越橘离体茎尖包埋玻璃化超低温保存_毛宇金.pdf

吉林农业大学学报 2023，45（2）：155-162http:/Email:jlndxb Journal of Jilin Agricultural University越橘离体茎尖包埋玻璃化超低温保存*毛宇金，李娴，张志东*，苏原慧，梁杉，孙海悦，李亚东吉林农业大学园艺学院，吉林省小浆果遗传育种与创新利用工程中心，长春 130118摘 要：为越橘种质资源保存提供新途径，试验研究了越橘组培苗茎尖包埋玻璃化法超低温保存方法。结果显示适宜的条件包括：剥取顶芽茎尖（长1.01.5 mm），在（252）黑暗条件下预培养1 d；使用移液枪吸取茎尖与藻酸盐溶液，滴入氯化钙溶液中形成包埋球（直径4 mm）；包埋球在加载液中加载1.5 h（室温）；包埋球转入PVS2溶液处理4 h（0）；将装有包埋球的冷冻管投入液氮保存1 h；取出液氮中的冷冻管迅速转入37 水浴锅中解冻12 min，在室温下取出包埋球，在卸载液中卸载20 min；卸载的茎尖在再生培养基上（252）黑暗培养5 d；之后在正常光照条件下培养30 d。所测试的8个越橘基因型平均再生率为57.9%，最高再生率为78.5%，最低为41.7%。关键词：越橘；超低温保存；小滴玻璃化；组培苗茎尖中图分类号：S663.9 文献标志码：A 文章编号：1000-5684（2023）02-0155-08DOI：10.13327/j.jjlau.2020.5541引用格式：毛宇金，李娴，张志东，等.越橘离体茎尖包埋玻璃化超低温保存 J.吉林农业大学学报，2023，45（2）：155-162.Cryopreservation of Shoot Tips of Blueberry(Vaccinium)in vitro by Encapsulation-Vitrification*MAO Yujin，LI Xian，ZHANG Zhidong*，SU Yuanhui，LIANG Shan，SUN Haiyue，LI YadongCollege of Horticulture，Jilin Agricultural University，Jilin Provincial Engineering Center of Genetic Breeding and Innovative Utilization of Small Fruits，Changchun 130118，ChinaAbstract：In this study,shoots of blueberry in viro were used as materials to study the cryopreservation of its shoot tips by encapsulation-vitrification,which provided a new way for the preservation of Vaccinium germplasm resources.The results showed that the suitable conditions are as follows:The shoot tips(1.0-1.5 mm length)excised from shoots were pre-cultured for 1d at(252)in the dark.The shoot tips and alginate solution were absorbed with a pipette.The alginate pellets(4 mm dia-meter)were formed by dripping into the calcium chloride solution.The pellets were treated in the loading solution for 1.5h at room temperature.Then the pellets were treated with PVS2 solution at 0 for 4 h.The cryotubes containing alginate pellets were put into liquid nitrogen and stored for 1h.The cryotube was removed from liquid nitrogen and transferred quickly to the 37 water bath to defrost for 1 to 2 min.Alginate pellets were removed from the freezing tube at room temperature and then placed in the unloading solution for 20 min.The unloaded shoot tips were cultured in dark on regeneration medium(252)for 5 d.They were then cultured under normal light for 30 d.The aver*基金项目：吉林省科技发展计划项目(20170414023GH,20180201076NY)作者简介：毛宇金，女，硕士研究生，研究方向：生物技术与果树育种。收稿日期：2019-12-19*通信作者：张志东，E-mail：吉林农业大学学报 2023 年 4 月Journal of Jilin Agricultural University 2023，Aprilage regeneration rate of 8 genotypes tested was 57.9%,and the highest regeneration rate was 78.5%while the lowest was 41.7%.Key words：Vaccinium；cryopreservation；encapsulation-vitrification；shoot tip in vitro越橘属于杜鹃花科（Ericaeae）越橘属（Vaccinium）植物，它作为一种健康食品已得到国际社会的普遍认可，在全球很多国家得到了快速发展1。近 20年来中国越橘商业种植开始快速发展，到 2015 年总种植面积达到 31 210 hm2，产量43 244 t，已成为全球重要的产区之一2。