猪胸膜肺炎放线菌分离鉴定与耐药性检测_吕凤禄.pdf

文章编号：1673-887X(2023)05-0144-03猪胸膜肺炎放线菌分离鉴定与耐药性检测吕凤禄，赵欢（1.北镇市动物疫病预防控制中心（动物卫生监督中心），辽宁北镇121300；2.北镇市农业综合行政执法队，辽宁北镇121300）摘要为了分析某地区规模化养殖场及散养户中猪胸膜肺炎放线菌流行情况与对临床中常用抗菌药物耐药性情况，文章对2021年2023年采集某地区规模化养殖场及散养户中疑似患猪胸膜肺炎放线菌病不同日龄猪的咽拭子、鼻拭子及死亡猪的肺脏组织170份，采用细菌分离培养、形态学观察、生化鉴定及PCR方法对猪胸膜肺炎放线菌进行鉴定，采用K-B药敏纸片法检测分离菌株的耐药性。结果显示：从170份病料样品中分离到65株猪胸膜肺炎放线菌；分离的65株猪胸膜肺炎放线菌对新霉素、磺胺间甲氧嘧啶、庆大霉素等10种药物耐药率在50.8%以上，对头孢噻肟、头孢噻呋、环丙沙星等8种药物耐药率在6.2%33.8%，为该地区仔猪源沙门菌病防控和合理用药提供参考。关键词仔猪；沙门菌；分离鉴定；耐药性分析中图分类号S858.28文献标志码Adoi:10.3969/j.issn.1673-887X.2023.05.054Isolation Identification and Drug Resistance Detection of Porcine Pleuropneumonia ActinomycetesLyu Fenglu,Zhao Huan(1.Beizhen Animal Disease Prevention and Control Center(Animal Health Supervision Center),Beizhen 121300,Liaoning,China;2.Beizhen Agricultural Comprehensive Administrative Enforcement Team,Beizhen 121300,Liaoning,China)AbstractAbstract：In order to analyze the prevalence of porcine pleuropneumonia actinomycetes in large-scale farms and free-range households in a certain area and their resistance to commonly used antibiotics in clinical practice,the paper collected 170 throat swabs,nose swabs and lung tissues of dead pigs of different ages suspected to be infected with porcine pleuropneumonia actinomycetes inlarge-scale farms and free-range households in a certain area from 2021 to 2023.The actinomycetes porcine pleuropneumoniae wereidentified by isolation and culture,morphological observation,biochemical identification and PCR.The drug resistance of the isolates was detected by K-B drug sensitive disk method.The results showed that 65 strains of actinomyces pleuropneumoniae were isolated from 170 samples.The resistance rates of 65 strains of actinomyces pleuropneumoniae isolated to 10 drugs such as neomycin,sulfamethoxil and gentamicin were above 50.8%,and the resistance rates of 8 drugs such as cefotaxime,ceftiofur and ciprofloxacinwere 6.2%33.8%,providing reference for the prevention and control of salmonellosis of piglets in this area and rational drug use.Key words：piglet,salmonella,isolation and identification,drug resistance analysis在猪养殖过程中，不同日龄猪的呼吸道疾病成为临床中的常见疾病，对不同阶段猪的感染率和死亡率均较高，尤其是对仔猪的危害较大。