高温胁迫下陆地棉GhCIPK6转基因后代生理生化分析.pdf

新疆农业科学():./.高温胁迫下陆地棉 转基因后代生理生化分析王 辉郭金成宋 佳张庭军何良荣(塔里木大学农学院新疆阿拉尔.新疆生产建设兵团第六师农业科学研究所新疆五家渠)摘 要:【目的】研究高温胁迫条件下陆地棉 转基因后代幼苗体内光合特性指标、抗性指标、植物激素的变化为陆地棉响应高温胁迫奠定基础【方法】以构建 转基因后代超表达、和对照野生型为材料采用温室培养的方法在、测定生理生化指标【结果】通过幼苗叶片比较高温下超表达叶片已经发黄出现大量斑点野生型叶片发黄程度次之 叶片只轻微发黄光合特性中高温胁迫下随着时间延长净光合速率、气孔导度、蒸腾速率、细胞间 浓度均呈先下降后上升超表达材料在光合指标中增幅较慢 和野生型增幅较快叶绿素相对含量变化趋势缓慢在抗性指标中高温胁迫下超表达随着时间延长 含量逐渐增加 含量呈先增加后降低后上升 含量表现出较高水平 中 含量呈先增加后下降 含量呈先上升后下降 含量缓慢增加可溶性蛋白含量和 含量在整个时期相对呈现较高的水平植物激素中随着时间延长超表达材料 含量呈上升趋势 含量较低含量先缓慢增加后下降 先增加后下降 材料中 含量逐渐上升 含量呈先增加后下降 含量先增加后下降 含量先下降后上升后下降野生型中 含量先上升后下降 含量呈先上升再下降后上升 含量先增加后下降 含量先下降后上升后下降 种材料抗高温能力由强到弱为 野生型超表达【结论】在高温下可通过提高蒸腾速率来减弱逆境胁迫的危害提高生长素含量来积极调控植物生长提高细胞的渗透调节能力来减轻细胞遭受的损伤关键词:陆地棉高温胁迫生理生化中图分类号:文献标志码:文章编号:()收稿日期():基金项目:国家自然科学基金项目“调控棉花耐热胁迫机理研究”()作者简介:王辉()男河南人硕士研究生研究方向为作物种质资源().通信作者:何良荣()女湖北人副教授博士硕士生导师研究方向为棉花种质资源().张庭军()男甘肃人副研究员研究方向为棉花、大豆高产高效栽培().引 言【研究意义】高温胁迫造成作物的经济损失越来越严重 预计全球气温每 年将上升 植物的生长和发育过程受到高温()胁迫的严重影响 高温会导致作物的光合作用等生理活动受到严重影响并影响植株的正常生长和发育是作物减产的主要影响因素【前人研究进展】在高温胁迫下一般先受到破坏的是细胞质膜的结构和功能 高温影响细胞膜的稳定性气体交换(光合作用、光呼吸作用、蒸腾作用、气孔导度)及相关酶的活性 植物细胞在高温逆境下利用多种方式产生活性氧造成氧化胁迫但一定程度的高温胁迫往往会促使产生较高水平的耐热性但当高温胁迫超出一定范围后活性氧生成速率加快与此同时非酶性清除剂含量不断减少、活性氧酶性消除系统活性也在不断降低这样就导致大量活性氧不能被有效清除进而造成氧化伤害【本研究切入点】植物体内的存在的一类微量植物激素如脱落酸()、生长素()水杨酸()、茉莉酸()等 植物受到逆境胁迫时体内的激素发生变化通过影响植物的生理生化活动来产生抵御胁迫的能力 需开展关于植物对热胁迫的响应和防御方面的研究了解陆地棉在生理生化水平上对高新新疆疆农农业业科科学学第 卷温胁迫的响应机理和抵御机制【拟解决的关键问题】选择转基因材料超表达和、和野生型材料测定 种材料测定不同时间、不同环境下生理生化指标变化为研究陆地棉抗高温分子机理提供理论基础 材料与方法.