海参抗菌肽的活性筛选与功效评价.pdf

热带海洋学报 JOURNAL OF TROPICAL OCEANOGRAPHY 2023 年 第 42 卷 第 4 期:184194 doi:10.11978/2022208 http:/ 海参抗菌肽的活性筛选与功效评价 袁华标1,2,4,黄靖彤1,2,4,万鹏1,3,4,蔡冰娜1,3,4,潘剑宇1,3,4,张煜航1,2,4,凌娟1,3,4,陈华1,3,4 1.中国科学院南海海洋研究所,中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室,广东 广州 510301;2.中国科学院大学,北京 100049;3.南方海洋科学与工程广东省实验室(广州),广东 广州 511458;4.中国科学院南海生态环境工程创新研究院,广东 广州 510301 摘要:本文将已有文献报道的海洋动物源抗菌肽(毒素除外)与海参蛋白组进行比对,结合生物信息学软件,设计、筛选海参抗菌肽,并对其理化特性、抗菌活性与机制、生物相容性与细胞活性等进行研究。研究结果发现,通过软件模拟与抗菌活性预测,最终筛选并固相合成 7 条海参抗菌肽(H1H7)。其中,H4(RVHRFLRR)可通过细菌膜电位去极化、膜透化等方式,抑制金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)生长,在较低浓 度(31.25gmL1)时,可 使S.aureus 细 菌 总 数 降 至84.93%4.21%(p0.01),P.aeruginosa 细 菌 总 数 降 至95.92%0.52%(p0.01),V.vulnificus 细菌总数降至 77.14%1.37%(p0.01)。H4 生物相容性好,在1000gmL1时均未表现出溶血性或细胞毒性,其可能通过与细胞膜表面受体(EGFR、VEGFR2、FGFR1 等)发生相互作用进而促进细胞迁移。在浓度为 62.50gmL1和 250gmL1时,H4 均可显著促进 L929 细胞发生迁移(p0.05)。实验结果表明,海参抗菌肽 H4 生物相容性好,兼有抗菌、促愈合功效,可望作为一种潜在功能物质用于感染创面的修复与再生。关键词:海参;抗菌肽;生物信息学;细胞迁移;创伤修复 中图分类号:P745.3 文献标识码:A 文章编号:1009-5470(2023)04-0184-11 Screening and efficacy evaluation of antibacterial peptides from Holothuroidea YUAN Huabiao1,2,4,HUANG Jingtong1,2,4,WAN Peng1,3,4,CAI Bingna1,3,4,PAN Jianyu1,3,4,ZHANG Yuhang1,2,4,LING Juan1,3,4,CHEN Hua1,3,4 1.CAS Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology,South China Sea Institute of Oceanology,Chinese Academy of Sciences,Guangzhou 510301,China;2.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China;3.Southern Marine Science and Engineering Guangdong Laboratory(Guangzhou),Guangzhou 511458,China;4.Institution of South China Sea Ecology and Environmental Engineering,Chinese Academy of Sciences,Guangzhou 510301,China Abstract:In this paper,we compared the existing marine animal origin antibacterial peptides reported(Toxin except)with the holothurian proteome,combined with bioinformatics software to design,screen holothurian antibacterial peptides,and to investigate 收稿日期：2022-09-30;修订日期：2022-11-09。姚衍桃编辑 基金项目：广东省海洋经济发展专项(粤自然资合2022036、粤自然资合2020036、粤自然资合2020041);广东省自然科学基金项目(2022A1515010767);广东省重点领域研发计划(2020B1111030004);中国科学院南海生态环境工程创新研究院自主部署项目(ISEE2021PY05);海南省重点研发计划(ZDYF2021SHFZ109)作者简介：袁华标(1997),男,广东湛江人,硕士研究生,从事海洋生物活性肽的分离纯化与活性研究。email: 通信作者：陈华,副研究员。