玉米粉对西藏巨菌草青贮发酵品质及微生物多样性的影响_易政宏.pdf

营养研究NO.06 202385饲料研究 FEED RESEARCH玉米粉对西藏巨菌草青贮发酵品质及微生物多样性的影响易政宏 商振达 陈鑫艳 吕志 杨升 谭占坤 刘锁珠*（西藏农牧学院动物科学学院 西藏高原饲料加工工程研究中心 西藏高原生态草牧业协同创新中心，西藏 林芝 860000）摘要：试验旨在探究添加不同比例玉米粉对西藏地区巨菌草青贮发酵品质和微生物多样性的影响。试验以西藏地区种植的巨菌草为原料，设置4个青贮组，分别在巨菌草中添加0、5%、10%、15%玉米粉，每组设置5个重复。青贮60 d，取样测定青贮饲料发酵品质，利用16S rRNA测序技术分析巨菌草青贮微生物多样性。结果显示，添加玉米粉未显著改变巨菌草青贮饲料的干物质、粗蛋白、粗脂肪的含量及pH值，但显著降低了巨菌草青贮饲料的粗纤维和粗灰分含量（P0.05）；巨菌草青贮饲料中添加玉米粉可改善青贮饲料的感官品质。微生物多样性测定结果显示，添加玉米粉可提高巨菌草青贮饲料中厚壁菌门、乳杆菌属和明串珠菌属的相对丰度。研究表明，添加玉米粉可以改善巨菌草青贮饲料的感官品质，提高青贮发酵品质。关键词：巨菌草；玉米粉；青贮；发酵品质；微生物多样性中图分类号：S 816.5 文献标识码：A 文章编号：1002-2813（2023）06-0085-05 Doi：10.13557/ki.issn1002-2813.2023.06.018Effect of adding corn flour on fermentation quality and microbial diversity of Tibetan Pennisetum giganteum silageYI Zheng-hong SHANG Zhen-da CHEN Xin-yan L Zhi YANG Sheng TAN Zhan-kun LIU Suo-zhuAbstract:The experiment was to explore the effect of adding different proportions of corn meal on fermentation quality and microbial diversity of Pennisetum giganteum silage in Tibetan region.In the study,four silage groups were set with Pennisetum giganteum planted in Tibet as raw materials,and 0,5%,10%and 15%corn meal were added to Pennisetum giganteum silage,respectively,with five replicates in each silage group.After 60 d of silage,samples were taken to determine the fermentation quality of silage,and 16S rRNA sequencing technology was used to analyze the microbial diversity of megalosia silage.The results showed that adding corn meal did not significantly change the content of dry matter,crude protein and crude fat and pH value of Pennisetum giganteum silage,but significantly reduced the content of crude fiber and ash of Pennisetum giganteum silage(P0.05).Adding corn meal to Pennisetum giganteum silage could improve the sensory quality of silage.The results of microbial diversity measurement showed that adding corn meal can improve the relative abundance of Firmicurium,Lactobacillus and Candida in Pennisetum giganteum silage.The study indicates that adding corn meal can improve the sensory quality and fermentation quality of Pennisetum giganteum silage.Key words:Pennisetum giganteum;corn flour;silage;fermentation quality;microbial diversity近年来，我国畜牧业处于高速发展阶段，农业技术也愈发先进1，人工种植的牧草在反刍动物的日粮中应用也越来越广泛。