用于肿瘤治疗的免疫检查点抑...关预测生物标志物的研究进展_郭蕊.pdf

郭蕊 等/用于肿瘤治疗的免疫检查点抑制剂相关预测生物标志物的研究进展 Chinese Journal of Biotechnology http:/ Apr.25,2023,39(4):1403-1424 DOI:10.13345/j.cjb.220650 2023 Chin J Biotech,All rights reserved 资助项目：中央高校基本科研业务费(buctrc201910)；2021 年新疆科协青年人才托举工程项目；京津冀基础研究合作专项19JCZDJC65800(Z)；新疆生产建设兵团重点领域科技攻关计划(2022AB022)This work was supported by the Fundamental Research Funds for the Central Universities,China(buctrc201910),the Young Elite Scientists Sponsorship Program by Xinjiang Association for Science and Technology(2021),Beijing-Tianjin-Hebei Basic Research Cooperation Special Project(19JCZDJC65800(Z),and the Scientific and Technological Research Project of Xinjiang Production and Construction Corps,China(2022AB022).*Corresponding author.Tel:[phone],E-mail: Received:2022-08-16;Accepted:2022-10-25 1403 生物工程学报 用于肿瘤治疗的免疫检查点抑制剂相关预测生物标志物的研究进展 郭蕊1，李小宁1，郝明炫1，梁有沣1，王磊1，杨昭1,2*1 北京化工大学 生命科学与技术学院 分子诊断技术创新研究中心，北京 100029 2 塔里木大学 生命科学与技术学院 新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室，新疆 阿拉尔 843300 郭蕊,李小宁,郝明炫,梁有沣,王磊,杨昭.用于肿瘤治疗的免疫检查点抑制剂相关预测生物标志物的研究进展J.生物工程学报,2023,39(4):1403-1424.GUO Rui,LI Xiaoning,HAO Mingxuan,LIANG Youfeng,WANG Lei,YANG Zhao.Advances in predictive biomarkers associated with immune checkpoint inhibitors for tumor therapyJ.Chinese Journal of Biotechnology,2023,39(4):1403-1424.摘 要：恶性肿瘤是严重威胁人类健康和社会发展的疾病。传统的肿瘤治疗方法如手术、放疗、化疗和靶向治疗等不能完全满足临床治疗的需求，新兴的免疫治疗成为了肿瘤治疗领域的研究热点。免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors,ICIs)作为一种肿瘤免疫治疗方法，已获批用于治疗多种肿瘤，如肺癌、肝癌、胃癌和结直肠癌等。然而，ICIs 在临床使用过程中，只有少数患者会出现持久反应，一些患者还会出现耐药和不良反应。因此，预测生物标志物的鉴定和开发对提高 ICIs 的治疗效果至关重要。肿瘤 ICIs 预测生物标志物主要包括肿瘤生物标志物、肿瘤微环境生物标志物、循环相关生物标志物、宿主环境生物标志物以及组合生物标志物等，对患者筛查、个体化治疗和预后评估具有重要意义。本文就肿瘤 ICIs 治疗预测生物标志物的前沿进展作一综述。