引起不同日龄猪的呼吸道疾病的病原有许多，如细菌性病原引起的呼吸道感染、病毒性病原引起的呼吸道感染、支原体性病原引起的感染及寄生虫性病原等1，2。相关研究表明，临床中以细菌性病原引起的呼吸道感染较为常见，细菌性病原主要包括副猪嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌及支气管败血波氏杆菌链球菌等，尤其是猪胸膜肺炎放线杆菌最为常见，猪胸膜肺炎放线杆菌严重影响猪的健康生长、也是猪死亡的重要因素之一，且在临床中常以多种病原菌和病毒混合感染为主3，4。猪传染性胸膜肺炎是由不同流行血清型的猪胸膜肺炎放线杆菌引起不同日龄猪的一种传染性细菌性呼吸道传染病，该病临床中以呼吸困难、血性纤维素性胸膜肺炎、坏死性肺炎为主要的病理变化，引起严重的呼吸道感染且呈现急性死亡，其死亡率高达 70%以上，该病成为危害养猪业严重的细菌疾病，危害我国养猪业的发展，给养猪业造成严重的经济损失。近年来，在我国不同地区的养殖场中感染性胸膜肺炎的发病率有增无减，且呈上升趋势。因此，对猪胸膜肺炎放线菌的防控具有重要意义。许多相关研究表明，在临床中猪胸膜肺炎放线菌对临床中常用的药物会产生严重的耐药性，这给猪胸膜肺炎放线菌病的治疗带来一定困难，同时还威胁人们的健康7。本试验从采集的疑似患猪胸膜肺炎放线菌病的病料样品中分离得到65株猪胸膜肺炎放线菌病，进行耐药性清情况监测，为指导临床合理用药提供参考依据。1材料与方法1.1菌株来源2021年2023年采集某地区规模化养殖场及散养户中疑似患猪胸膜肺炎放线菌病不同日龄猪的咽拭子、鼻拭子及收稿日期2022-02-22作者简介吕凤禄（1980-），女，辽宁人，中级兽医，研究方向：畜牧技术推广。动物科学第5期（总第401期）144死亡猪的肺脏组织170份。1.2细菌分离与培养对采集的疑似患猪胸膜肺炎放线菌病不同日龄猪病料组织170份和样品组织（咽拭子、鼻拭子及死亡猪的肺脏）150份，在无菌条件下分别划线接种于THB平板（含NAD）37培养1218 h后，接种于THB液体培养基（含NAD）进行纯化培养，参照革兰氏染色试剂盒说明书对纯化培养的分离菌株进行染色和显微镜观察；参考文献报道法取纯化后分离菌株划线接种于胰蛋白胨血琼脂平板培养基上再接种金黄色葡萄球菌后，37培养1224 h后观察是否有卫星现象，同时调整菌液浓度，对分离的细菌进行生化鉴定试验。1.3细菌PCR鉴定在生工生物工程（上海）股份有限公司合成猪胸膜肺炎放线菌鉴定引物，鉴定引物的片段大小为418 bp，以临床分离菌株为模板用猪胸膜肺炎放线菌鉴定引物（5-TTATCC-GAACTTTGGTTTAGCC-3；5-CATATTTGATAAAACCATCC-GTC-3）对分离菌株进行PCR鉴定8。1.4药敏试验将临床中分离的猪胸膜肺炎放线菌用K-B药敏纸片法进行药敏试验，其菌株药敏试验的操作流程及判定结果参照美国临床实验室标准化协会（CLSI）2013年推荐的标准K-B纸片法，每1种药物菌做3个重复，取其平均值，记录每一株分离菌株的药敏试验结果，统计每株猪胸膜肺炎放线菌分离菌株的耐药性。2结果与分析2.1细菌分离培养疑似猪胸膜肺炎放线菌分离菌株在THB平板（含NAD）长出特征性菌落形态；革兰氏染色可见分离菌株成链状排列或者单个的红色短杆菌（见图1）。分离的菌株胰蛋白胨血琼脂平板培养基上出现典型的卫星现象（见图2）。株疑似猪胸膜肺炎放线菌的培养特性、形态学及生化特性结果与 伯杰细菌鉴定手册 中报道的基本一致，经过统计，65株分离菌株初步鉴定为猪胸膜肺炎放线菌。图1分离菌株革兰氏图2分离菌株的卫星现象染色结果（1 000）Fig.1 Gram staining resultsFig.2 Satellite phenomenonof isolated strainsof isolated Strains2.2细菌PCR鉴定65株疑似猪胸膜肺炎放线菌分离菌株通过PCR鉴定均扩增出大约为418 bp目的基因条带（部分分离菌株PCR鉴定结果见图3），65株疑似猪胸膜肺炎放线菌的分离菌株从分子生物学水平上鉴定为猪胸膜肺炎放线菌。