研 究 发 现，马 兜 铃 酸（，）可 导 致 急 性 肝、肾 损 伤，其毒 理 机 制 可 能 与 氧 化 应 激、炎 症 反 应、糖 代 谢 等 途 径相 关。黄 芪 是 中 医 临 床 常 用 药 亦 是 补 气 圣 药，神 农 本草 经 记 载：“黄 芪，味 甘，性 微 温，归 肺、脾、肝、肾 经”，可 补 益 元 气 而 脱 毒，治 一 切 气 衰 血 虚 之 症。黄 芪 的药 理 作 用 包 括 保 护 心、脑、肾 等 组 织，改 善 肝 脏 损 伤，提高 免 疫 功 能 等 方 面，广 泛 应 用 于 临 床。本 研 究 以 诱 导 小 鼠 急 性 肝、肾 损 伤，并 观 察 黄 芪 提 取 物（，）的 调 控 作 用 及 其 机 制。材 料 与 方 法 实 验 动 物健 康 雄 性小 鼠，周 龄，级，共只，体 质 量（），购 于 北 京 维 通 利华 生 物 有 限 公 司 实 验 动 物 生 产 许 可 证 号：（京）。所 有 小 鼠 均 饲 养 在 上 海 中 医 药大 学 实 验 动 物 中 心 实 验 动 物 使 用 许 可 证 号：（沪），自 由 饮 水，环 境 温 度，湿度。药 物 与 试 剂 （批 号：），购 自 上 海 诗 丹 德标 准 技 术 服 务 有 限 公 司，纯 度。冰 箱 存 放 备用。委 托 上 海 现 代 制 药 股 份 有 限 公 司 代 加 工 制 成，具体 方 法 如 下：黄 芪 ，以乙 醇 提 取次，每次 回 流。提 取 液 组 合、过 滤、减 压 浓 缩、冻 干，并采 用 中 药 指 纹 图 谱 进 行 质 量 控 制，其 主 要 活 性 物 质 为黄 芪 总 皂 苷，其 中 毛 蕊 异 黄 酮 苷 含 量 为 、黄 芪 甲 苷 含 量 为 。乙 酰 半 胱 氨 酸（，）颗 粒（商 品 名：富 露 施，包，海 南 赞 绑 制 药 有 限 公 司，批 号：）。羧 甲 基 纤 维 素 钠（批 号：），购 自 国 药 集 团 化学 试 剂 有 限 公 司。临 床 肝 胆 病 杂 志 第卷 第期年月 ，（批 号：）、总提 取试 剂 盒（批 号：），购 自 上 海 生 工 生 物 工 程 股 份有 限 公 司；反 转 录 试 剂 盒（批 号：）、扩 增 试 剂 盒（批 号：）均 购 自 日 本公 司。苏 木素伊 红（）染 液（货 号：），购 自 南 京 建成 公 司。免 疫 组 化 抗 体：磷 酸 化（，）抗 体（批 号：）购 自 美 国公 司；免 疫 组 化 染 色 试 剂 盒（货 号：兔）、显 色 试 剂 盒（货 号：）均 购 自 武 汉 博 士 德 公 司。主 要 仪 器荧 光 倒 置 显 微 镜（日 本公 司）；微 孔 板 分 光 光 度 计（美 国 公 司）；实 时 荧 光 定 量仪（美 国 公 司）；全 自 动 组 织 脱 水 机、石 蜡 包 埋机、石 蜡 切 片 机 均 由 德 国 莱 卡 公 司 提 供；水 浴 摊 片 机、烘 片 机 均 由 荷 兰 飞 利 浦公 司 提 供。研 究 方 法 分 组 与 造 模、给 药小 鼠 适 应 性 饲 养周，按 体质 量 采 用 简 单 随 机 分 组 法 分 为组：正 常 组（）、模 型组（）、组（）和组（）。模 型 组 小鼠 以 腹 腔 注 射，次，持 续 。正常 组 小 鼠 腹 腔 注 射 相 同 容 积 羧 甲 基 纤 维 素 钠。组、组 以 腹 腔 注 射，次，持 续；第天 分 别 按 、小 鼠体 质 量 剂 量 灌 胃，次，持 续。作 为 阳 性 对 照药 使 用。检 测 指 标 与 方 法 肝、肾 脏 器 指 数 测 定小 鼠 以戊 巴 比 妥钠 麻 醉 后，摘 取 肝 脏 及 双 肾，肉 眼 观 察 大 体 形 态，称重，除 以 小 鼠 体 质 量，计 算 肝 体 比（）、肾 体 比（）。