西藏地处我国青藏高原，海拔较高、平均气温相对较低。高寒强紫外的自然环境使西藏地区的牧草生长期较短，产量较低，导致青绿饲料并非一年四季均具有足够的供应。饲草料资源短缺严重制约西藏地区畜牧业的发展2。因此，开发和扩大饲草料资源对西藏畜牧业的发展具有重要意义。青贮是饲料生产中常用的一种加工方法3，将青绿饲料置于密封的厌氧环境中，利用乳酸菌等微生物发酵为适口好的青贮饲料4。青绿饲料在青贮发酵后可以降低营养物质的流失，延长保质期，提高草食动物对青绿饲料中营养物质的利用5。巨菌草（Pennisetum giganteum）是一种优质型牧草，属多年生禾本科作物，是一种菌草6，具有生长速度快、第一作者：易政宏，硕士，研究方向为动物营养与饲料科学。通信作者：刘锁珠，硕士，教授，硕士生导师。基金项目：2022年度西藏农牧学院研究生创新计划项目（项目编号：YJS2022-20）；2022中央支持地方高校改革发展专项资金项目（项目编号：KY2022ZY-01）；西藏自治区科技成果转移转化项目（项目编号：XZ202101YD0019C）；西藏自治区区域科技协同创新专项（项目编号：QYXTZX-NQ2021-01）收稿日期：2022-10-17营养研究NO.06 202386饲料研究 FEED RESEARCH繁殖性能强、营养价值高、抗逆性强等优良特性。巨菌草在维持生态环境、畜牧业发展以及能源开发利用等方面具有巨大潜力7-8，可开发成为饲草料资源。经调查发现，西藏有诸多地区种植了巨菌草，且当地还通过铺设黑色地膜、搭设简易大棚等方式保证巨菌草的正常生长9-10，为西藏巨菌草饲料资源的开发提供了参考。但由于巨菌草中的可溶性碳水化合物的含量较少，不利于其常规青贮发酵进行11，提高巨菌草青贮饲料的发酵品质成为研究重点。本试验在巨菌草中添加可溶性碳水化合物含量较多的玉米粉进行混合青贮，探究添加不同比例的玉米粉对巨菌草青贮发酵品质和微生物多样性的影响，为巨菌草青贮饲料的制作提供参考。1材料与方法1.1试验材料巨菌草采自西藏农牧学院草业实习基地，于2021年7月在成熟期进行刈割。玉米使用114b摇摆式粉碎机粉碎，过20目筛。1.2试验设计试验采用完全随机设计，共设置4个巨菌草青贮组，每组 5 个重复，分别在巨菌草中添加 0（A 组）、5%（B组）、10%（C组）、15%玉米粉青贮（D组），在实验室小型青贮罐中进行青贮。1.3测定指标及方法1.3.1青贮饲料的制作将巨菌草切割成23 cm的小段，按照1.2比例加入玉米粉并充分混匀，置于250 mL的青贮罐内压实，25 青贮发酵60 d后，取出全部青贮饲料混匀后进行分析。1.3.2青贮饲料感官鉴定（见表1）选用德国农业协会（DLG）所推荐的等级评分标准12对巨菌草青贮饲料的气味、质地以及色泽进行感官评定。1.3.3青贮饲料发酵品质测定每个试验组分别取样品500 g置于120 的烘干箱中烘20 min，将样品置于65 烘干箱中烘48 h，直至恒重，测定初水分含量。烘干后使用114b摇摆式粉碎机粉碎样品，测定干物质含量13；采用杜马斯燃烧定氮法测定粗蛋白质含量13；采用索氏浸提法测定粗脂肪含量13；使用全自动纤维分析仪测定粗纤维含量13；采用灼烧法测定粗灰分含量13，每个试验组各取20 g样品置于烧杯中，加入80 mL蒸馏水，倒入组织粉碎机粉碎搅拌1 min，将混合液过滤，使用pH值测定仪测定滤液的pH值。1.3.4青贮饲料微生物多样性分析青贮结束时，采集青贮饲料样品于5 mL冻存管中，液氮中速冻，于-80 超低温冰箱中保存。将青贮饲料样品用干冰保存送至上海派森诺生物技术有限公司进行菌群结构测定。利用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒提取青贮饲料样品的总DNA，以提取的DNA为模板，使用引物5-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3和引物5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3进行PCR扩增，并对扩增产物进行检测和回收。制备测序文库，并对测序文库进行纯化、质检和定量，使用PacBio Sequel 测序仪对测序文库进行双端测序，并对测序数据进行分析。1.4数据统计与分析采用Vsearch软件对获得的序列进行聚类分析，按照97%的相似度对序列进行操作分类单元划分（OTUs），将OTU与Greengenes数据库相比对，获得分类学分析，利用多种 Alpha 多样性指数（Chao1 指数、Observed_species指数、Shannon指数和Simpson指数）评估菌群结构的丰富度和均匀度；通过主坐标分析（PCoA）考察各样本间的多样性差异。