材 料材料为陆地棉品系 由华中农业大学育种实验室构建 超表达和 载体遗传转化棉花品系 分别得到超表达和干涉的转基因纯系 代表正常温度 干涉材料 代表高温 干涉材料 代表正常温度野生型材料 代表高温野生型材料 代表正常温度超表达材料 代表高温超表达材料.方 法.试验设计将棉花材料每株系种植 株以上培养室中培养培养条件设定为相对湿度 光周期 /白 天/夜 晚 光 密 度 /()全程充分供水 待植株长大到第 周将棉花植株转入生长箱中 对照组生长条件保持不变处理组 热胁迫 在恢复 处理及对照组分别于、和 取样每个时间点分 个生物学重复每个重复 株幼苗.测定指标.光合特性使用美国 公司生产的 便携式光合作用测量系统测定正常温度和高温下不同时间段棉花幼苗的净光合速率()、气孔导度()、蒸腾速率()、细胞间 浓度()使用 测定仪()测定叶绿素相对含量.抗性相关丙二醛()含量测定采用硫代巴比妥酸()比色法过氧化物酶()活性测定采用愈创木酚显色法可溶性蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝染色法脯氨酸()的测定方法采用茚三酮显色法超氧化物歧化酶()活性测定采用氮蓝四唑()比色法.植物激素激素测定所用的仪器为液质联用系统 ().数据处理数据分析用 软件采用统计软件 进行单因素方差分析及数据显著性检验和 分析数据采用主成分分析对试验中各个时期的 个相关生理指标平均值进行综合评价 根据各主成分的得分及各主成分的方差贡献率为权数对所提取的得分进行加权求和得到各材料高温下的综合得分 结果与分析.高温胁迫下陆地棉幼苗叶片比较研究表明 时在正常温度 下 种材料幼苗叶片正常生长无任何变化在高温 下超表达第 片真叶和第 片真叶明显下垂枯萎第 片真叶也出现下垂 和野生型第 片真叶和第 片真叶下垂不明显第 片真叶无变化 在 时取下对照温度和高温的叶片进行比较超表达叶片已经发黄叶片上已出现大量斑点野生型叶片发黄程度次之 叶片只轻微发黄 图.高温胁迫下陆地棉光合特性.高温胁迫下陆地棉净光合速率()变化研究表明光合作用是棉花生长发育必要条件也是增加产量的必要因素而净光合速率是光合作用的最直接体现 在 野生型进行光合速率快而超表达材料较慢在 三者均在正常温度下进行光合速率快高温下较慢在 三者在正常温度下进行光合速率大于三者高温下其中超表达高温光合速率能力最低在 野生型正常温度和高温下不显著 在高温下与正常温度下达到显著超表达在正常温度和高温下光合速率能力低 超表达相对其他两种材料光合速率较慢 图.高温胁迫下陆地棉气孔导度()的变化研究表明气孔的保卫细胞受到外界环境的刺激能迅速做出反应在高温胁迫下植物气孔的保卫细胞产生应激反应打开气孔进入植物的量增多从而导致叶片光合速率增加 超表达材料在整个时期气孔导度能力很低在 时种材料气孔导度在高温下达到最低气孔关闭随着胁迫时间延长气孔导度逐渐增大在胁迫超过一定时间气孔打开光合速率增加光合作用增强 超表达材料相对其他两种材料气孔导度减弱超表达材料进行光合作用能力差 图 第 期王 辉等:高温胁迫下陆地棉 转基因后代生理生化分析注:、分别代表 正长温度和高温幼苗 代表 幼苗叶片:图 陆地棉叶片比较.注:不同小写字母表示差异显著()下同:()图 高温胁迫下净光合速率的变化.图 高温胁迫下气孔导度的变化.