高活性碱性果胶酶产生菌的筛选、鉴定及发酵条件优化.pdf

高活性碱性果胶酶产生菌的筛选、鉴定及发酵条件优化刘 杰1，刘 婷2，唐梅芳3，林元山4（1.汉鑫求实环境技术有限公司，南昌330000；2.南昌航空大学 环境与化学工程学院，南昌330063；3.安远县农业农村局，江西 赣州342199；4.湖南农业大学 生物科学技术学院，长沙410128）摘要 通过平板分离法和刚果红染色法，从腐烂苹果中分离得到 1 株碱性果胶酶产生菌株 Lys-3004。经形态观察和16S rDNA 扩增子测序分析，确定该菌株为芽孢杆菌属(Bacillus sp.Lys-3004)。通过单因素及正交试验优化产酶条件，结果表明：菌株 Lys-3004 在 7.0%葡萄糖、1.2%黄豆粕、培养基初始 pH 7.0、33 、180 r/min 恒温震荡培养 96 h 的条件下，发酵产生的果胶酶酶活力达到 11 352.5 U/mL，较优化之前提高了 3.7 倍。菌株 Lys-3004 具有应用和深入研究的潜力。关键词 碱性果胶酶；筛选；发酵条件优化 中图分类号 Q93-33 文献标志码 A doi：10.3969/j.issn.2096-8566.2023.02.008 文章编号 2096-8566(2023)02-0063-07Screening,Identification and Fermentation Optimization of Bacteria StrainProducing Alkaline Pectinase with High ActivityLIU Jie1，LIU Ting2，TANG Mei-fang3，LIN Yuan-shan4（1.Hanxin Fact-seeking Environmental Technology Corporation,Nanchang 330000,China;2.School of Environmental and Chemical Engineering,Nanchang Hangkong University,Nanchang 330063,China;3.Anyuan County Agriculture and Rural Bureau,Jiangxi Ganzhou 342199,China;4.College of Bioscience and Biotechnology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China）Abstract:An alkaline pectinase producing strain Lys-3004 was isolated from a decayed apple by combination of plate screening andCongo red staining.Based on morphological characteristics and 16S rDNA amplicon sequencing analysis,strain Lys-3004 wasidentified as Bacillus sp.The optimum fermentation conditions of pectinase activity were performed by single factor and orthogonalexperiment.The results were as follows:glucose 7.0%,soybean meal 1.2%,initial pH of medium 7.0,180 r/min at 33,culturingfor 96 h.Under the optimum conditions above,the enzyme activity of strain Lys-3004 reached 11 352.5U/mL,which was 3.7 foldshigher than that obtained before optimization.Strain Lys-3004 is capable of potential applications for following researches.Key words:Alkaline pectinase；screening；fermentation optimization 引言果胶质广泛存在于高等植物组织中，作为一种支撑层，起着“粘合”作用。