关键词：肿瘤；免疫治疗；免疫检查点抑制剂；预测标志物；预后；耐药 综 述 ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1404 Advances in predictive biomarkers associated with immune checkpoint inhibitors for tumor therapy GUO Rui1,LI Xiaoning1,HAO Mingxuan1,LIANG Youfeng1,WANG Lei1,YANG Zhao1,2*1 Innovation Center of Molecular Diagnostics,College of Life Science and Technology,Beijing University of Chemical Technology,Beijing 100029,China 2 Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resources in Tarim Basin of Xinjiang Production and Construction Corps,College of Life Science and Technology,Tarim University,Alar 843300,Xinjiang,China Abstract:Malignant tumors are diseases that seriously threaten human health and social development.Traditional tumor therapies such as surgery,radiotherapy,chemotherapy and targeted therapy cannot fully meet the needs of clinical treatment,and emerging immunotherapy has become a research hotspot in the field of tumor treatment.Immune checkpoint inhibitors(ICIs)have been approved as a tumor immunotherapy method for the treatment of various tumors,such as lung cancer,liver cancer,stomach cancer and colorectal cancer,etc.However,during the clinical use of ICIs,only a small number of patients experienced durable responses,which also led to drug resistance and adverse reactions.Therefore,the identification and development of predictive biomarkers is crucial to improve the therapeutic efficacy of ICIs.The predictive biomarkers of tumor ICIs mainly include tumor biomarkers,tumor microenvironment biomarkers,circulation-related biomarkers,host environmental biomarkers and combinatorial biomarkers.They are of great significance for screening,individualized treatment and prognosis evaluation of tumor patients.This article reviews the advances of predictive markers for tumor ICIs therapy.Keywords:tumor;immunotherapy;immune checkpoint inhibitors;predictive biomarkers;prognosis;drug resistance 肿瘤是机体细胞在致癌因素的长期作用下，过度增生及异常分化而形成的一种赘生物，在临床上常以肿块的形式出现。免疫监视、免疫平衡和免疫逃逸是肿瘤发生的 3 个主要过程，细胞中的突变积累和宿主免疫能力降低是肿瘤发生的主要原因。免疫监视阶段指免疫系统识别、杀伤并清除体内突变肿瘤细胞。当肿瘤细胞在免疫监视的过程中存活下来，但无法进展，并与免疫细胞保持平衡时，就会出现免疫平衡期。