试验数据采用 Excel 进行整理，SPSS 23.0进行单因素方差分析，Duncans法进行多重比较。结果以“平均值标准差”表示，P0.05）。与A组相比，B组、C组、D组巨菌草青贮的粗纤维和粗灰分的含量显著降低（P0.05）。2.3不同比例玉米粉对巨菌草青贮饲料微生物多样性的影响2.3.1测序结果及细菌菌群结构多样性分析（见图 1、表4、图2）由图1可知，本研究对4个青贮组细菌菌群的V3V4高变异区进行测序，并对获得的 OTUs 在门、纲、目、科、属等5个分类水平上进行鉴定，共鉴定得到24个门、53个纲、129个目、237个科和547个属。A组鉴定得到15个门、31个纲、58个目、101个科和204个属，B组鉴定得到18个门、42个纲、102个目、185个科和357个属，C组鉴定得到20个门、34个纲、72个目、126个科和274个属，D组鉴定得到20个门、35个纲、76个目、134个科和277个属。由表 4 可知，B 组、C 组和 D 组的 Chao1 指数和Observed species指数显著高于A组（P0.05），表明巨菌草青贮中添加玉米粉对青贮饲料细菌菌群的表征多样性无显著影响。由图2可知，不同青贮组中微生物群落聚集在不同的区域内，A 组聚集在图中的下半区域，B 组、C 组、D组聚集在图中的上半区域，表明巨菌草青贮饲料添加玉米粉会改变发酵饲料的细菌菌群结构。2.3.2不同比例玉米粉对巨菌草青贮饲料细菌菌群结构组成的影响（见图3、图4）由图3可知，在门分类水平上，20个青贮饲料样品中共鉴定出10个细菌菌门，其中5个菌门的相对丰度大于 0.1%，依次为厚壁菌门（Firmicutes）、蓝细菌门（Cyanobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）；各组厚壁菌 门 的 相 对 丰 度 分 别 为 87.79%、92.39%、95.13%、94.90%，蓝细菌门的相对丰度分别为 9.81%、2.20%、1.30%和2.90%，为巨菌草青贮饲料的主要细菌菌门。由 图 4 可 知，在 属 分 类 水 平 上，魏 斯 氏 菌 属（Weissella）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）、明串珠菌属（Leuconostoc）、叶 绿 体 属（Chloroplast）、片 球 菌 属（Pediococcus）、线粒体属（Mitochondria）和别样棒菌属（Allobaculum）是巨菌草青贮饲料的优势菌属。表3不同比例玉米粉对巨菌草青贮饲料发酵品质的影响 组别A组B组C组D组初水分/%54.390.6758.470.3655.970.3755.680.67粗蛋白/%8.830.298.470.178.440.298.750.14干物质/%41.610.3139.500.3242.420.2742.150.67粗脂肪/%1.401.061.520.331.730.632.100.59粗纤维/%42.376.39a38.070.56b35.191.82c32.190.27d粗灰分/%5.430.69a4.720.17b4.110.67c4.100.05cpH值4.080.153.790.243.840.313.760.12注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05）；下表同。图2不同比例玉米粉与巨菌草青贮样品菌群PCoA分析图1各分类水平的细菌类群OTU数量表4不同比例玉米粉对巨菌草青贮饲料Alpha多样性的影响 组别A组B组C组D组Chao1指数263.3019.98c374.8150.56b496.7294.91a428.9134.48abObserved_species指数234.4310.79c319.2537.75b430.4782.66a365.5835.74abShannon指数3.340.273.170.493.400.653.390.57Simpson指数0.780.020.700.100.720.090.710.11营养研究NO.06 202388饲料研究 FEED RESEARCH2.3.3不同比例玉米粉对巨菌草青贮饲料细菌菌群差异的影响（见表5、表6）由表5可知，在门水平上，C组和D组中巨菌草青贮饲料的厚壁菌门相对丰度显著高于A组（P0.05），B组、C组和D组巨菌草青贮的蓝细菌门相对丰度显著低于A组（P0.05）；B组巨菌草青贮的变形菌门相对丰度显著高于其他组，D组巨菌草青贮的拟杆菌门相对丰度显著低于C组（P0.05）。