email: Received date:2022-09-30;Revised date:2022-11-09.Editor:YAO Yantao Foundation item:Marine Economy Development Special Project of Guangdong Province(GDNRC2022036,GDNRC2020036,GDNRC2020041);National Natural Science Foundation of Guangdong,China(2022A1515010767);Key-Area Research and Development Program of Guangdong Province(2020B1111030004);Institution of South China Sea Ecology and Environmental Engineering,Chinese Academy of Sciences(ISEE2021PY05);Key Research and Development Program of Hainan Province(ZDYF2021SHFZ109)Corresponding author:CHEN Hua.email: 袁华标等:海参抗菌肽的活性筛选与功效评价 185 1 their physicochemical properties,antibacterial activity,mechanism,biocompatibility and cellular activity.It was found that through software simulation and antibacterial activity prediction,7 holothurian bacteriostatic peptides(H1H7)were finally screened and solid-phase synthesized.Among them,H4(RVHRFLRR)could inhibit the growth of Staphylococcus aureus,Pseudomonas aeruginosa,Vibrio vulnificus through bacterial membrane potential depolarisation or membrane permeabilisation.At a lower concentration(31.25 gmL1),it reduced the total bacterial count of S.aureus to 84.93%4.21%(p0.01),P.aeruginosa to 95.92%0.52%(p0.01)and V.vulnificus to 77.14%1.37%(p0.01).It was also found that H4 was biocompatible and did not exhibit haemolytic or cytotoxic properties at 1000 gmL1.In addition,H4 may interact with cell membrane receptors(EGFR,VEGFR2,FGFR1,etc.)to promote cell migration.H4 significantly promoted the migration of L929 cells at both 62.50 gmL1 and 250 gmL1(p0.50即为 AMP,RF0.50即为 AMP,DA0.50即为 AMP。表中加粗字体表示挑选出的 7条抗菌肽序列 188 热 带 海 洋 学 报 Vol.42,No.4/Jul.,2023 1 从中挑选出 7 条抗菌肽(H1H7,预测抗菌活性好,与文献已发表的海洋抗菌肽多序列比对的共同重叠区域多,序列长度28.00%,最高达 47.62%)和碱性(pI 11.00)。Chem3D 模拟发现,这些抗菌肽呈-螺旋 结构。表 2 H1H7 理化性质分析 Tab.2 Analysis of the physical and chemical properties of H1H7 抗菌肽 肽序列 疏水性/%净电荷/C pI 分子量/Da H1 RGKGGKAWAKAK 33.30+5.00 11.83 1257.51 H2 RSARAGLQFPVGRVHRFLRR 45.00+11.10 13.18 2379.81 H3 KAWAKAKSRSARAGLQFPVGRVHRFLRR 46.43+9.10 13.19 3250.86 H4 RVHRFLRR 37.50+4.10 12.96 1139.38 H5 KPKKAVKPKKP 45.45+6.00 11.21 1248.63 H6 KKAAKKK 28.57+5.00 11.11 801.05 H7 KKAAKKKPAAKPKKAVKPKKP 47.62+11.00 11.51 2270.93 2.2 抗菌活性评价 通过体外抗菌实验(图 1),研究发现 H1 无抗菌活性。