高温胁迫下陆地棉蒸腾速率()的变化研究表明蒸腾作用能够对外界环境做出反应来进行自我保护在一定温度下蒸腾作用可降低叶片温度降低水分散失增强对矿物质的吸收在正常温度下 时 株系的蒸腾速率为 /()野生型株系蒸腾速率为 /()而高温下 蒸腾速率为 /()野生型株系蒸腾速率为 /()时高温处理下各材料蒸腾速率加快 为 /()野生型为 /()正常温度下蒸腾速率减慢 为 /()野生型为 /()高温处理下随着时间延长蒸腾速率增加可以降低叶片温度减少水分散失增强对矿物质的吸收超表达株系从 到 先降低在增加在整个时期蒸腾速率缓慢 图图 高温胁迫下蒸腾速率的变化.高温胁迫下陆地棉细胞间 浓度()的变化研究表明 从 到 时 由 新新疆疆农农业业科科学学第 卷/下 降 到 /由/下降到 /干扰株系和野生型株系胞间 浓度在高温下并没有急剧下降气孔导度下降净光合速率下降的主要因素并不是气孔闭合而超表达株系(到 时)在高温下急剧下降 由 /下降到 /高温下超表达株系敏感性强图 图 高温胁迫下胞间 浓度的变化.高温胁迫下陆地棉叶绿素相对含量()的变化研究表明随着时间延长 种株系的叶绿素含量变化较小其中 叶绿素含量为 、叶绿素含量为 、叶绿素含量为 、在高温胁迫下 值不会受温度影响仍能保持高含量从而进行光合作用 图图 高温胁迫下叶绿素相对含量的变化.高温胁迫下陆地棉抗性.高温胁迫下陆地棉丙二醛()的变化研究表明在正常温度下 种株系随着时间延长丙二醛含量呈先增加再降低后增加 在高温下随着时间延长 干扰株系中丙二醛含量呈先增加后下降野生型株系中丙二醛含量呈逐渐缓慢增加而超表达株系丙二醛含量逐渐增加其中 时达到最大为./超表达株系在高温胁迫下对膜造成的伤害大对棉花细胞活力起到抑制作用 图 图 高温胁迫下 含量的变化.高温胁迫下陆地棉氧化物酶()、超氧化物歧化酶()的变化研究表明在正常温度下 干扰株系和野生型株系 活性相对较高超表达株系中 活性先降低后增加 在高温下随着时间延长 干扰株系中 活性呈先增加后下降野生型株系和超表达株系中 活性呈先降低再上升后降低超表达株系在整个时期都相对较低分别为 、/在正常温度下 干扰株系和野生型株系中 活性对于清除自由基能力较强保护膜质过氧化在高温下超表达株系中 活性对于清除自由基能力较差未能减轻细胞膜的损坏 图 图 高温胁迫下 活性的变化.在正常温度下 种株系 活性随时间延长逐渐增加其中超表达株系 活性在整个时第 期王 辉等:高温胁迫下陆地棉 转基因后代生理生化分析期含量较高 在高温下 干扰株系和野生型株系随着时间延长 活性趋于平衡而在超表达株系在整个时期都达到最大值分别为、/()超表达株系通过提高 活性来应对热胁迫 受到高温胁迫在整个时期超表达株系 活性较低而 活性较高在应对高温环境、表现出不同的变化发挥自身功能应对高温胁迫表现出不同的作用 图 图 高温胁迫下 活性的变化.高温胁迫下陆地棉可溶性蛋白的变化研究表明 种株系在正常温度下可溶性蛋白含量相对较低在 达到了最低 为/为 /为 /而在高温下随着时间延长 干扰株系中可溶性蛋白含量呈先降低后增加分别为 、/野生型株系可溶性蛋白含量先增加再降低后增加分别为 、/超表达株系中可溶性蛋白含量呈先增加后降低分别为 、/在高温诱导下可溶性蛋白含量较高 图 图 高温胁迫下可溶性蛋白含量的变化.高温胁迫下陆地棉脯氨酸()的变化研究表明在正常温度下 种株系的脯氨酸含量随着时间延长逐渐增加而在高温下野生型株系和超表达株系脯氨酸含量从 缓慢上升 下降 干扰株系的脯氨酸含量随着时间逐渐降低超表达株系在整个时期脯氨酸含量相对较高分别为 、/热胁迫对超表达株系造成严重伤害从而通过脯氨酸含量的积累应对逆境 图 图 高温胁迫下脯氨酸含量的变化.