果胶酶(pectinases)是指能协同分解果胶质的一类复合酶的总称，根据其作用方式和底物偏好，这些酶可分为 3 组，即解聚酶 收稿日期2022-12-24 修回日期2023-03-06基金项目国家自然科学基金青年项目(42007431)；湖南省高校创新平台开放基金项目(19k045)；南昌航空大学博士启动基金(EA202002153)通讯作者刘婷(1982)，女，博士，副教授。主要研究方向：土壤微生物、土壤生态修复。第 37 卷 第 2 期南昌航空大学学报：自然科学版Vol.37 No.22023 年 6 月Journal of Nanchang Hangkong University:Natural SciencesJun.2023(水解酶和裂解酶)、酯酶和原果胶酶1。果胶酶是非常重要的工业酶制剂之一，其全球销量每年超过 100 万吨2-3。根据 pH 值的不同又可分为酸性果胶酶和碱性果胶酶两大类，碱性果胶酶的工业应用包括纺织加工、含果胶材料的工业废水预处理、以及咖啡和茶叶发酵等方面4。酸性果胶酶在榨汁工业中用于提高产量、降低粘度和澄清果汁5。目前，国内商品化的果胶酶主要由黑曲霉生产，发酵水平较高，如林伟铃等以黑曲霉 EIM6 为出发菌株，通过紫外诱变筛得一株高产果胶酶菌株 EIMU2，其最高酶活性达 32 161 U/mL6。然而黑曲霉发酵制得多为酸性果胶酶，而棉织物不耐酸，酸性果胶酶的使用会带来棉织物强力的损伤，所以碱性果胶酶在棉纺织原料脱胶应用上更具优势7。本文拟通过选育低纤维素酶活力的碱性果胶酶产生菌株，并对其发酵产酶条件进行了优化，旨在为苎麻脱胶和棉织物精练工艺的应用研究提供科学依据和技术基础。1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 采样取市售废弃腐烂水果，如苹果、梨、香蕉等用于菌株的分离筛选。1.1.2 培养基果胶酶产生菌分离培养基、纤维素酶产生菌分离培养基、果胶酶发酵基本培养基和斜面培养基均参考文献 8 进行配制。1.2 试验方法 1.2.1 产果胶酶菌株的筛选产果胶酶菌株的初筛：称取腐烂水果 10 g，榨汁机捣碎后置于 90 mL 无菌水中混匀制成混合悬液，用梯度稀释法进行稀释，分别取不同稀释度的悬液 0.1 mL 涂布于果胶酶产生菌分离培养基上，37 恒温培养 24 d；待菌落长出时，用质量分数为 0.5%的刚果红溶液染色 10 min，弃去染液后用浓度为 1 mol/L NaCl 溶液漂洗 23 次，直至呈现水解圈，计算透明圈直径与菌落直径的比值(Dp/Dc)，挑取单菌落，将相应的菌落转接于斜面并编号，于4 冰箱保存。菌种复筛：将初筛得到的 Dp/Dc 值较大的菌株接种于 100 mL 的液体发酵培养基进行培养，发酵液经高速冷冻离心机 8000 r/min 离心 5 min，取上清液作为粗酶液，测定其果胶酶酶活力，选取酶活较高的菌株作为出发菌株。1.2.2 菌株形态和生理生化鉴定依据常见细菌系统鉴定手册9和伯杰细菌鉴定手册第八版10进行菌落特征、细胞形态观察和生理生化鉴定。1.2.3 菌株 16S rDNA 鉴定及分析参考 Li 等方法11对菌株进行基因组的提取、PCR 扩增和序列测定。其中序列测定由北京三博远志生物科技公司进行，测序结果拼接后在NCBI 中用 Blast 进行序列同源性分析，选取同源性高的典型菌株序列，用软件 ClustalX 进行序列比对，并利用软件 MEGA7 构建出系统发育树。1.2.4 果胶酶活力测定将斜面菌株保藏接种到发酵培养基中，37、180 r/min 摇床振荡培养 24 d。发酵液经高速冷冻离心机 8000 r/min 离心 5 min，取上清液为粗酶液。采用 DNS 法测定果胶酶活力12，在波长540 nm 处测定样品吸光值，以灭活酶液作为CK(对照组)，3 个平行样品分别测定 3 次，结果取平均值，并计算标准差。通过比对半乳糖醛酸标准曲线推算出还原的半乳糖醛酸含量。酶活力单位定义为：50、自然 pH 的条件下每 mL 酶液每分钟催化果胶还原产生 1 g 半乳糖醛酸为 1 个酶活力单位。1.2.5 发酵产酶条件的优化利用单因素试验优化培养基碳源、氮源、温度、时间和培养初始 pH 对菌株产果胶酶活力的影响。在单因子试验的基础上，对碳源葡萄糖(A)、氮源黄豆粕(B)、初始 pH(C)、温度(D)4 个因素设计 L9 正交试验（表 1），并进行验证。64 南昌航空大学学报：自然科学版第 37 卷 2 结果与分析 2.1 菌株初筛结果经筛选培养基初筛获得 54 株水解圈明显的菌株。