肝 体 比肝 脏 质 量（）体 质 量（）。肾体 比肾 脏 质 量（）体 质 量（）。血 清 肝、肾 功 能 测 定小 鼠 麻 醉 后，用 注 射 器 从 下 腔 静 脉 抽 取 新 鲜 血 液，以，离 心，吸 取 上 层 血 清 送 至 上 海 中 医 药 大 学 附 属曙 光 医 院 检 验 科 检 测 血 清、活 性 及 肌 酐（）、尿 素 氮（）水 平。肝、肾 组 织染 色小 鼠 肝、肾 组 织 经中性 甲 醛 缓 冲 液 固 定，自 动 脱 水 机 脱 水，石 蜡 包 埋，切片，染 色，光 学 显 微 镜 下倍 观 察 并 拍 照。肝、肾 组 织的 基 因 表 达取 全 部 小鼠 肝、肾 组 织 各，加 入 试 剂 及 氯 仿 抽 提 总，应 用 试剂 盒 进 行 逆 转 录 制 备。以 为 内 参 进行 荧 光 定 量扩 增 以 检 测 各 组 肝、肾 组 织 中的 表 达 水 平。反 应 条 件：、预 变 性；变 性，退 火，个 循 环。各 组 均设个 复 孔，采 用 法 计 算 各 目 的 基 因 的 相 对表 达 量。扩 增 引 物 由 上 海 生 工 生 物 工 程 有 限 公 司 合成，引 物 序 列 见 表。表荧 光 定 量基 因 引 物 序 列 基 因 引 物序 列产 物 长 度（）上 游 下 游 上 游 下 游 肝、肾 组 织免 疫 组 化肝、肾 组 织 切片 脱 蜡 至 水，经 过 抗 原 修 复（微 波 修 复 法）后 冷 却 至 室温。滴 加 封 闭 液，加 稀 释 的 一 抗（，稀 释 比 例），冰 箱 过 夜。二 抗 孵 育，显 色。苏 木 素 复 染，二 甲 苯 透 明，中 性 树 胶 封 片，光 学 显 微 镜下倍 观 察 并 拍 照。肝、肾 组 织、及 水 平 检测取 全 部 小 鼠 肝、肾 组 织 各，加 入 生 理盐 水，匀 浆 机 获 得 组 织 匀 浆 液 后，、离 心，收 集 组 织 上 清，法 测 定、及 水 平，具 体 操 作 步 骤 遵 试 剂 盒 说 明 书。统 计 学 方 法采 用 统 计 软 件 进 行 数据 分 析。计 量 资 料 以 表 示，多 组 间 比 较 采 用 单 因素 方 差 分 析，进 一 步 两 组 间 比 较 采 用 检 验。为 差 异 有 统 计 学 意 义。结 果 各 组 小 鼠 一 般 情 况正 常 组 小 鼠 反 应 灵 敏 且 动作 迅 速，被 毛 滑 润 有 光 泽，饮 食 正 常。模 型 组 小 鼠 倦怠，动 作 迟 缓，被 毛 粗 乱 无 光 泽，食 欲 明 显 下 降，染 毒 第天 模 型 组 死 亡只，占 比。组 及组 小 鼠 精 神 萎 靡，皮 毛 无 光 泽，食 欲 下 降；染毒 第天组 死 亡只，占 比。对 模 型 小 鼠 体 质 量 和 脏 器 指 数 的 影 响朱 哿 瑞，等黄 芪 提 取 物 调 节 信 号 通 路 治 疗 马 兜 铃 酸诱 导 肝 肾 损 伤小 鼠 模 型 的 效 果 观 察各 组 小 鼠 活 动、饮 水 饮 食 均 不 受 限，体 质 量 变 化 如 图所 示。结 果 显 示，与 正 常 组 相 比，模 型 组 体 质 量 下 降 明 显（）；且 小 鼠 肝 脏 及 肾 脏 外 观 苍 白。与 模 型 组相 比，组 小 鼠 肝 脏、肾 脏 外 观 未 见 明 显 苍 白；组 肝 脏 外 观 正 常 未 见 明 显 苍 白，肾 脏 肉 眼 可 见 苍 白改 变（图）。图各 组 小 鼠 体 质 量 变 化 图各 组 小 鼠 肝、肾 外 观 改 变 与 正 常 组 小 鼠 相 比，模 型 组 小 鼠 肝 体 比 有 下 降 趋势，但 差 异 无 统 计 学 意 义（），肾 体 比 显 著 升 高（）。