高效化学同位素标记技术分析不同产地艾草的化学成分差异.pdf

：引用本文格式：李 佳高效化学同位素标记技术分析不同产地艾草的化学成分差异湖北医药学院学报，（）：高效化学同位素标记技术分析不同产地艾草的化学成分差异李 佳（厦门市迈理奥科技有限公司，福建 厦门）摘 要 目的：分析比较不同产地艾草的化学成分差异。方法：采用高效化学同位素标记（，）结合超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱联用（，）技术对采自新野、内乡两个产地的各 个批次的艾草进行检测，并通过 软件进行数据处理与分析，比较不同产地艾草的化学成分差异。结果：不同产地艾草的化学成分差异显著，筛选并鉴定出 种差异显著的化学成分，主要集中在苯丙烷代谢、赖氨酸降解、牛磺酸和亚牛磺酸代谢通路。结论：不同产地的艾草具有显著不同的化学成分，为相同地理环境下艾草分类以及探讨艾草药材品质形成机制等提供物质理论基础。关键词 艾草；产地；高效化学同位素标记；超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱；代谢组学 （，）：（）（），：；作者简介 李佳（），女，河北张家口人，博士，研究方向：代谢组学技术开发及在生物医药领域的应用。：艾草（）为菊科蒿属植物，多数为草本，少数为半灌木或小灌木，整株香气浓郁带有强烈的挥发性香气。艾草作为我国传统的药用植物，具有很高药用价值和经济价值。植物化学研究表明艾草含有黄酮类、挥发性油、萜类、多糖等多种化学成分。现代药理表明艾草具有多种药理活性。我国艾草资源丰富，地理范围分布较广。为了更好地适应不同的栖息地，不同产地种群会根据气候和生态条件选择相应进化的表型性状。应用代谢组学技术可以对植物中的所有内源代谢物进行定性定量研究，并从系统生物学角度解释代谢物变化与生物体生命活动现象的关系，从而进行有效的产地鉴别。但中药所含的未知化合物种类多、组成复杂、化学成分浓度差异大，需要高覆盖率和高精准定量的方法，。高效化学同位素标记（，）是通过化学衍生化反应对含有不同化学基团的代谢物进行分析，可大幅提升代谢物质谱检测的灵敏度，从而显著增强可检测代谢物的数量，检测灵敏度提高 倍，扩大代谢组覆盖率。通过同位素双标记系统，为所有的物质生成同位素内标，克服检测时仪器漂移、基 李 佳高效化学同位素标记技术分析不同产地艾草的化学成分差异质效应等影响，使定量更加精准。因此本研究基于 代谢组学技术对不同产地收集的艾草进行深入的化学成分分析，筛选出不同产地间艾草存在差异的代谢标志物，从而为地理标志艾草的产地研究奠定理论基础。仪器与材料 仪器与试剂胺 酚基试剂盒由厦门市迈理奥科技有限公司提供（批号：）；甲醇、乙腈、甲酸（级，福州市康达化玻实验仪器有限公司）；水（屈臣氏蒸馏水，屈臣氏有限公司）。氮气吹扫仪（，杭州奥盛仪器有限公司）；真空浓缩仪（，湖南赫西仪器装备有限公司）；自然对流干燥箱（，上海一恒科技有限公司）；迷你混合仪（，购自杭州欧米科技有限公司）；高速台式冷冻离心机（，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；电子天平（，上海天美天平科技有限公司）。药材 年 月，采集河南省内乡、新野两个产地各 个不同批次的艾草样品，由河南省科学院副研究员王志尧鉴定。实验方法样品制备精密称取艾草样本粉末各，加入 甲醇 水混合溶液（，），使用珠磨式组织研磨器对样本进行研磨，持续时间。研磨后的混合物经涡旋和低速离心后，置于 冰箱中静置 。最后，在 下对样品进行高速离心（，）。上清液转移至新的离心管中，以进行样品标记。