其中 Dp/Dc 值大于 3 的有 41 株，大于 4 的有11 株，大于 5 的有 3 株。图 1a 是菌株 Lys-3004在果胶酶初筛平板上的水解图，显示出明显的水解圈，其 Dp/Dc 值为 6.67，表明该菌株在平板上的果胶酶活力较强；图 1b 是菌株 Lys-3004 在纤维素酶初筛平板上的水解图，显示几乎无水解圈，说明该菌在平板上分泌纤维素酶的能力很弱。下一步还需要经摇瓶发酵复筛进一步确定该菌株在液体培养条件下分泌果胶酶的能力。(a)果胶平板(b)羧甲基纤维素钠平板 图 1 菌株 Lys-3004 平板初筛菌落图 2.2 菌株复筛结果从初筛的 54 株菌株中选取 Dp/Dc 值最大的3 株菌接种于发酵培养基进行液体培养。于 37、180 r/min 条件下培养 2 d，取粗酶液测定其果胶酶活力，选取酶活力大于 1000 U/mL 菌株列于表 2。结果表明，菌株 Lys-3004 和 Lys-358 不仅水解圈较大，菌落长势较好，而且酶活力较高，分别为3 097.6、2 478.6 U/mL，可以通过进一步优化其发酵条件提高酶活。2.3 菌种鉴定结果经形态及光学显微镜观察菌株 Lys-3004 为杆状、细胞单生、菌落湿润有褶皱和革兰氏染色阳性，为好氧菌。其在NaCl 浓度为05.0%、pH 4.59.5和 1050 条件下均能生长。菌株 Lys-3004 的序列测定由北京三博远志生物技术有限责任公司进行。获得序列后利用 NCBI GenBank 数据库的Blast 进行比对，选取同源性高的典型菌株序列，用 软 件 ClustalX 进 行 序 列 比 对，并 利 用 软 件MEGA7 构建出系统发育树，结果见图 2。通过GenBank blast 发 现 Lys-3004 与 芽 孢 杆 菌 属(Bacillus sp.)的 4 种菌株相似度均为 99%，系统进化 树 也 说 明 Lys-3004 与 该 4 种 菌 株 (Bacillusamyloliquefaciens、Bacillus methylotrophicus、Bacillusvelezensis 和 Bacillus tequilensis)的位置最近。这与形态鉴定结果相符，因此菌株 Lys-3004 鉴定为芽孢杆菌属，命名为 Bacillus sp.Lys-3004。2.4 菌株发酵条件的优化 2.4.1 碳源对果胶酶活力的影响碳源是构成微生物的主要物质，为其提供生理活动所需要的能量。本文比较了碳源淀粉、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和麸皮对菌株 Lys-3004 发酵产果胶酶的影响，结果如图 3 所示。结果表明，在0.5%酵母膏(氮源)、发酵 3 d 和 37 的基础条件下，不同碳源(质量分数为 2.0%)对菌株 Lys-3004 产果胶酶活力具有显著性影响(p0.05)。在5 种常用碳源中，葡萄糖是 Lys-3004 菌株发酵产生果胶酶的最佳碳源，此时酶活力达到 3 895.9 U/mL，其次是蔗糖和可溶性淀粉，而碳源为麦芽糖和麸皮 表 1 因素和水平设计表水平因素A/%B/%CD/150.96.533261.27.035371.57.537 表 2 摇瓶发酵复筛果胶酶产生菌菌株号酶活力/(UmL1)菌株号酶活力/(UmL1)Lys-21 171.3Lys-2291 596.4Lys-41 251.4Lys-3582 478.6Lys-512 317.1Lys-603341.5Lys-1071 434.6Lys-17981 366.5Lys-2132 356.2Lys-30043 097.6 第 2 期刘 杰，刘 婷，唐梅芳，等：高活性碱性果胶酶产生菌的筛选、鉴定及发酵条件优化 65 时产酶能力较低。进一步的研究表明，不同葡萄糖含量对 Lys-3004 菌株发酵产生果胶酶活力的影响显著，其中葡萄糖质量分数为 5.0%时，其产生的果胶酶活力可达 6 130.2 U/mL。通常，桔皮粉或者果胶具有充当碳源同时兼作诱导物的作用13，而该菌株在不外加该类物质的前提下就能高产碱性果胶酶。2.4.2 氮源对果胶酶活力的影响氮源是菌体合成蛋白质和核酸等物质的主要元素，也是微生物的主要营养物质。因此，比较了酵母膏、黄豆粕、玉米浆、硫酸铵和尿素等氮源对菌株 Lys-3004 发酵产果胶酶的影响(图 4)。