注：M：DL-2 000 DNA相对分子质量标准；1-6：分离菌株；7：空白对照图3部分分离菌株PCR鉴定结果Fig.3 Some isolates were identified by PCR2.3耐药性分析采用K-B药敏纸片法检测65株猪胸膜肺炎放线菌的耐药性。由表1可知，临床中分离的65株猪胸膜肺炎放线菌对磺胺间甲氧嘧啶、庆大霉素、新霉素、大观霉素、链霉素、阿莫西林、青霉素、红霉素、土霉素、氟苯尼考等10种药物的耐药率在50.8%100%，对其他8种药物的耐药率在6.2%33.8%。表1耐药性检测结果Tab.1 Drug resistance test results药物头孢噻呋头孢噻肟青霉素阿莫西林新霉素庆大霉素氟苯尼考链霉素红霉素耐药菌数株6457596565336338耐药率%9.26.287.790.8100.0100.050.896.958.46药物多西环素土霉素磺胺间甲氧嘧啶替米考星恩诺沙星环丙沙星大观霉素林可霉素多粘菌素耐药菌数株223565191211641518耐药率%33.853.8100.029.218.516.998.523.127.73讨论与结论国内外研究表明，猪胸膜肺炎放线菌病是猪养殖中主要的细菌性呼吸道传染病之一，猪胸膜肺炎放线菌主要包含19种致病血清型，如猪胸膜肺炎放线菌1型-19型，猪胸膜肺炎放线菌不同血清型的流行性具有区域性，各个血清型的分离菌株具有不同的致病性，各个血清型的分离菌株之间无交叉免疫反应，目前没有有效的猪胸膜肺炎放线菌病疫苗进行预防，这也是导致猪胸膜肺炎放线菌在不同养殖场中广泛流行的因素之一9。猪胸膜肺炎放线菌在我国不同地区的养猪场中广泛分布与流行，应该引起注意，做好防控措施。本研究从采集的疑似患猪胸膜肺炎放线菌感染不同阶段猪病料样品组织170份中分离到65株猪胸膜肺炎放线菌，说明猪胸膜肺炎放线菌引起某地区规模化养殖场及散养户中不同阶段猪的呼吸道疾病的主要病原菌。因此，规模化养殖场及散养户应该注意猪胸膜肺炎放线菌病的综合防控。临床防治猪胸膜肺炎放线菌病过程中，不合理使用抗菌药物现象较多，导致耐药性产生，给治疗带来一定的困难10，11。采用K-B药敏纸片法检测65株猪胸膜肺炎放线菌的耐药性，结果显（下转第148页）动物科学农业技术与装备第5期（总第401期）1457.2防控对策7.2.1加强疫苗免疫接种选择农业农村部批准的疫苗产品，一般是动物卫生组织统一组织、统一分配的。新生畜禽在出生3045 d需进行免疫接种，母猪在配种前应进行免疫接种，接种计量仔猪一般为1 mL/头、母猪2 mL/头。专家认为，口蹄疫需要进行二次强化免疫来产生有效的IgG抗体，可增强抗体的持续时间和抗体对抗原的亲和力。建议仔猪在30日龄首次免疫后间隔1个月加强免疫1次，第1次免疫合格率仅在到25%35%，第2次免疫合格率达85%90%。7.2.2强化疫病流行时的管控力度当发现疑似口蹄疫时，应主动积极报告当地动物疫病预防控制中心，并立即开展相关流行病学调查及处置。如情况属实，县级政府应立即启动重大动物疫情应急预案，划定疫点、疫区并封锁疫区，严格按 口蹄疫防控技术规范 开展防控工作。规模场、养殖户、贩运户应当积极配合农业农村部门进行及时扑杀和无害化处理等疫病防控措施。7.2.3加强综合防控意识当疫情发生时要做好封锁、隔离、消毒及扑杀工作，待休养期过后才能引入新的畜禽养殖，引种要经过相关监管单位批准，并隔离观察一定时间后方可与其他家畜一起饲养。一旦在引种过程中发现疫情，要在第一时间报告疫病防控相关部门进行处置。在日常养殖生产过程中，要重视家畜的饲养管理、注意环境卫生、控制环境温度、合理营养配比、提高机体免疫力。严格遵循饲养场规章制度，严禁饲养员串舍，减少与外界的接触，休假回来后要做好隔离措施。从场外调入的畜禽要按照要求进行落地隔离观察，一般时间为半个月以上，种用畜禽必须超过1个月，确认无问题后方可并群。加强对生猪贩运户的监管，禁止私下贩卖、运输未经检疫的动物及动物产品，限制动物流动，强化产地检疫工作。建立健全疫情防控预案机制，不定期对养殖户进行抽样排查，了解调查辖区畜禽养殖免疫情况。参考文献1丁岩岩.关于规模化养殖肉牛的疫病防控与措施的调研J.农家参谋,2018(21):117.2李晓丽,陈国亮,吉鸿超,等.三种 LB-ELISA 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