如果肿瘤细胞的持续变异能够打破这种平衡状态，其将成功实现“逃逸”，导致免疫系统丧失对肿瘤细胞生长的控制。全球范围内，恶性肿瘤是导致人类死亡的主要原因之一。世界卫生组织国际癌症研究机构(WHO International Agency for Research on Cancer,IARC)全球肿瘤负担数据显示，2020 年全球新发肿瘤病例 1 929 万例，全球新增肿瘤死亡病例 996 万例1。从早期的手术治疗到放化疗，再到针对肿瘤分子遗传特性的靶向治疗，多年来人类同肿瘤的斗争从未停止。而近些年逐渐兴起的肿瘤免疫治疗，则是这场旷日持久战争中的重大突破。肿瘤免疫治疗旨在激活人体免疫系统，依靠自身免疫机能清除肿瘤细胞。1863 年，Rudolf Virchow 观察并描述了肿瘤组织中白细胞的浸润，是第一个假设免疫系统与肿瘤之间存在联 系的人2(图 1)。大约在同一时间，另外 2 位德国医生 William Busch 和 Friedrich Fehleisen 注 郭蕊 等/用于肿瘤治疗的免疫检查点抑制剂相关预测生物标志物的研究进展 ：010-64807509： 1405 意到，在一些肿瘤患者中，由于链球菌引起的丹毒感染，使他们的肿瘤消退。1868 年，Busch成为第一位通过用细菌感染患者来治疗肿瘤的医生。他用丹毒感染了一名无法手术的颈部软组织肉瘤患者，并报告肿瘤明显缩小3。1898 年，美国骨科医生 William B.Coley 意外地发现手术后感染酿脓链球菌病人的肿瘤出现了缓解，并用类似的方法治好了 10 多名患者，他也被称作“肿瘤免疫治疗之父”4。1957 年，澳大利亚免疫学家 Burnet 提出的“免疫监视理论”，也为免疫疗法治疗肿瘤提供了重要理论5。1992 年，Tasuku Honjo 发现了免疫检查点共抑制程序性死亡受体 1(programmed cell death protein 1,PD-1)，并揭示了 PD-1 是免疫反应的负调节因子。1994 年，James P.Allison 发现，通过阻断细胞毒 T 淋巴细胞相关抗原 4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)信号转导通路，可解除免疫系统中 T细胞的抑制，并大大增强 T 细胞的细胞毒性作用6。该疗法由于并非针对某种特定细胞，因此适用于各种肿瘤治疗，这是免疫治疗发展历史中的又一个里程碑事件。Tasuku Honjo 和 James P.Allison 因此获得了 2018 年诺贝尔生理学奖。1999 年，陈列平教授团队率先发现了B7-H1(后被称为 PD-L1)分子，并证明它在肿瘤免疫逃逸过程中扮演了重要角色。2002 年，他们首次证明了通过阻断 PD-1 与程序性死亡配体 1(programmed cell death ligand 1,PD-L1)的结合，能够增强免疫系统的抗肿瘤免疫反应7-8。陈列平教授作为 PD-L1 的发现者，开创了肿瘤免疫治疗的全新理念，是肿瘤免疫治疗的先驱者。图 1 肿瘤免疫治疗发展的关键里程碑2-8 Figure 1 Key milestones in tumor immunotherapy development2-8.ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1406 2000 年和 2001 年，Arlene Sharpe 和 Gordon Freeman 发现 PD-1 的天然配体(PD-L1 和 PD-L2)在一些肿瘤细胞中高表达，这表明 PD-1-PD-L1/PD-L2通路可能在肿瘤免疫逃逸系统中发挥作用8。自 2011 年美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准第一个靶向CTLA-4 的单克隆抗体(即易普利姆玛)用于治疗转移性黑色素瘤以来9，免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors,ICIs)的时代已经展开。紧随其后的是针对 PD-1(帕博利珠和纳武利尤)和 PD-L1(阿特珠、德瓦鲁和阿维鲁)的单克隆抗体的开发10。ICIs 的获批上市为越来越多的晚期恶性肿瘤患者带来了长期生存的希望，但是 ICIs 的耐药仍然影响着患者的生存获益。ICIs 的耐药机制可以是原发性的或先天性的，也可以是继发性的或获得性的11。