结果 Lys-3004Bacillus amyloliquefaciens(HQ844505.1)Bacillus methylotrophicus(KM096464.1)Bacillus velezensis(KX129851.1)Bacillus tequilensis(JN700126.1)Bacillus vanillea(KF986320)Bacillus siamensis(AJVF01000043)Bacillus vallismortis(JH600273)Brevibacterium halotolerans(AM747812)Bacillus mojavensis(JH600280)Bacillus atrophaeus(AB021181)Bacillus sonorensis(AYTN01000016)Bacillus licheniformis(AE017333)Bacillus aerius(AJ831843)Bacillus safensis(ASJD01000027)Bacillus pumilus(ABRX01000007)Bacillus altitudinis(ASJC01000029)Bacillus xiamenensis(AMSH01000114)Bacillus aerophilus(AJ831844)Bacillus stratosphericus(AJ831841)Oceanobacillus picturae(AJ315060)99100969810078996865566498670.005 图 2 菌株 Lys-3004 基于 16S rDNA 的进化树 葡萄糖蔗糖麦芽糖麸皮淀粉05001000150020002500300035004000碳源(a)02468101000200030004000500060007000(b)酶活/(UmL1)酶活/(UmL1)葡萄糖质量分数/%图 3 (a)不同碳源和(b)葡萄糖浓度对菌株 Lys-3004 产果胶酶的影响 66 南昌航空大学学报：自然科学版第 37 卷表明，在 5.0%葡萄糖(碳源)、发酵 3 d 和 37 的基础条件下，不同氮源对菌株 Lys-3004 产果胶酶活力具有显著性影响(p0.05)。因为有机氮源能被缓慢利用，故有机氮源普遍比无机氮源的果胶酶活力高，这一结果与李祖明等14的研究结果一致。其中以黄豆粕最优，其果胶酶活力达 6 109.5 U/mL。进一步的研究表明，不同黄豆粕含量对菌株 Lys-3004 发酵产生果胶酶活力的影响显著，其中黄豆粕质量分数为 1.2%时，其果胶酶活力最高可达6 675.3 U/mL。2.4.3 发酵温度对果胶酶活力的影响在 5.0%葡萄糖、1.2%黄豆粕和发酵 3 d 的条件下，改变菌株 Lys-3004 培养温度，发酵产生的果胶酶活力大小如图 5 所示。由图 5 和方差分析可知，温度对菌株 Lys-3004 产果胶酶活力具有显著性影响(p0.05)。当温度为 33 时，最适合果胶酶发酵，此时菌株 Lys-3004 酶活力达到最大值为7 223.4 U/mL。在 2833 之间，随着温度升高，酶活力呈上升趋势；但在 3340 之间，酶活力有所下降，这可能是由于温度过高不利于代谢产酶。2.4.4 发酵时间对果胶酶活力的影响菌株 Lys-3004 在 5.0%葡萄糖、1.2%黄豆粕和 33 的条件下发酵，每 12 h 测定该菌产果胶酶的活力，果胶酶活力大小如图 6 所示。结果表明，该菌株在 036 h 内产生的酶活力不高；从 3696 h，酶活力持续升高，并于 96 h 达到峰值，为8 326.5 U/mL；之后酶活力开始下降。因此，实验结果表明，96 h 为最适产酶时间。20406080100120100020003000400050006000700080009000时间/h酶活/(UmL1)图 6 发酵时间对菌株 Lys-3004 产果胶酶的影响 2.4.5 培养基初始 pH 对果胶酶活力的影响在 33、发酵 4 d 的条件下，改变基本发酵培养基的初始 pH，菌株 Lys-3004 产生的果胶酶活力如图 7 所示。由图 7 和方差分析可知，菌株在酸性环境与碱性环境产酶能力差异较大，培养基初始pH 对菌株产果胶酶活力具有显著性影响(p0.05)。