与 模 型 组 小 鼠 相 比，组 小 鼠 肝 体 比 有升 高 趋 势，但 差 异 无 统 计 学 意 义（），肾 体 比 下降（）；组 小 鼠 肝 体 比 升 高，肾 体 比 略 有 下降，但 差 异 均 无 统 计 学 意 义（值 均）（表）。表 对 小 鼠 模 型 脏 器 指 数 的 影 响 组 别 动 物 数（只）肝 体 比（）肾 体 比（）正 常 组 模 型 组 ）组 ）组 ）值 值 注：与 正 常 组 相 比，）；与 模 型 组 相 比，）。对 模 型 小 鼠 肝、肾 功 能 的 影 响血 清 肝功 能 提 示，与 正 常 组 相 比，模 型 组 小 鼠 血 清、活 性 明 显 升 高（值 均）；与 模 型 组 相 比，组、及组活 性 均 下 降（值均）。血 清 肾 功 能 提 示，与 正 常 组 相 比，模 型 组小 鼠 血 清、含 量 明 显 升 高（值 均）；与模 型 组 相 比，组、含 量 及组含量 明 显 下 降（值 均）（表）。对 模 型 小 鼠 肝、肾 组 织 形 态 学 改 变 的影 响 染 色 结 果 显 示，正 常 肝 组 织 小 叶 结 构 完 整、肝 细 胞 排 列 整 齐；模 型 组 肝 组 织 主 要 表 现 为 灶 状 坏死、部 分 坏 死、轻 度 汇 管 区 炎 症。正 常 肾 组 织 结 构 正常，肾 小 球、肾 小 管、肾 间 质 均 未 见 到 明 显 改 变；模 型组 肾 小 球 水 肿、肾 小 球 固 缩，肾 小 管 上 皮 细 胞 可 见 变性、坏 死、细 胞 脱 落。与 模 型 组 比 较，组 及组可 见 肝 细 胞 的 坏 死 和 变 性 程 度 有 不 同 程 度 的 减 轻，肾小 管 上 皮 细 胞 坏 死 和 变 性 程 度 也 有 明 显 减 轻，其 中组 改 善 较组 明 显（图）。对 模 型 小 鼠 肝、肾 组 织基 因 表 达 的影 响与 正 常 组 相 比，模 型 组 肝 组 织 表 达上 升（）；与 模 型 组 相 比，组 及组 肝 组 织表 达 量 均 下 降（值 均）。表 对 模 型 小 鼠 肝、肾 功 能 的 影 响 组 别动 物 数（只）肝 功 能（）（）肾 功 能（）（）正 常 组 模 型 组 ）组 ）组 ）值 值 注：与 正 常 组 相 比，）；与 模 型 组 相 比，），）。临 床 肝 胆 病 杂 志 第卷 第期年月 ，与 正 常 组 相 比，模 型 组 肾 组 织 表 达 上 升（），与 模 型 组 相 比，组 及组 肾 组 织表 达 量 均 下 降（值 均）（表）。表各 组 小 鼠 肝、肾 组 织 变 化 组 别 动 物 数（只）肝 肾 正 常 组 模 型 组 ）组 ）组 ）值 值 注：与 正 常 组 相 比，）；与 模 型 组 相 比，）。各 组 小 鼠 肝、肾 组 织 免 疫 组 化 染 色 结果免 疫 组 化 染 色 显 示（图），正 常 组 小 鼠 肝、肾 组织 偶 见 阳 性 表 达，主 要 表 达 部 位 在 细 胞 核，在 胞 浆 也 可 见 阳 性 表 达。染 毒 后，模 型 组 小 鼠 肝组 织 数 量 明 显 增 多（），主 要 分 布在 肝 细 胞 核 及 胞 浆；与 模 型 组 相 比，组 及组肝 组 织 表 达 均 显 著 减 少（值 均）。模型 组 小 鼠 肾 组 织 数 量 也 明 显 增 多（），主 要 分 布 在 近 曲 小 管 上 皮 细 胞 及 胞 浆，肾 小 球 及 远 区 小管 部 也 可 见 阳 性 表 达；与 模 型 组 相 比，组 及组 肾组 织 也 明 显 减 少（值 均）（表）。