引发耐药的原因包括新抗原丢失、替代免疫检查点的上调表达、干扰素-(interferon-,IFN-)信号通路相关基因的缺失12和肠道微生物组的失调等。生物标志物是指可供客观测定和评价的一个普通生理或病理或治疗过程中的某种特征性的生化指标，通过对它的测定可以获知机体当前所处的生物学过程。理论上应该具备高度的特异性、足够的灵敏度和稳定性、良好的重复性和便于取样等特点。预测生物标志物是用来识别肿瘤患者对特定免疫治疗方法产生反应或耐药性的生物标志物13-14。近年来越来越多的人关注于肿瘤 ICIs 相关预测生物标志物的识别和开发，本文总结了肿瘤 ICIs 多种预测标志物的最新进展，主要包括肿瘤生物标志物、肿瘤微环境生物标志物、循环相关生物标志物、宿主环境生物标志物以及组合生物标志物等，并且探讨了现有肿瘤 ICIs 预测标志物的局限性以及未来的发展趋势。1 肿瘤生物标志物 1.1 蛋白生物标志物 PD-L1 也称 B7-H1 或 CD274，是 PD-1 的第一个功能特征的配体，由 CD274 基因编码。肿瘤细胞表面的 PD-L1与 T细胞上的受体 PD-1相互作用，抑制 T 细胞的激活，引起 T 细胞的凋亡，在免疫应答负性调控方面发挥重要作用。PD-L1有组成型表达和诱导型表达2种表达模式，分别对应先天免疫反应和适应性免疫反应15。在静息淋巴细胞、抗原呈递细胞、合胞滋养细胞和树状细胞中可以发现低水平的 PD-L1 组成型表达。在炎症或感染的情况下，PD-L1 诱导型表达可作为造血细胞、内皮细胞和上皮细胞的抑制信号，抑制 T 淋巴细胞的激活并发挥免疫抑制作用。组成型 PD-L1 的表达主要通过MAPK 和 PI3K/Akt 途径调节，诱导型 PD-L1表达主要依赖于细胞外信号，包括细胞因子、表皮生长因子和细胞外缺氧条件16。Park 等17在进行纳武利尤单抗或帕博利珠单抗治疗的 70 名非小细胞肺癌患者的临床试验中发现，PD-L1 低表达组(SP26330%,22C3 80%)患者的疾病控制率(disease control rate,DCR)为 24.1%，中位无进展生存期(progression-free survival,PFS)为 1.6 个月；PD-L1 高表达组患者(SP26330%,22C380%)的DCR为56.1%，中位 PFS 为 4.1 个月。可见 PD-L1 高表达组患者的 DCR(P=0.028)和 PFS(P=0.04)显著高于PD-L1 低表达组患者。此外，Herbst 等18研究探索了帕博利珠单抗后线治疗 PD-L11%的晚期非小细胞肺癌患者的疗效，结果显示，PD-L11%组 3 年 PFS 率为 12.7%，3 年总生存(overall survival,OS)率为22.9%，而PD-L150%组 3 年 PFS 率和 OS 率分别为 21.9%和 34.5%。郭蕊 等/用于肿瘤治疗的免疫检查点抑制剂相关预测生物标志物的研究进展 ：010-64807509： 1407 上述研究结果说明，PD-L1 的高表达能够较好地预测非小细胞肺癌患者接受 ICIs 治疗的效果，即高表达 PD-L1 的非小细胞肺癌患者在ICIs 治疗中会获得更大益处(表 1)。1.2 核酸生物标志物 1.2.1 肿瘤突变负荷 肿瘤突变负荷(tumor mutational burden,TMB)指的是肿瘤基因组中体细胞突变的数量。TMB是基于肿瘤突变特异性新抗原在肿瘤细胞表面主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)上呈现，然后被肿瘤浸润 T 细胞识别19。大量的体细胞突变会导致更多的新抗原出现在肿瘤细胞表面，从而增加免疫原性，免疫系统可以识别和攻击这些抗原20，不同类型的肿瘤显示出不同的体细胞突变负荷21。迄今为止，非小细胞肺癌和黑色素瘤的突变频率最高22。在一项开放标签、随机、III 期试验中，共招募了 1 739 名晚期非小细胞肺癌患者，其中139 名患者被分配到纳武利尤单抗加易普利姆玛单抗联合治疗组。结果显示，低 TMB(10 个突变/兆碱基)组中，联合治疗组患者的中位 PFS为 3.2 个月，而在高 TMB(10 个突变/兆碱基)组中，联合治疗组患者的中位 PFS 为 7.2 个月。可见高 TMB 的非小细胞肺癌患者接受 ICIs 治疗会有更长的 PFS23。