H2 对 P.aeruginosa 有一定的抗菌活性,在62.50gmL1时 可 使 细 菌 数 降 至 93.92%1.58%(p0.01)。H3 对 S.aureus、V.vulnificus 的抗菌活性较好,在 31.25gmL1时即可使 S.aureus细菌数显著降至 70.00%4.77%(p0.01),V.vulnificus 细菌数降至57.90%1.48%(p0.01),P.aeruginosa 细 菌 数 降 至94.48%0.92%(p0.01)。H4可显著抑制 S.aureus、V.vulnificus、P.aeruginosa 生长,在 31.25gmL1时可使 S.aureus 细 菌 数 降 至 84.93%4.21%(p0.01),V.vulnificus 细 菌 数 降 至77.14%1.37%(p0.01),P.aeruginosa 细菌数降至 95.92%0.52%(p0.01)。H5、H6 不仅无抗菌活性,还可促进 P.aeruginosa、V.vulnificus 生长。H7 可在一定程度上抑制 S.aureus生 长,在31.25gmL1时 可 使 其 细 菌 数 降 至87.38%4.24%(p0.01);然 而 却 可 促 进P.aeruginosa、V.vulnificus 生长。综上所述,7 条肽中H4 抗菌活性较好,后续将继续研究其抗菌机理、生物相容性和生物活性。2.3 抗菌机制研究 通过膜渗透实验发现(图 2a2c),H4 可显著增加P.aeruginosa 膜的通透性,使进入细胞膜 PI 荧光信号迅速升高(与空白对照组相比,p0.01),在 30 min 时趋于平缓(与 Triton 组相比,无显著差异)。然而,H4对 S.aureus、V.vulnificus 细胞膜的通透性无明显 影响。DiSC3(5)进入细胞膜后因聚集而发生荧光猝灭,膜电位降低时则会重新释放到基质中使荧光强度增加,利用该特性可测定膜电位的变化。通过膜去极化实 验 发 现(图2d2f),H4 可 使S.aureus、P.aeruginosa、V.vulnificus 细胞膜内的荧光信号迅速升高(与空白对照组相比,p0.01),而后趋于稳定,说明H4 具有显著的促进膜电位去极化的作用。2.4 细胞毒性评价 通过 Calcein-AM/PI 染色实验发现(图 3a、3b、3c),H4 在浓度 62.5gmL1时,可使 L929活细胞数量略微增加,而降低死细胞数量;在浓度 250gmL1时,可使活细胞数量进一步增加,而死细胞数量略微降低;在浓度 1000gmL1时,处理组活细胞数量轻微减少(与空白对照组相比,无显著差异),而死细胞数量变化不大。由此可见,在给药剂量为 01000gmL1时,H4 不会造成细胞凋亡或死亡,即无任何毒性。通 过 溶 血 实 验 发 现(图3d),H4 在 浓 度1000gmL1时,均不引起溶血;而浓度过高则会引起 一 定 程 度 的 溶 血(1000gmL1时,溶 血 率 为6.91%2.73%;2000gmL1时,溶血率为 43.26%0.89%)。由此可见,当给药剂量1000gmL1时,H4均不引起溶血,具有良好的生物相容性。2.5 海参抗菌肽细胞活性评价 通过 CCK8 实验发现(图 4),在浓度为 62.5、125、250、500、1000gmL1时,H4 对 L929 细胞活性无明显变化(与空白对照组相比,无显著差异),说明H4 没有促进细胞增殖的作用。通过细胞划痕实验发现(图 5),浓度为 62.5gmL1和 250gmL1的 H4 有促进伤口愈合的作用,相较于空白组有显著性差异。袁华标等:海参抗菌肽的活性筛选与功效评价 189 1 图 1 H1H7对 S.aureus、P.aeruginosa、V.vulnificus细菌总数的影响 与空白对照组比较,*表示 p0.05,*表示 p0.01 Fig.1 Effect of H1H7 on total bacterial counts of S.aureus,P.aeruginosa,V.vulnificus.Compared with control group,*stands for p0.05,and*stands for p0.01 图 2 H4对细胞膜的通透性(ac)和电位去极化(df)的影响 Fig.2 Effect of H4 on cell membrane permeability(ac)and depolarization of cell membrane potential(df)190 热 带 海 洋 学 报 Vol.42,No.4/Jul.,2023 1 图 3 H4与 L929细胞共孵育 24h后的荧光染色照片(a)、死细胞数量计数(b)和活细胞数量计数(c),以及 H4溶血性测定(d)与空白对照组比较,*表示 p0.05,*表示 p0.01 Fig.3 Photograph of live-dead cell staining(a),number of live cells(b),number of dead cells(c)and hemolytic properties of H4(d).Compared with control group,*stands for p0.05,and*stands for p0.01 在 6h 时,250gmL1的 H4 组 细 胞 迁 移 率 为21.81%1.07%,高于空白对照组的 18.04%1.57%(p0.05)。