表各 组 小 鼠 肝、肾 组 织 中 免 疫 组 化 结 果半 定 量 分 析 组 别动 物 数（只）肝 脏 阳 性 染 色 面 积 比（）肾 脏 阳 性 染 色 面 积 比（）正 常 组 模 型 组 ）组 ）组 ）值 值 注：与 正 常 组 相 比，）；与 模 型 组 相 比，）。图各 组 小 鼠 肝、肾 组 织染 色（）（）图各 组 小 鼠 肝、肾 组 织 中 免 疫 组 化 结 果（）（）朱 哿 瑞，等黄 芪 提 取 物 调 节 信 号 通 路 治 疗 马 兜 铃 酸诱 导 肝 肾 损 伤小 鼠 模 型 的 效 果 观 察 对 模 型 小 鼠 肝、肾 组 织、和 水 平 的 影 响与 正 常 组 比 较，模 型 组 小 鼠 肝组 织 中 、和 均 明 显 升 高（值 均）；与 模 型 组 比 较，组 及组、和 水 平 明 显 下 降（值 均），与效 应 相 似。与 正 常 组 比 较，模 型 组小 鼠 肾 组 织 中 、和 均 可 见 升 高（值 均），且 升 高 约倍；与 模 型 组 比较，组 及组、和 可 见 明 显下 降（值 均），两 药 物 组 间 无 明 显 差 异（表）。讨 论 素 问 阴 阳 应 象 大 论 曰“肾 生 骨 髓，髓 生 肝”，明 代 李 中 梓 医 宗 必 读 提 出“乙 癸 同 源，肝 肾 同 源”理 论，中 医 理 论 揭 示 了 肝、肾 在 物 质 方 面 相 生 相 养，生理 功 能 上 相 互 为 用、互 相 制 约 的 密 切 关 系，故 在 病 理上 也 必 然 相 互 影 响。笔 者 团 队 前 期 研 究 中 发 现，可 导 致 急 性 肝、肾 损 伤，主 要 与 炎 症 反 应 等 有 关。本 研 究 结 果 提 示，肝、肾 组 织 中、较 正 常 组 明 显 升 高，这 与 相 关 研 究结 果 一 致。、等 促 炎 因 子 激 活 信 号 通 路，磷 酸 化 的入 核 后 介 导 炎 症 反 应，导致 肝、肾 损 伤。因 此，抑 制 炎 症 反 应 可 能 是 缓解 致 急 性 肝、肾 毒 性 的 良 策。本 研 究 以 诱 导的 急 性 肝、肾 损 伤 模 型，相 比 于 正 常 组，模 型 组 小 鼠 血清、活 性 及、水 平 显 著 增 加，肝 组 织可 见 肝 小 叶 结 构 紊 乱、灶 状 坏 死 和 轻 度 汇 管 区 炎 症，肾 组 织 可 观 察 到 肾 小 球 水 肿、肾 小 球 固 缩 以 及 肾 小 管上 皮 细 胞 坏 死、脱 落，呈 现 明 显 的 肝、肾 毒 性。黄 芪 是 中 医 临 证 最 常 用 的 药 材，具 有“十 药 八芪”的 说 法，素 有“补 药 之 长”的 美 誉。现 代 药 理学 研 究 证 明，黄 芪 具 有 增 强 机 体 免 疫、抗 氧 化、抗 炎 等 多 种 药 理 作 用，能 保 护 肝 脏、肾 脏、心 脑 血 管 等多 种 脏 器。是 半 胱 氨 酸 加 上 乙 酰 基 形 成 的，最 初 归 为 祛 痰 药 类 中 的 黏 液 溶 解 药，新 研 究 表 明具 有 清 除 自 由 基 和 抗 氧 化 作 用，有 助 于 保 护 线 粒 体 功能、抑 制 炎 症，改 善 肝 功 能 和 肾 功 能，广泛 应 用 于 临 床。本 研 究 以干 预 诱 导 的 急 性 肝、肾 损 伤，结果 显 示，组 小 鼠 未 见 死 亡；、和较 模 型 组 下 降 明 显；病 理 结 果 提 示，肝、肾 组 织 炎 性 细胞 浸 润、结 构 破 坏 较 模 型 组 减 轻，在 肝、肾组 织 的 表 达 也 较 模 型 组 减 少；结 果 显 示 肝、肾组 织 、及 等 炎 性 因 子 的 表 达 降低，组 保 护 肝、肾 损 伤 的 效 用 与疗 效 相 当。