另一项包括 1 662 名接受 ICIs 治疗的晚期黑色素瘤患者的临床和基因组数据分析显示，在所有患者中，较高的 TMB 与较好的 OS 相关(HR=0.52,P=1.6106)24。Wang 等25招募了 54 名接受特瑞普利单抗治疗的晚期胃癌患者，其中 TMB12 个突变/兆碱基的患者定义为高 TMB，TMB12 个突变/兆碱基的患者被定义为低 TMB。结果显示，低TMB 组的 PFS 为 1.9 个月，OS 为 1.0 个月。而高 TMB 组的 PFS 为 2.5 个月，OS 为 14.6 个月。高 TMB组的 PFS在比低 TMB组更长(HR=0.51,P=0.055)。更重要的是，与低 TMB 组相比，高TMB 组在 OS 方面表现出显著的生存优势(P=0.038)。综上所述，在接受 ICIs 单药治疗非小细胞肺癌、黑色素瘤和胃癌的患者中，TMB 高的患者的疗效得到提高。另外，TMB 低的患者常被认为肿瘤新抗原产生较少，不利于免疫细胞的激活和杀伤，从而导致 ICIs 耐药的发生。因此，高 TMB 可以作为非小细胞肺癌、黑色素瘤和胃癌患者接受 ICIs 治疗生存获益的预测标志物。1.2.2 错配修复缺陷/高度微卫星不稳定 DNA 错 配 修 复(DNA mismatch repair,MMR)系统广泛存在于从原核生物到真核生物的生物体中，是细胞进化中高度保守的修复机制26。在 DNA 复制过程中会出现碱基错配，而 MMR 系统可以识别这些错配的碱基，进行剪切，合成新链进行修复。MMR 系统包括错配修复功能缺陷(mismatch repair-deficient,dMMR)和错配修复功能完整(mismatch repair-proficient,pMMR)。当 MMR 系统出现异常时，就会引起 dMMR，不能对微卫星复制错误进行识别和修复进而导致微卫星不稳定性(microsatellite instability,MSI)。如果 2 个或 2 个以上的重复 被 改变，肿瘤被认为微卫星不稳定性高(microsatellite instability-high,MSI-H)；如果只发现一个突变序列，肿瘤被认为是微卫星不稳定性低(microsatellite instability-low,MSI-L)。否则，据说它具有微卫星稳定性(microsatellite stability,MSS)。在许多肿瘤中，dMMR 和 MSI-H之间有很高的一致性(几乎为 90%95%)，因此，这 2 个术语几乎可以互换使用27。MSH2 缺失、MLH1 或 MSH2 突变、MLH1甲基化失活和转录沉默会导致 Lynch 综合征 ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1408 28。Lynch 综合征是一种常见的遗传性疾病，与多种肿瘤有关，尤其是结直肠癌和胃癌。此外，在多种肿瘤中发现 dMMR 和 MSI-H 增多导致肿瘤新抗原增多，可能对 ICIs 治疗有益29。作为 KEYNOTE-016 试验的部分公布结果，41 名结直肠癌患者接受帕博利珠单抗治疗，其中包括 11 名 dMMR 的结直肠癌患者和 21 名pMMR 的结直肠癌患者。结果显示，pMMR 的结直肠癌患者 PFS 率为 11%，中位 PFS 为 2.2 个月，中位 OS 为 5.0 个月，而 dMMR 的结直肠癌患者 PFS 率为 78%，未达到 PFS 和 OS30。Janjigian 等31在 160 名接受 ICIs 治疗的晚期或转移性胃癌患者中发现，MSI-L 组或 MSS组的客观缓解率(objective response rate,ORR)为 11%，而 MSI-H 组的 ORR 为 29%。上述研究表明，dMMR 可以预测结直肠癌患者接受帕博利珠单抗治疗的敏感性，而MSI-H 可以预测胃癌患者接受 ICIs 治疗敏感性。MSI-H/dMMR 比例低时，导致肿瘤相关抗原产生减少，可能会引起耐药。因此，MSI-H/dMMR 是结直肠癌和胃癌患者接受 ICIs 治疗的预测标志物。1.2.3 表皮生长因子受体 表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是一个酪氨酸激酶受体成员的ERBB 家族32。EGFR 位于细胞表面，其与配体结合后，可激活 EGFR 细胞内区域的酪氨酸激酶。酪氨酸激酶通过催化细胞内底物蛋白的磷酸化，促进细胞生长、DNA 合成和肿瘤相关基因的表达33，诱导细胞分化和增殖。