在 24h 时,62.5gmL1的 H4 组迁移率为75.56%3.18%,250gmL1的 H4组为 76.06%3.22%,均高于空白对照组的 63.86%0.74%(p0.01)。在 30h时,62.50gmL1的 H4 组迁移率为 90.13%2.84%(p0.01),250gmL1的 H4组迁移率为 86.15%2.94%(p0.05),高于空白对照组的 77.62%1.92%。在 48h时,各组划痕都基本愈合。在浓度为 1000gmL1时,H4组在各时间段与空白对照组均没有显著性差异。图 4 H4与 L929细胞共孵育 24h后光镜(100)照片(a)和细胞存活率(b)Fig.4 Results of CCK8 assay for cell proliferation viability.Photographs under 100 x light microscope after 24 h incubation(a)and cell viability(b)袁华标等:海参抗菌肽的活性筛选与功效评价 191 1 图 5 H4与 L929细胞共孵育后光镜(100)照片(a)和伤口愈合率(b)与空白对照组比较,*表示 p0.05,*表示 p0.01 Fig.5 Light microscopic(100)photographs of H4 and L929 cells after co-incubation(a)and wound healing rate(b).Compared with control group,*stands for p0.05,and*stands for p0.01 2.6 分子对接模拟 H4 与细胞膜表面受体的相互作用 利用生物信息学软件,模拟 H4 与细胞膜表面受体的相互作用。研究发现,H4 可与 EGFR 氨基酸残基ASN12、LYS13、GLN16、LEU17、GLY18、ASP22、GLU90 形成氢键,与 THR15 形成 unfavorable donor-donor化 学 键,其-CDOCKER ENERGY为114.051kcalmol1(图 6a)。H4可与 VEGFR2氨基酸残基GLY220、ASN253、GLY255、ASP276、LYS286、SER311形 成 氢 键,-CDOCKER ENERGY为123.10kcalmol1(图 6b)。H4 可与 FGFR1 氨基酸残基 ARG250、ASP282、PRO283、GLN284 形成氢键,-CDOCKER ENERGY为 101.12kcalmol1(图 6c)。因此,H4 可能通过与膜表面 EGFR、VEGFR2、FGFR1 相互作用而促进细胞迁移。3 讨论 当海参受到病原体攻击时,它们依靠其有效的细胞和体液先天免疫反应来识别和排除入侵的微生物并修复伤口,这些免疫分子中包括凝集素、抗菌肽、溶菌酶等(Zhuang et al,2015),其中抗菌肽发挥着重要的作用。海参还具有强烈的再生能力,可进行吐脏、体壁、呼吸树、幼虫无性繁殖等再生方式(马健,2010),本文推测其体内含有一些抗菌、促修复效果显著的功能活性物。基于此,本文通过将已有文献报道的海洋动物源抗菌肽(毒素除外)与海参蛋白组进行比对,结合生物信息学软件,进行设计并高通量筛选海参抗菌肽。其中,H4 来源于海参组蛋白 H2A 的 N 末端碱性氨基酸序列。目前,已有多篇文献报道从不同物种中分离出H2A 衍生抗菌肽,如蟾蜍 Buforins(Cho et al,2009)、圆盘鲍鱼 Abhisin(De Zoysa et al,2009)、大西洋比目鱼 Hipposin(Bustillo et al,2014)等。组蛋白 H2A是核小体重要组成部分,参与遗传信息的调节(Osakabe et al,2022),通过特异性剪切其 N 末端产生新颖抗菌肽,参与宿主免疫应答(李成华,2007)。因此,本文推测海参组蛋白 H2A在完成调节遗传信息任务后,可能发生了降解、特异性剪切,产生 N 末端氨基酸序列,进而参与海参免疫应答与创伤修复过程。据文献报道,影响抗菌肽活性的因素主要有净电荷、两亲性、疏水性和二级结构等。因大多数抗菌肽带正电荷,其可与带负电荷的微生物膜相互结合(Ciumac et al,2019)。此外,疏水性、两亲性也是抗菌肽具备跨膜能力的重要因素。亲水端让肽与带负电荷的细菌表面、双层磷脂头基相互作用(Chen et al,2002)。疏水端则插入膜脂质双层中,引起细胞质渗透、膜去极化、膜裂解和细胞死亡(Ong et al,2014)。-螺旋结构对抗菌肽的抗菌活性也至关重要(Lima et al,2021)。