高温胁迫下陆地棉植物激素.高温胁迫下陆地棉生长素()的变化研究表明在正常温度下 干扰株系和野生型株系随着时间延长生长素含量趋于平衡超表达株系中生长素含量逐渐上升 在高温下 干扰株系中生长素含量呈先下降后上升变化为 、/野生型株系 中生长素含量呈先上升后下降变化为 、/超表达株系 中生长素含量逐渐升高变化为 、/随着时间延长生长素不受高温影响能够抵御高温环境 干扰株系和超表达株系随着时间延长体内生长素含量逐渐增加 图 图 高温胁迫下生长素含量的变化.新新疆疆农农业业科科学学第 卷.高温胁迫下陆地棉脱落酸()的变化研究表明正常温度下 种株系在整个时期脱落酸含量呈现先增加在下降 高温下超表达株系和野生型株系随着时间延长脱落酸含量先增加再下降后上升野生型株系上升的幅度较大超表达株系则上升幅度较小而 干扰株系脱落酸含量先增加后下降 超表达株系在整个时期脱落酸含量相对较低常温处理 个时间段分别为 、/而高温处理时分别为 、高温胁迫时超表达株系 中的脱落酸因未能迅速做出反应来提高植物抗性 图 图 高温胁迫下脱落酸含量的变化.高温胁迫下陆地棉茉莉酸()的变化研究表明正常温度下随着时间延长野生型株系中茉莉酸含量呈先增加后下降 干扰株系中茉莉酸含量逐渐增加超表达株系茉莉酸含量先增加再下降后上升 高温下 种株系随着时间延长体内茉莉酸含量呈现先增加后下降 图图 高温胁迫下茉莉酸含量的变化.高温胁迫下陆地棉水杨酸()的变化研究表明正常温度下 种株系随着时间延长水杨酸含量呈先上升再下降后上升在整个时期超表达株系 中水杨酸变化幅度较为明显分别为 、/其中在 达到最大值 高温下 干扰株系和野生型株系中水杨酸含量呈先下降再上升后下降 分别为 、/野生型 分别为 、/超表达株系高温胁迫中水杨酸含量呈先上升后下降分别为 、/高温胁迫前期超表达株系可以通过增加水杨酸含量来实现对植物抗逆保护但 下降为 /保护作用下降 图 图 高温胁迫下水杨酸含量的变化.高温胁迫下陆地棉综合评价研究表明得到各植物种测定指标成分的特征值、贡献率和累计贡献率得到 个主成分可以解释全部方差的.提取前 个主成分可以代表 个高温下指标信息的.在第 主成分分析中光合作用指标的贡献率较大其中蒸腾速率最大过氧化物酶最低第 主成分分析中生长素的贡献率较大水杨酸次之在第 主成分分析中丙二醛含量的贡献率最大第 主成分分析中脯氨酸含量的贡献率最大 蒸腾速率可视为反映植物抗高温性能的最重要生理生化指标其次是生长素含量、丙二醛含量和脯氨酸含量 表 排序排在前 的是 中的 野生型的 和 种材料抗高温能力由强到弱为:野生型超表达 综合得分为.野生型综合得分为.超表达综合得分为.表 第 期王 辉等:高温胁迫下陆地棉 转基因后代生理生化分析表 主成分因子载荷矩阵及主成分特征根 因子成分 丙二醛.净光合速率.气孔导度.胞间 浓度.蒸腾速率.叶绿素相对值.超氧化物歧化酶.过氧化物酶.可溶性蛋白 .脯氨酸.脱落酸.生长素.茉莉酸.水杨酸.方差贡献率().累计贡献率 ().表 主成分得分及综合评价 材料时间综合得分综合排序.讨 论.