在许多肿瘤中，EGFR 会发生突变或过表达，在胶质细胞瘤的研究中发现 EGFR 的高表达主要与其基因扩增有关，但也与蛋白质翻译及翻译后修饰有关。Haratani 等34评估了在 EGFR-TKI 治疗期间疾病进展后接受了纳武利尤单抗治疗 25 名EGFR 基因耐药突变(T790M)的非小细胞肺癌患者，结果显示，T790M 阴性和 T790M 阳性患者的中位 PFS 分别为 2.1 个月和 1.3 个月(HR=0.48,P=0.099)。Hastings 等35用 ICIs 治疗了 126 名最常见的 EGFR 基因突变(EGFR19和EGFRL858R)患者，并将他们与 212 名 EGFR 野生型患者进行比较。研究人员发现，在 OS 获益方面，EGFR野生型和EGFRL858R之间没有差异，而 EGFR19组的 OS 较短(分别为 P=0.069 和P=0.03)。这些数据表明，携带有 EGFR 突变的肿瘤患者，使用 ICIs 治疗的益处显著降低。因此，EGFR 突变是晚期非小细胞肺癌患者接受 ICIs治疗不良预后的预测标志物。1.2.4 KRAS KRAS 是一种原癌基因，它是膜相关 G 蛋白 RAS 家族的成员，编码一种具有内在 GTPase活性的蛋白质，参与多种细胞反应，包括增殖、细胞骨架重组和存活。KRAS 是酪氨酸激酶受体下游的信号转导因子，与 RAS/RAF/MAP 激酶信号通路、细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)和 RAS/MAPK 信号通路的激活有关。KRAS 基因通常在非小细胞肺癌中发生突变。Dong 等36在 34 名晚期非小细胞肺癌患者接受了帕博利珠单抗治疗的试验中发现，KRAS野生型组的 PFS 为 3.5 个月，而 KRAS 突变组的 PFS 为 14.7 个月，与接受帕博利珠治疗的野生型患者相比，KRAS 突变患者获得了显著延长的 PFS(P=0.012)。综上所述，ICIs 作为一种挽救疗法在具有KRAS 突变型的晚期非小细胞肺癌患者中显著延长了 OS，这表明 KRAS 突变状态是非小细胞肺癌患者接受 ICIs 治疗生存获益的预测标志物。郭蕊 等/用于肿瘤治疗的免疫检查点抑制剂相关预测生物标志物的研究进展 ：010-64807509： 1409 1.2.5 STK11/KEAP1 STK11 代表 AMP 活化蛋白激酶的关键上游激活剂，这是一种中央代谢传感器，参与不同细胞过程对细胞内能量变化的反应，包括调节葡萄糖、脂质代谢、细胞生长和稳态37。KEAP1 是核因子红细胞 2 相关因子 2 的主要调节因子，在细胞对氧化应激的反应中起核心作用，调节大量基因的表达38。在大约 11%27%的非小细胞肺癌患者中发现 KEAP1 功能缺失突变。在大约 40%47%和 28%的非小细胞肺癌患者中分别发现了KRAS 或 STK11 的并发突变38-39。Shang 等40招募了 598 名非鳞状非小细胞肺癌患者，其中有 304 名患者接受了阿特珠单抗治疗。结果显示，携带 STK11/KEAP1 突变的患者的 OS 均比野生型差(P0.05)。以上研究说明，STK11/KEAP1 突变是接受阿特珠单抗治疗的非鳞状非小细胞肺癌患者不良预后的预测标志物。1.2.6 新抗原负荷 新抗原来源于体细胞突变，与 MHC-I 类结合，并在肿瘤细胞表面表达。新抗原赋予肿瘤高免疫原性并诱导抗肿瘤免疫反应。新抗原由肿瘤细胞释放并被专业的抗原呈递细胞捕获，然后靶向肿瘤特异性抗原的效应 T 细胞被激活。活化的 T 细胞迁移并渗入肿瘤，特异性识别肿瘤细胞上的抗原并杀死肿瘤细胞。免疫原性强的肿瘤细胞被清除，免疫原性弱的肿瘤细胞逃避免疫监视。一项对 I 期/II 期和 III 期/IV 期肺癌样本的回顾性研究表明，高新抗原负荷(neoantigen load,NAL)与较长的 OS 相关(P=0.025)41。Anagnostou 等42在接受帕博利珠单抗治疗的非小细胞肺癌患者人群中发现，持续临床获益的患者 NAL 要明显高于非持续获益的患者。而对治疗过程中出现耐药的患者研究发现，治疗前至耐药过程中将会丢失 718 个能产生有效应答的突变相关新抗原，取而代之的则是更复杂的新生突变，新生突变参与编码肿瘤抗原的比例下降(8%vs.19%)且改变 T 细胞受体克隆性，从而导致 ICIs 耐药的产生。另一项关于 201 名局部晚期或转移性尿路上皮癌患者接受了德瓦鲁单抗治疗的研究表明，具有较高 NAL 的患者表现出更好的 OS(HR=0.43)43。