且对 诱 导 的 小 鼠 急 性 肝、肾 损 伤 的 作 用 机 制可 能 与 其 抑 制 肝、肾 组 织 中 表 达、下 调 促 炎因 子、及 表 达 水 平，减 轻 诱导 炎 症 反 应 有 关。伦 理 学 声 明：本 研 究 方 案 于年月 经 由 上 海 中 医药 大 学 实 验 动 物 伦 理 委 员 会 审 批，批 号：，符 合 实 验 室 动 物 管 理 与 使 用 准 则。利 益 冲 突 声 明：本 文 不 存 在 任 何 利 益 冲 突。作 者 贡 献 声 明：朱 哿 瑞 负 责 动 物 实 验，资 料 分 析，撰 写论 文；皮 亚 妮 协 助 动 物 实 验 和 数 据 整 理；王 静、黄 恺、彭 渊、陈 高 峰 负 责 修 改 论 文；刘 成 海 指 导 课 题 设 计，修改 论 文；陶 艳 艳 负 责 拟 定 课 题 设 计 和 写 作 思 路，指 导撰 写 文 章 并 最 后 定 稿。表 对模 型 肝、肾 组 织 中、和 水 平 的 影 响 ，组 别动 物 数（只）肝 组 织（）肾 组 织（）正 常 组 模 型 组）组）组）值 值 注：与 正 常 组 相 比，）；与 模 型 组 相 比，），）。临 床 肝 胆 病 杂 志 第卷 第期年月 ，参 考 文 献：，（）：，：，：，（）：朱哿瑞，王静，黄恺，等 马兜铃酸致小鼠急性肝毒性的转录组学分析 临床肝胆病杂志，（）：，（）：王帆，王静，黄恺，等 马兜铃酸 致急性肾损伤的分子机制研究 天然产物研究与开发，（）：，（）：曹宇欣，李科，秦雪梅，等 基于部分酸水解寡糖特征图谱及免疫活性评价的不同产地黄芪的品质比较 中草药，（）：，（）：胡妮娜，张晓娟 黄芪的化学成分及药理作用研究进展中医药信息，（）：，（）：崔媛，李海山，宋乃宁，等 马兜铃酸影响小鼠肝脏脂肪酸 氧化和糖代谢以及 循环的代谢组学研究 中国药物警戒，（）：，（）：刘霞，肖瑛，高红昌，等 基于 代谢组学方法分析马兜铃酸 诱导的雌雄小鼠急性肾毒性 高等学校化学学报，（）：，：，（）：罗景慧，杨迎暴 乙酰半胱氨酸对顺铂诱导急性肾损伤后肾脏组织氧化应激水平的影响 中国实验方剂学杂志，（）：，（）：王健，赵硕，任博环 乙酰半胱氨酸对顺铂导致肾毒性的保护作用及作用机制分析 中国免疫学杂志，（）：，（）：王敦，齐健，潘校琦，等 乙酰半胱氨酸拮抗丙烯酰胺的肝肾毒性及机制 中华劳动卫生职业病杂志，（）：，（）：吴娜，高翔，叶之华，等 李瀚教授对“肝肾同源”理论的继承创新 中华中医药学刊，（）：，：，（）：，朱 哿 瑞，等黄 芪 提 取 物 调 节 信 号 通 路 治 疗 马 兜 铃 酸诱 导 肝 肾 损 伤小 鼠 模 型 的 效 果 观 察 ，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：姜辉，顾胜龙，张玉婷，等 黄芪化学成分和药理作用研究进展 安徽中医药大学学报，（）：，（）：李杨，马伟 基于数据挖掘的含有黄芪的中成药配伍规律研究 中国医药导报，（）：，（）：，黄丽静，邓喜亮，覃金凤，等 黄芪注射液辅助 治疗对病毒性肝炎患者肝功能及血清、的影响临床误诊误治，（）：，（）：王寿明，耿家宝，王敏，等 乙酰半胱氨酸治疗药物性肝损伤疗效观察 肝脏，（）：，（）：艾国，王鸣，朱纪玲，等 应用 乙酰半胱氨酸治疗慢性乙型肝炎重度患者临床疗效初步研究 实用肝脏病杂志，（）：，：，（）：，：收 稿 日 期：；录 用 日 期：本 文 编 辑：朱晶引 证 本 文：，（）：朱哿瑞，皮亚妮，王静，等 黄芪提取物调节 信号通路治疗马兜铃酸诱导肝肾损伤小鼠模型的效果观察 临床肝胆病杂志，（）：临 床 肝 胆 病 杂 志 第卷 第期年月 ，