研究 192 热 带 海 洋 学 报 Vol.42,No.4/Jul.,2023 1 图 6 H4与 EGFR(a)、VEGFR2(b)、FGFR1(c)互作可视图(肽以黑色显现)Fig.6 H4 interacts with EGFR(a),VEGFR2(b)and FGFR1(c).Peptides are shown in black 发现,本文设计的 H1H7 均带正电荷,疏水性大于28%,呈两亲性、-螺旋特征,CAMPR3上预测 H4 有显著抗菌活性。抗菌肽的正电荷取决于其精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)数量(Tan et al,2021),电荷聚集于肽链 N 端对抗菌活性有利,并可降低细胞毒性(朱宁艺,2021)。Koo 等(2008)的研究发现,蛋白H2A 衍生肽 parasin I 的 N 末端碱性残基对其与细胞膜相互结合是必不可少的。同时,正电荷 Arg 可与两个脂质头基磷酸部分形成强双配位基 H 键,从而促进更强的细胞膜破坏能力(Shao et al,2018)。而抗菌肽 H4(RVHRFLRR)由于富含 Arg、His,带有较高正电荷,在 N 末端含有碱性残基 Arg,因而抗菌活性较好。抗菌肽可通过破坏细胞质成分(如蛋白质、酶、RNA、DNA)或亚细胞区周围的膜结构(Ciumac et al,2019),进而实现膜透化,破坏细菌膜结构。本文研究发现,H4可通过增加膜通透性和引起细菌膜电位去极化的方式实现抗菌目的,而高浓度 H4 具溶血性与其-螺旋抗菌肽作用机理相吻合。抗菌肽除抗菌活性外,还可能具有促愈合、刺激血管通透性、增强吞噬细胞等活性(Hancock et al,2000)。目前,已发现多个抗菌肽具有促创伤修复功能,例如人抗菌肽 LL-37(Ramos et al,2011)、人类-防御素(Niyonsaba et al,2007)、阳离子肽 RBP-LRR(Taniguchi et al,2019)等。抗菌肽可通过激活受体信号通路,进而促进细胞增殖、迁移、伤口愈合与再上皮化(Thapa et al,2020)。研究发现,H4 可能通过与细胞膜表面受体 EGFR、VEGFR2、FGFR1 发生相互作用,浓度为 62.50gmL1、250gmL1的 H4可显著促进 L929 细胞发生迁移。因 H4 具有膜去极化和增加膜通透性的特性,高浓度时可能会影响L929 细胞的增殖迁移效果,从而导致其迁移率比低浓度的差。4 结论 海参抗菌肽 H4 可通过增加细菌膜通透性或引起膜 电 位 去 极 化 等 方 式,抑 制S.aureus、袁华标等:海参抗菌肽的活性筛选与功效评价 193 1 P.aeruginosa、V.vulnificus 生长。H4 在浓度为31.250gmL1时,即可使 S.aureus 细菌总数降至84.93%4.21%(p0.01),P.aeruginosa 细菌总数降至95.92%0.52%(p0.01),V.vulnificus 细菌总数降至77.14%1.37%(p0.01)。除抗菌活性外,H4 的生物相容性好,在浓度1000gmL1时均没有溶血性或细胞毒 性,它 可 能 通 过 与 细 胞 膜 表 面 受 体(EGFR、VEGFR2、FGFR1 等)发生相互作用,进而促进细胞迁移。在浓度为 62.50gmL1和 250gmL1时,H4 均可显著促进 L929 细胞发生迁移(p0.05)。综上,海参抗菌肽 H4 的生物相容性好,兼有抗菌、促愈合功效,可望作为一种潜在功能物质用于皮肤感染创面的修复与再生。然而,海洋抗菌肽 H4 对动物皮肤感染创面修复的实际效果还未验证,对细胞促迁移的详细机制也未阐明,后续还需通过动物实验和细胞实验对其功效和机制开展更进一步的研究。参考文献 References侯晓艳,2019.基于生物信息学与多肽组学的花椒籽抗菌肽筛选及 抑 菌 机 理 研 究 D.成 都:四 川 农 业 大 学.HOU XIAOYAN,2019.Screening of antibacterial peptides and inhibition mechanism of pepper seeds based on bioinformatics and peptidomicsD.Chengdu:Sichuan Agricultural University(in Chinese with English abstract).李成华,2007.栉孔扇贝核心组蛋白的基因结构及 H2A 抗菌活性 的 研 究 D.青 岛:中 国 科 学 院 海 洋 研 究 所.LI CHENGHUA,2007.Study on the gene structure and H2A antibacterial activity of the core histone of the ctenophore scallop(Pecten spp.)D.Qingdao:Graduate School of Chinese Academy of Sciences(Institute of Oceanography)(in Chinese with 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