在 pH 5.07.0 之间，随着 pH 的增加菌株 酵母膏黄豆粕玉米浆硫酸铵尿素01000200030004000500060007000氮源0.20.40.60.81.01.21.41.6450050005500600065007000(a)(b)黄豆粕质量分数/%酶活/(UmL1)酶活/(UmL1)图 4 (a)不同氮源及(b)黄豆粕含量对菌株 Lys-3004 产果胶酶的影响 283032343638404500500055006000650070007500温度/酶活/(UmL1)图 5 发酵温度对菌株 Lys-3004 产果胶酶的影响 第 2 期刘 杰，刘 婷，唐梅芳，等：高活性碱性果胶酶产生菌的筛选、鉴定及发酵条件优化 67 Lys-3004 产生的果胶酶活力逐步增加；在 pH 7.0时达到峰值，为 6 315.47 U/mL；之后略有下降。最适 pH 在 7.010.0 之间，说明该菌产生的果胶酶为碱性果胶酶。2.5 正交试验结果分析设计四因素三水平正交试验，按正交表配制培养基，将接种后的培养基在对应温度下以 180 r/min震荡培养 96 h，测得酶活力如表 3 所示。由表 3 可知，在这 4 个因素中，温度的影响最大，其次是碳源，然后是 pH，氮源的影响最小。最佳组合是 A3B2C1D1，即 7.0%葡萄糖、1.2%黄豆粕、初始 pH 7.0、33。通过验证试验，配制培养基，使葡萄糖添加量为 7.0%、黄豆粕 1.2%、初始pH 7.0、放置于 33 180 r/min 下恒温震荡摇床培养 96 h，测得发酵液的酶活为 1 1 352.5 U/mL，比上述正交试验中所有组合条件下的酶活力都高。2.6 讨论在发酵条件优化过程中，培养基的成分例如碳源用于菌体细胞增殖，可为菌体生长和产酶提供能量。如，在发酵罐扩大生产中，不断流加 350 g/L 的葡萄糖对菌体产酶有非常明显的促进作用15。此外，甲醇在诱导产酶过程中既是诱导剂又是碳源，过量的碳源甲醇也会抑制菌体的生长，相对酶活呈现先升高后下降的趋势16。这一现象与本研究中葡萄糖的作用类似，即碳源葡萄糖浓度超过 7%时酶活开始下降。目前，微生物果胶酶约占世界市场总酶产量的 10%。酸性果胶酶主要用于食品加工，碱性果胶酶已被广泛用于纺织加工、制药、皮革、洗涤剂和废水处理工业17。杨欣伟等18通过优化菌株 Aspergillus niger EIM-6 液体深层发酵产生果胶酶的条件，使酶活力达到 30 231 U/mL。尽管在本研究中菌株 Lys-3004 的酶活力比黑曲霉 EIM-6 低，但本研究中并未使用诱导剂作为碳源。且Lys-3004 所产生的果胶酶作为碱性果胶酶应用领域更广，产纤维素酶活力低，更适用于注重纤维素品质的苎麻脱胶和棉织物精练工艺。此外，在废水处理方面，其联合活性污泥法能较好处理废水中的果胶质19。菌株 Lys-3004 有望进一步选育改良，应用于纺织工艺和废水处理。3 结论1）正交试验结果表明，各因素对酶活影响的顺序是：温度碳源pH氮源。产酶培养最优条件为：7.0%葡萄糖、1.2%黄豆粕、初始 pH 7.0、33、180 r/min 恒温震荡培养 96 h。表 3 正交试验结果处理因素实验结果酶活/(UmL1)A/%B/%CD/150.97.03310 826.9251.27.5357 903.7351.58.0378 287.2460.97.0376 439.3561.27.53311 181.3661.58.0358 194.2770.97.0359 699.5871.27.53710 146.9971.58.03310 455.2均值19 005.98 988.59 722.610 821.1均值28 604.89 743.98 266.08 599.1均值310 100.58 978.89 722.68 291.1极差1 495.6765.11 456.62 530.0主次顺序DACB最优水平A3B2C1D1最优组合A3B2C1D1 5678910200030004000500060007000培养基初始 pH酶活/(UmL1)图 7 培养基起始 pH 对菌株 Lys-3004 产果胶酶的影响 68 南昌航空大学学报：自然科学版第 37 卷2）Lys-3004 所产生的果胶酶活力高，且产纤维素酶活力低，可忽略不计。因此可尝试应用该菌株生产果胶酶，解决商用黑曲霉同时产果胶酶与纤维素酶的缺点。