将上步所得上清液根据分析通道进行分装。每个样本分为 个部分，以供单通道分析（通道）、备份样品及混合样品制备。对混合样本的制备，从每个样本中吸取 上清液并合并成一个样本，经涡旋混合后形成混合样本，标记后作为参考样本。严格按照厦门市迈理奥科技有限公司代谢组学实验的标准操作流程（）进行样品标记。首先在含有 稀释过的艾草样本中加入 的缓冲液试剂，的 标记试剂（用于单独样本与混合样本的标记）或 标记试剂（仅用于混合样本标记），在涡旋混匀后置于 条件下孵育。孵育完成后，加入 试剂，用于淬灭过量的标记试剂，并将混合溶液在 条件下孵育 。最终，加入 调节试剂。使用 对标记后的胺类 酚类次级代谢组进行定量。根据定量结果，将等量的 标记的混合样品加入到 标记的单独样品中进行液质分析。在液质分析前，同时准备质控样本，即将 标记的混合样品和 标记的混合样品等体积充分混匀后作为质控样本。所有样本制备完成后进行液质分析。色谱条件色谱柱：（，）；流动相：（）甲酸水；：（）甲酸乙腈，柱温：，流速：。洗脱梯度为：，；，；，；，；，；，。质谱条件安捷伦 超高效液相色谱 四级杆 飞行时间质谱仪（）；离子源 参 数 设 置 如 下：离 子 源；：；：；：；：；：；质谱扫描范围：；正离子模式。数据处理与统计分析数据采集与导出完成后，所有数据上传至 进行数据处理与分析。用 软件提取每次 采集中的 峰对，并通过保留时间和准确质量对不同样品的峰对数据进行对齐。缺失值通过使用 程序填充。利用衍生化标准品数据库（）、关联代谢物数据库（）、数据库的三层级鉴定方式对检测到的峰对进行鉴定。使用 进行主成分分析（，）、偏最小二乘法判别分析（，）和火山图分析两组代谢物的差异情况，并采用 法确定组间的差异代谢物（，差异倍数 或）。采用 网站进行代谢通路分析。实验结果 不同产地艾草的色谱图总共处理了 个 数据，只有在至少一个组的 的样本中均出现的代谢物得以保留。通过筛选后，平均每个样品可检测 个峰湖北医药学院学报（）网址：年 月，（）对。色谱图显示不同产地的艾草样本在正离子模式下，峰型较好且有良好的分离效果（图）。图 不同产地艾草样品基峰色谱图 代谢物的鉴定结果在检测到的 个特征的峰对中，有 个峰对（）可以被准确鉴定或推定得到匹配。其中，在标准品数据库（），鉴定到 个代谢物。在关联代谢物数据库（）鉴定 个代谢物。在 数据库的 级反应数据库、级反应数据库、级反应数据库中分别匹配到了、和 个代谢物。分析主 成 分 分 析（，）通过对主成分的相似性，对代谢物降维后的新的特征变量进行归类，从总体上反应各组样本之间的总体代谢差异和组内样品之间的差异大小。在本研究中我们将采集于内乡产地的艾草（组）用蓝色点表示，从新野采集的艾草（组）用橙色表示，通过观察图 的 得分图，可以直观发现不同产地艾草两组间存在交叉与分离，组间具有相似性和差异性，表明不同产地艾草的化学成分存在分离趋势。分析偏最小二乘法判别分析（，）是一种用于判别分析的多变量统计分析方法，根据观察或测量到的若干变量值，来判断研究对象如何分类的常用统计分析方法。采用 对不同产地艾草进行识别分析，采集于内乡产地的艾草（组）用蓝色点表示，而从新野采集的艾草（组）用橙色表示，如图 所示，同一产地的样本点聚集在一起，而不同产地的样本点分散在不同区域，并且能够明显区分，结果表明不同产地艾草的化学成分存在显著差异。图 不同产地艾草样品的 得分图图 不同产地艾草样品的 分析图 差异代谢物通过差异倍数（，）和 值绘制火山图（图），发现新野与内乡采集的艾草见有 个代谢产物存在显著差异，相比较于内乡采集的艾草，新野采集的艾草有 种代谢物上调（，红色），种差异代谢物下调（，蓝色）。