由表6可知，在属分类水平上，C组巨菌草青贮魏斯氏菌属的相对丰度显著低于在 A 组（P0.05）；B组、C组、D组巨菌草青贮明串珠菌属的相对丰度显著高于A组（P0.05），叶绿体属和别样棒菌属的相对丰度显著低于A组（P0.05）；B组巨菌草青贮线粒 体 属 的 相 对 丰 度 显 著 高 于 A 组、C 组 和 D 组（P0.05）。3讨论饲草料资源短缺，严重制约了西藏畜牧业的发展，开发优质饲草料资源对西藏畜牧业的发展具有重要意义6。巨菌草植株叶片宽大且根茎粗壮发达14，具有生长速度快、繁殖性能好、抗逆性强等优良特性，可在西藏地区种植。但由于巨菌草碳水化合物含量不高，单独青贮效果不佳，探究如何改善巨菌草青贮饲料的品质对开发巨菌草青贮饲料至关重要。本研究在巨菌草青贮饲料中添加不同比例的玉米粉，分析玉米粉对巨菌草青贮饲料感官品质、发酵品质和菌群结构的影响。3.1不同比例玉米粉对巨菌草青贮感官品质的影响研究表明，添加玉米粉可以改变巨菌草青贮饲料的气味，明显提高巨菌草青贮的感官品质，与续元申等15得出杞柳皮青贮中添加5%玉米粉可改善其感官鉴定评价和张晓庆等16得出麻叶荨麻青贮中添加一定量玉米粉可提高青贮饲料品质和费氏评分的结论一致。因此，添加玉米粉有利于巨菌草青贮饲料的发酵。3.2不同比例玉米粉对巨菌草青贮发酵品质的影响本研究表明，添加玉米粉明显降低了巨菌草青贮的粗纤维含量，可能是因为添加玉米粉与巨菌草的总氮比例达到最合适的水平，促进了微生物的生长繁殖，消耗了粗纤维，与牟爱生等17对木薯叶青贮饲料研究结果相似。本研究中，各组青贮饲料的pH值均在4.2以下，添加玉米粉处理组巨菌草青贮的pH值在一定程度上低于无玉米粉处理组，可能是因为玉米粉中的碳水化合物使青贮过程进行更顺利。粗纤维含量降低能够提升饲料的适口性，增加动物的采食量，而pH值是衡量青贮质量优劣的评估标准之一18，较低的pH值有利于青贮发酵的进行，能够防止青贮过程中霉变的发生。一般青贮后pH值低于4.2能够作为青贮成功的标准19，因此，加入玉米粉图3门水平下各青贮组中细菌菌群组成图4属水平下各青贮组中细菌菌群组成表5不同比例玉米粉对巨菌草青贮饲料细菌门水平相对丰度的影响单位：%组别A组B组C组D组厚壁菌门87.796.29b92.392.39ab95.132.17a94.903.35a蓝细菌门9.815.84a2.201.50b1.301.13b2.901.93b变形菌门0.950.68b4.502.53a1.580.75b1.580.68b拟杆菌门0.980.86ab0.440.39ab1.631.49a0.250.22b放线菌门0.310.170.290.280.220.160.280.07表6不同比例玉米粉对巨菌草青贮饲料细菌属水平相对丰度的影响 单位：%组别A组B组C组D组魏斯氏菌属44.146.95ab30.317.10b13.384.98c52.2813.28a乳酸杆菌属29.815.81ab34.4114.65ab49.2311.78a17.216.71b明串珠菌属9.693.11b26.329.07a29.2012.56a22.288.33a叶绿体属9.803.23a2.201.00b1.490.57b1.500.53b片球菌属0.680.47ab0.560.40ab1.080.37a0.210.10b线粒体属0.120.04b2.651.12a0.260.16b0.210.09b别样棒菌属0.360.20a0.110.04b0.100.03b0.060.05b营养研究NO.06 202389饲料研究 FEED RESEARCH能提高巨菌草青贮的发酵品质。3.3不同比例玉米粉对巨菌草青贮微生物多样性的影响青贮是一个非常复杂的微生物活动的过程，青贮过程中微生物菌群的变化会对青贮饲料的发酵品质产生很多影响。因此，深入了解青贮过程中微生物多样性的变化有助于分析青贮饲料的营养物质变化情况20。本研究中，不同青贮组微生物多样性指数不同，表明巨菌草青贮中添加玉米粉会改变其菌群结构的组成。本研究发现，巨菌草青贮饲料的优势菌门为中共检测到24个门，优势菌门为厚壁菌门、蓝藻菌门和变形菌门，优势菌属为魏斯氏菌属、乳酸杆菌属和明串珠菌属，与朱见深等21得出乳杆菌属、克雷伯菌属及魏斯氏菌属为青贮玉米的优势菌属和周俊华等22得出乳杆菌属、醋酸杆菌属和芽孢杆菌属是青贮甘蔗尾叶的优势菌属的结果不同，表明农作物的种类不同，其青贮发酵过程中微生物的变化不同。本研究发现，添加玉米粉可以提高巨菌草青贮饲料中厚壁菌门的相对丰度，降低蓝细菌门的相对丰度。厚壁菌门23具有促进纤维素分解的作用，表明巨菌草青贮饲料中添加玉米粉可以降低其纤维成分的含量。本研究还发现，巨菌草青贮饲料中添加玉米粉可以提高青贮饲料中常见的乳酸菌菌种的相对丰度，如乳杆菌属和明串珠菌属，加强了产生乳酸的能力，抑制了有害杂菌的生长。4结论本研究结果表明，添加玉米粉与巨菌草混合青贮更有利于青贮进行，巨菌草青贮饲料中添加玉米粉可以改善青贮饲料的感官品质和粗纤维含量，提高乳酸菌菌种的丰度。参考文献1 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