高温胁迫对陆地棉光合特性的影响气孔是植物与环境进行物质交换的通道气孔通过调节其开闭状态控制着 进入植物体内及水分从体内的散失 可溶性蛋白具有渗透调节的作用还能够在一定程度防止细胞质脱水 脯氨酸具有调节渗透及保护细胞结构稳新新疆疆农农业业科科学学第 卷定的作用 脱落酸具有促进植物休眠、抑制生长、促进气孔关闭和增加抗逆的作用 茉莉酸作为一种重要的新型植物内源激素通过信号传递来调控植物防御反应和抗逆发挥着重要作用 水杨酸作为植物产生系统获得性抗性的内源信号 当植物受到非生物因素影响时 植物体局部水杨酸含量增加促进抗逆蛋白合成、提高渗透调节能力和抗氧化能力并伴有一些防卫相关蛋白的表达 光合作用是一切生物直接或间接的能量来源是植物进行物质转换和能量代谢的关键 引起植物净光合速率下降的原因主要分为气孔因素和非气孔因素气孔限制因素引起的 下降表现为、的下降非气孔限制因素引起的 下降表现为、下降的同时 升高 研究中随着时间延长净光合速率 呈先下降后上升的同时气孔导度、蒸腾速率、细胞间 浓度 均也呈先下降后上升 的变化是由气孔限制因素所导致的与窦飞飞结论一致.高温胁迫对陆地棉光抗性相关的影响在高温下 氧化物酶呈先上升后下降而超表达和野生型材料先下降再上升后下降随着时间延长体内的氧化物酶都在下降可能导致酶活性下降也有相关研究在马铃薯和大白菜中发现同样的规律 超氧化歧化酶活性与氧化物酶活性不同 和野生型材料在高温下大致趋于平衡可能由于超氧化歧化酶活性不受环境影响在高温下对植物进行保护而超表达材料超氧化歧化酶活性异常显著敏感性材料会大量产生超氧化歧化酶 种材料随着时间延长体内丙二醛含量逐渐增加其中超表达材料在 丙二醛含量达到最大值且不同材料耐热性存在显著差异与王倩研究结论相似 脯氨酸具有阻止细胞膜透性的作用在高温胁迫下随着时间延长脯氨酸含量逐渐降低与前人研究结果相反随着时间延长脯氨酸调节细胞渗透的功能下降抗热胁迫能力减弱 在温度胁迫下植物体内通过提高可溶性蛋白含量来增强本身的抗逆性研究 种材料在高温下可溶性蛋白含量在整个时期相对较高可溶性蛋白遇到高温诱导产生热激蛋白来增加植物的的抗逆性.高温胁迫对陆地棉植物激素的影响植物内源激素在植物应对环境变化时起重要作用内源激素水平、合成和分布会受温度的影响而发生改变多种植物内源激素参与植物应对逆境胁迫时的信号转导 在高温下 和超表达材料生长素含量相对呈上升趋势提升植物耐受性与王日明研究结果相似野生型材料生长素含量随着时间延长呈现先上升后下降说明野生型抗热性差 杨长琴等研究结果显示高温胁迫下棉花叶片中 含量随着时间的延长呈先升后降的趋势研究在高温下超表达和野生型材料随着时间延长脱落酸含量呈先上升再下降后上升 材料随着时间延长脱落酸含量先上升后下降植物不一定总是通过提高 水平来抵抗高温胁迫 随着高温胁迫时间的延长种材料茉莉酸含量先升后下降与宋悦研究结果相似 和野生型材料在高温下随着时间延长水杨酸含量呈先下降再上升后下降超表达随着时间延长先上升后下降可能由于前期水杨酸促进抗逆蛋白合成来增加抗逆性但随着时间延长植物需求水杨酸逐渐增大致使水杨酸含量逐渐降低.高温胁迫下陆地棉综合评价植物响应高温是由体内各种机制共同制约环仅凭一个指标来评价植物耐热性是有很大的局限性 研究结果表明 耐热性最强其次野生型超表达耐热性最差 结 论 种材料抗高温能力由强到弱为 野生型材料超表达材料 在高温下可通过提高蒸腾速率来减弱逆境胁迫的危害提高生长素含量来积极调控植物生长提高细胞的渗透调节能力来减轻细胞遭受的损伤参考文献().():.().:.:./.():.第 期王 辉等:高温胁迫下陆地棉 转基因后代生理生化分析 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