【参考文献】ABDOLLAHZADEH R,PAZHANG M,NAJAVAND S,et al.Screening of pectinase-producing bacteria from farmlands andoptimization of enzyme production from selected strain by RSM J.Folia mcrobiologica,2020,65(4):705-719.1JOHN J,KAIMAL K K S,SMITH M L,et al.Advances in upstream and downstream strategies of pectinase bioprocessing:A review J.International journal of biological macromolecules,2020,162:1086-1099.2ALIX S,LEBRUN L,MARAIS S,et al.Pectinase treatments on technical fibres of flax:Effects on water sorption and mechanicalproperties J.Carbohydrate polymers,2012,87(1):177-185.3SHRESTHA S,RAHMAN M,QIN W.New insights in pectinase production development and industrial applications J.Appliedmicrobiology and biotechnology,2021,105:9069-9087.4SATAPATHY S,ROUT J R,KERRY R G,et al.Biochemical prospects of various microbial pectinase and pectin:An approachableconcept in pharmaceutical bioprocessing J.Frontiers in nutrition,2020,7:117.5林伟铃,田宝玉,秦勇,等.果胶酶高产菌种的紫外诱变选育及其培养条件的响应面法优化 J.工业微生物,2010,40(2):5-9.6周舒翔,丁平,葛元宇,等.纺织用酶制剂复配技术研究与进展 J.中国纤检,2012,22:84-88.7周熠,黄河,冯波,等.一株碱性果胶酶产生菌的筛选、鉴定及发酵条件优化 J.湖北农业科学,2016,55(4):992-996.8东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册 M.北京:科学出版社,2001.9布坎南,吉本斯.伯杰氏细菌鉴定手册 M.北京:科学出版社,1984.10LI J,LU Q,LIU T,et al.Paenibacillus guangzhouensis sp.nov.,an Fe (III)-and humus-reducing bacterium from a forest soil J.International journal of systematic and evolutionary microbiology,2014,64(11):3891-3896.11郭勇.酶工程 M.北京:中国轻工业出版社,1994.12陈勇强,严芬,叶秀云,等.高产果胶酶菌株的筛选鉴定及其发酵条件研究 J.中国食品学报,2014,14(2):138-145.13李祖明,李鸿玉,何立千,等.高产碱性果胶酶菌株的育种及其发酵条件的研究 J.工业微生物,2008,38(3):27-32.14王克芬,佟新伟,张杰,等.枯草芽孢杆菌产碱性果胶酶发酵条件的优化 J.江苏调味副食品,2020,1:20-24.15陈洲,王亚森,汪步青,等.枯草芽孢杆菌来源的碱性果胶酶在毕赤酵母中的高效表达 J.食品科技,2022,47(2):1-9.16AMIN F,BHATTI H N,BILAL M.Recent advances in the production strategies of microbial pectinases-A review J.Internationaljournal of biological macromolecules,2019,122:1017-1026.17杨欣伟,林伟铃,田宝玉,等.果胶酶高产菌株 EIM-6 的筛选鉴定及其液体发酵产酶条件优化 J.福建师范大学学报：自然科学版,2009,25(2):68-74.18KOHLI P,GUPTA R.Alkaline pectinases:A review J.Biocatalysis and agricultural biotechnology,2015,4(3):279-285.19 第 2 期刘 杰，刘 婷，唐梅芳，等：高活性碱性果胶酶产生菌的筛选、鉴定及发酵条件优化 69