上述研究表明，高 NAL 与非小细胞肺癌和尿路上皮癌患者较长的 OS 和临床获益相关，对于非小细胞肺癌患者，低 NAL 会导致耐药的发生。因此，高 NAL 是非小细胞肺癌和尿路上皮癌患者接受ICIs治疗生存获益的预测标志物。2 肿瘤微环境生物标志物 2.1 细胞生物标志物 肿 瘤 浸 润 淋 巴 细 胞(tumor infiltrating lymphocytes,TIL)是指从血液循环渗入肿瘤组织的淋巴细胞，主要由 T 细胞、B 细胞和自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)组成。肿瘤浸润T 淋巴细胞是免疫治疗过程中最重要的效应细胞类型，其主要包括以下亚型：CD8+细胞毒性T 淋巴细胞、CD4+T 辅助淋巴细胞(Th)、CD45RO+记忆 T 细胞(Tm)和 FOXP3+调节 T 细胞(Tregs)等。其中 CD8+T 淋巴细胞在抗肿瘤免疫中起到核心作用44。不同时期激活的 TIL 具有不同的表型和异质性45。当肿瘤组织中存在大量 TIL 时，表明机体启动了针对肿瘤的免疫反应。一项临床试验关于接受纳武利尤治疗的221 名非小细胞肺癌患者，其中高 TIL 计数的存在定义为10%密度，分析发现，在纳武利尤队列中，低 TIL 组中位 PFS 为 2.2 个月，中位 OS ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1410 为 8.4 个月，而高 TIL 组中位 PFS 为 13.0 个月，中位 OS 未达到46。Diem 等47在接受易普利姆玛治疗的 9 名III 期到 IV 期转移性黑色素瘤患者的临床试验中发现，在淋巴结显示应答者和无应答者之间TIL 的差异。所有应答者均显示淋巴结转移灶内有 CD3、CD4 和 CD8+T 细胞浸润。无应答者的中位 PFS 为 3.3 个月，中位 OS 为 8.2 个月，而应答者中位 PFS 为 6.8 个月，并且在最后一次随访仍然存活(中位随访时间为 41.8 个月)。淋巴结转移的 TIL 与较长的 PFS(P=0.09)和 OS(P=0.08)相关。Balatoni 等48对来自 30 名接受易普利姆玛治疗的转移性黑色素瘤患者的手术组织样本进行分析。在单变量分析中，发现CD4+、CD8+、CD45RO+、FOXP3+和 CD16+细胞密度与 OS 显著相关(P=0.029 0、P=0.009 3、P=0.018 0、P=0.008 3 和 P=0.004 7)，在多变量分析中，FOXP3+细胞的数量(P=0.016)被证明是独立的预测因素。因此，具有较高 TIL 比例的非小细胞肺癌患者拥有较长的 PFS 和 OS，即高比例 TIL 是非小细胞肺癌患者良好获益的预测标志物。而对于黑色素瘤患者，数据表明TIL子集如CD4+、CD8+、CD45RO+、FOXP3+和 CD16+细胞等可被视为接受易普利姆玛治疗的黑色素瘤患者的候选预测标志物。2.2 蛋白生物标志物 2.2.1 淋巴细胞活化基因 3 淋巴细胞相关基因 3(lymphocyte associated gene 3,LAG-3)是一种跨膜蛋白，主要在活化的T 细胞和 NK 细胞中表达。LAG-3 位于 T 细胞上。它与 CD4 具有结构同源性并结合其配体，即具有更高亲和力的 MHC-II。此外，LAG-3阻断导致 IFN-、肿瘤坏死因子 和促炎白细胞介素的产生增加49。Gettinger 等50通过分析对 PD-1 抑制剂获得性耐药的非小细胞肺癌患者的肿瘤标本，发现了8名患者中有5名患者LAG-3的表达上调。因此，LAG-3 表达上调会影响非小细胞肺癌患者接受 ICIs 治疗的敏感性。2.2.2 T细胞免疫球蛋白和含有粘蛋白结构域 3 T 细胞免疫球蛋白和含有粘蛋白结构域 3(T cells immunoglobulin domain and mucin domain protein-3,TIM-3)在多种免疫细胞上表达。TIM-3 最初被发现表达于 Th1 细胞表面，作为负调节因子与配体半乳糖凝集素 9(galectin-9,Gal-9)结合，介导 Th1 细胞凋亡。TIM-3 与PD-1/PD-L1 阻断、逆转 T 细胞耗竭和改善抗肿瘤免疫反应可能有协同作用51。