图 不同产地艾草样品的火山图 其中，个差异代谢物通过标准品数据库（）鉴定，个差异代谢物通过关联代谢物数据库（）鉴定，个差异代谢物通过 数据库推测鉴定。不同艾草间差异显 李 佳高效化学同位素标记技术分析不同产地艾草的化学成分差异著的代谢物的鉴定结果见表（值，前）。表 不同产地艾草中差异显著代谢物信息序号分子量（）差异倍数 值化合物名称 （）（），代谢通路分析将 个具有高可信度鉴定结果的代谢物用于代谢通路分析。分析使用（），其 中 采 用 作为富集分析方法，作为拓扑分析方法，使用 （）（）进行分析。如图 代谢通路分析的气泡图所示，不同分布地艾草影响贡献值较大的代谢通路主要为苯丙烷代谢、赖氨酸降解、牛磺酸和亚牛磺酸代谢。图 代谢通路气泡图 讨论不同产地的药材因地理环境、气候条件、土壤类型等因素的差异导致化学成分存在显著差异，对临床药效具有直接影响，甚至产生不良反击。代谢组学是系统生物学的重要组成部分，其特点是以组群指标成分分析为基础，高通量检测方法和多元数据处理为手段，在药用植物研究中得到了广泛应用，为研究者提供了深入了解药用植物化学成分差异性的有效手段。如 等采用代谢组学技术分析了不同产地金银花的代谢物，发现了不同组织和地理来源的显著差异。王胜男等采用代谢组学技术对不同产地的玄参进行了质量评价，揭示了地理环境对玄参化学成分和药效的影响。艾草富含多种化学活性成分，具有多种生物活性及药用价值，因而在农业、医疗等领域具有较高的开发价值。本研究采用高效化学同位素标记（）技术，能够有效突破常规代谢组学方法瓶颈，识别了 个特征峰对，并对其中 个代谢物进行了准确鉴定，体现了更高灵敏度、高覆盖率、高精准定量、高 稳 定 性 的 全 方 位、多 层 面 的 技 术 优势，。本研究针对艾草所含的未知化合物种类多、组成复杂、化学成分浓度差异大的特点，成功应用 代谢组学技术对不同产地艾草的代谢水平进行比较，结果发现苯丙烷代谢、赖氨酸降解、牛磺酸和湖北医药学院学报（）网址：年 月，（）亚牛磺酸代谢等差异显著，而上述代谢通路对植物生长发育至关重要，如苯丙烷代谢途径产生的化合物具有抗氧化、抗病、抗逆境等功能，赖氨酸降解途径产生的己烯酸和己二烯酸是茉莉酸和其他植物激素的前体，牛磺酸代谢途径产生的化合物对植物细胞膨胀和生长具体调节作用，有助于植物适应不同生长环境。该结果有助于深入挖掘艾草的有效成分、阐明药效物质基础，为揭示不同地理环境下艾草分类以及探讨艾草药材品质形成机制提供理论基础，并为其他药用植物的研究提供参考价值。参 考 文 献徐世强，陈永忠，苏靖朗，等黄金艾蒿的非靶向代谢组和转录组学分析中药材，（）：蒋志惠，常雪梅，张照然，等艾草的化学成分和药理作用研究进展中国兽药杂志，（）：曹 玲，于 丹，崔磊，等艾叶的化学成分、药理作用及产品开发研究进展药物评价研究，（）：，（）：，（），（）：，：陈晓水，侯宏卫，边照阳，等气相色谱串联质谱（）的应用研究进展质谱学报，（）：，（），（）：，：，：贾孟琪，薛芸，王彦，等色谱质谱联用技术在中药代谢组学研究中的应用分析测试学报，（）：，：，：，（）：胡贞贞，黄伟展，卢昌华，等不同产地广藿香非靶向代谢组学研究中药材，（）：吴样明，邵坚，孙函静，等基于 代谢组学技术的不同产地黄芩组分比较研究亚太传统医药，（）：，（）：，（）：，（）：王胜男，徐 新，刘训红基于超快速液相串联四极杆飞行时间高分辨质谱技术分析不同产地玄参化学成分的差异中国药学杂志，（）：，（）：，（）：，：，：，（）：收稿日期（本文编辑：邴云云）李 佳高效化学同位素标记技术分析不同产地艾草的化学成分差异