有研究发现，TIM-3 在用抗 PD-1 治疗产生耐药性的 T 细胞中高表达，证实了抗 PD-1 治疗发生耐药的主要机制是选择性激活新的免疫检查点 TIM-3 从而导致免疫逃逸52。Limagne等53已经证明了 TIM-3/Gal-9 和其他免疫检查点蛋白的上调是非小细胞肺癌患者对抗 PD-1治疗产生耐药性的潜在机制。2.2.3 T 细胞免疫球蛋白和 ITIM 结构域 T 细胞免疫球蛋白和 ITIM(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif)结构域蛋白(T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains,TIGIT)能够通过与肿瘤细胞和抗原呈递细胞上的配体 CD155 结合来抑制 T 细胞和 NK 细胞，同时 TIGIT 的表达与 PD-1 表达密切相关，在临床中显示出了 TIGIT 阻断与 PD-L1 阻断的协同作用54。Zhang 等55证明，阻断 TIGIT 能改善接受抗 PD-1 治疗荷瘤小鼠的疗效，这提示 TIGIT表达的上调可能是对 ICIs 治疗产生耐药性的机制之一。Kawashima 等56在接受 ICIs 治疗的黑色素瘤患者中发现，TIGIT/CD155 轴可介导对 郭蕊 等/用于肿瘤治疗的免疫检查点抑制剂相关预测生物标志物的研究进展 ：010-64807509： 1411 ICIs 的耐药性。因此，TIGIT 阻断剂可能是黑色素瘤患者接受 ICIs 治疗耐药的潜在候选药物。2.2.4 T 细胞活化的 V 域免疫球蛋白抑制因子 T 细胞活化的 V 域免疫球蛋白抑制因子(V-domain immunoglobulin inhibitor of T cell activation,VISTA)主要在髓源性抑制细胞和抗原呈递细胞上表达，并下调 T 细胞活化57。值得注意的是，VISTA 阻断剂似乎抑制了调节性T 细胞免疫抑制功能58。有研究证实，VISTA 的高表达是胰腺癌对现有的 ICIs 不敏感的主要原因59。Kakavand等60收集了 34 份转移性黑色素瘤活组织样本，在获得性免疫检查点抑制剂治疗耐药患者中，他们观察到肿瘤内 VISTA+淋巴细胞表达增加，这表明 VISTA 表达上调可能是耐药形成的重要机制。2.2.5 IFN-IFN-信号通路在免疫监视中是一把双刃剑。一方面，CD8+T 细胞通过分泌 IFN-抑制肿瘤细胞增殖并增强免疫活性。另一方面，T细胞衍生的 IFN-上调肿瘤细胞上的 PD-L1 表达，作为保护肿瘤细胞免受免疫监视攻击的屏障61。由 IFN-驱动上调的 PD-L1 是潜在的肿瘤杀伤活化的标志，通常认为 IFN-表达预测抗 PD-1/PD-L1 疗法的有利免疫微环境62。在一项回顾性分析中，评估了 17 名接受了纳武利尤单抗治疗的非小细胞肺癌患者和 21 名接受了帕博利珠单抗治疗的黑色素瘤患者。在非小细胞肺癌患者中，IFN-低表达患者的 PFS为 2.0 个月，IFN-高表达患者的 PFS 为 5.1 个月(P=0.012 4)。同样地，在黑色素瘤患者中，与低表达 IFN-的患者(1.9 个月)相比，高表达 IFN-的患者有较长的 PFS(5.1 个月，P=0.009 9)63。IFN-通路在原发、适应及获得性耐药中均起到作用，且对抗肿瘤免疫应答有双向作用。Gao等64评估了16名接受易普利姆玛单抗治疗的黑色素瘤患者的 IFN-信号通路相关基因的突变情况，其中 12 名患者对治疗无反应。结果显示，对易普利姆玛无反应的转移性黑色素瘤患者携带 IFN-信号通路相关基因(IFNGR1、IFNGR2、JAK2 和 IRF-1)的缺失。上述研究表明，在非小细胞肺癌和黑色素瘤患者中，IFN-高表达的患者有较长的 PFS，说明 IFN-表达上调可以预测患者接受 ICIs 治疗的敏感性。而 IFN-信号通路相关基因缺失是引发 ICIs 治疗的重要耐药机制。因此 IFN-信号通路相关基因缺失也是预测患者 ICIs 治疗耐药的潜在生物标志物。3 循环相关生物标志物 3.1 细胞生物标志物 3.1.1 中性粒细胞-淋巴细胞比值 中性粒细胞可作为促肿瘤白细胞，能够刺激和抑制肿瘤发生抗肿瘤免疫反应，参与转移级联，是血管生成的效应物，促进肿瘤细胞和内皮细胞渗漏到循环中，因此有助于将炎症反应重新导向肿瘤促进方向65。淋巴细胞对新生肿瘤细胞的免疫监视和破坏至关重要，因此具有抗肿瘤作用。中性粒细胞-淋巴细胞比值(neutrophil-