越橘种质资源丰富，全世界约 450 种，我国已知 91 种24 个亚种和变种3。越橘种质资源的保存多采用种植保存和试管苗离体保存。田间保存法有占地大、费较高、易受病虫害等缺点4。很多越橘种质资源均可通过组培技术保存4-5，组培工厂化生产育苗也已得到广泛应用，且后代组培苗保持遗传的相对稳定性6-7。试管苗保存需经常继代次，也存在易污染以及发生遗传特性变异的风险等8-9。所以，近年来学者一直在寻求一种能长期、安全和有效保存越橘种质资源的方法。超低温保存（Cryopreservation）是 20 世纪 70 年代开始建立的一种生物保存技术，即在-196 环境条件下保存种质资源时，细胞、组织和器官不会引起遗传性改变，从而可达到长期保存种质的目的10。超低温保存处理步骤相对简便和再生率高等优点，已成为了种质保存研究的理想方案11。随着超低温保存方法的不断改进，发展出了玻璃化法（Vitrification）12和包埋脱水法（Encapsulation-dehydration）13。玻璃化法具有设备与材料处理简单、效果和重演性好等优点14-16。但因高浓度玻璃化保护剂（PVS）对保存的材料毒害极大17-18，并需要严格控制脱水过程和冰冻保护剂的渗透性，所以该方法很难同时处理大量材料。包埋脱水法避免了冷冻保护剂对材料的毒害，可一次处理较多材料，但植物组织恢复生长慢，脱水所需时间长，而且一些植物的存活率和再生率低13。为克服上面2种方法的缺点，包埋玻璃化法（Encapsulation-vitrification）19应运而生，该方法兼容了包埋脱水法与玻璃化法的优点，具有方法易掌握、材料恢复生长快等优势。运用包埋玻璃化法已成功开展了多种植物的超低温保存研究，如甜柿（Diospyros kaki Thunb.）20茎尖最高成活率接近100%，比玻璃化法21-22成活率更高；树莓（Rubus idaeus L.）茎尖包埋玻璃化法的成活率23比玻璃化法24高 10%，且多数成活茎尖100%形成新植株。前人对越橘属植物的超低温保存研究应用的方法包括程序控温法（Controlled rate cooling）25、玻璃化法26、包埋脱水法26和小滴玻璃化法（Droplet-vitrification）27。每种方法都存在一定的不足，如程序控温法与玻璃化法的成活率较低，而小滴玻璃化法不便同时处理大量材料。目前，采用包埋玻璃化方法超低温保存越橘资源尚缺少相关研究报道。本试验研究了生产主栽的5个种群的8份蓝果越橘种质资源的包埋玻璃化超低温保存效果及相关参数，以期为长期有效地保存越橘种质资源提供一种新方法。1材料与方法1.1试验材料本试验在吉林农业大学园艺学院吉林省小浆果遗传育种与创新利用工程中心完成。采用的越橘品种材料包括：北高丛越橘（Vaccinium corymbosum L.，Norhen highbush blueberry）品种“蓝丰”（Bluecrop）、“都克”（Duke）；南高丛越橘（V.australe L.，Sorthen highbush blueberry）品种“密斯梯”（Misty）、“奥尼尔”（ONeal）；兔眼越橘（V.ashei Reade，Rabbiteye blueberry）品种“灿烂”（Brightwell）；半高丛越橘（Half highbush blueberry）品种“北陆”（Northland）、“蓝金”（Bluegold）；矮丛越橘（V.angustifolium Aiton，Lowbush blueberry）品 种“美登”（Blomidon），共 8个品种的组培苗。组培苗每30 d继代培养（培养基SCM）1次。培养室内正常培养条件：温度（25 2），光量子通量密度50 mol/（s m2）的白色荧光灯光照，光照时长16 h/d。木 本 植 物 培 养 基（WPM，Phyto Technology Laboratories），玉米素（ZT，Chembase，纯度99%），海藻酸钠（上海瑞永生物科技有限公司，纯度98%），琼脂（凝胶强度1 400 g/cm2），蔗糖 国药集团化学试剂有限公司，沪试（AR甜菜），甘油156毛宇金，等：越橘离体茎尖包埋玻璃化超低温保存吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University国药集团化学试剂有限公司，沪试（AR），纯度99%，乙二醇 国药集团化学试剂有限公司，沪试（AR），纯度99.5%，二甲基亚砜 DMSO，国药集团化学试剂有限公司，沪试（AR），纯度99%。培养基及溶液配方。继代培养基（SCM）：WPM+0.3 mg/L 玉米素+7 g/L 琼脂+30 g/L 蔗糖；预培养基（PCM）：WPM+7 g/L琼脂+0.3 mol/L蔗糖；海藻酸钠溶液：WPM+2%海藻酸钠+2.0 mol/L 甘油+0.4 mol/L 蔗糖；氯化钙溶液：WPM+0.1 mol/L CaCl2+2.0 mol/L 甘 油+0.4 mol/L蔗糖；加载液：WPM+2.0 mol/L甘油+1.0 mol/L 蔗 糖；植 物 玻 璃 化 保 护 溶 液（PVS220）：WPM+30甘油+15乙二醇+15 DMSO+0.4 mol/L蔗糖；卸载液：WPM+1.2 mol/L蔗糖。上述培养基和溶液均调整pH至5.8，在121 高压灭菌锅中灭菌20 min，备用。1.2试验设计与方法1.2.1越橘茎尖包埋玻璃化超低温保存方法操作流程试验中除了处理和特殊说明外，均按如下方法和参数进行操作，即经过茎尖剥离与预培养、包埋、加载、玻璃化处理、超低温保存、解冻、卸载和再生培养8个阶段19。经过预试验研究确定的具体过程和方法如下：从30 d苗龄的组培苗上剪取长约0.5 cm带顶芽的茎段（图1-A），在体视显微镜（目镜WF10X，物镜0.74.5X）下快速剥取出长1.01.5 mm、带45片叶原基的茎尖（图1-B），在培养基 PCM 上预培养 1 d，（252），黑暗（图1-C）；用移液枪（枪头口径约1.5 mm）吸取茎尖和海藻酸钠溶液后，滴入氯化钙溶液中，在室温下静置30 min形成直径约4 mm包埋球，每个球包含1个茎尖（图1-D，E）；将包埋球移入加载液中并放入摇床，以 70 r/min转速处理 1.5 h（室温）；取出包埋球，在0 （冰水浴）条件下放入PVS2 溶液中，并放入摇床以 70 r/min 转速处理4 h；将处理后的包埋球装入2 mL冷冻管中，并添加1.5 mL新的PVS2后将盖子旋紧，投入液氮中超低温保存1 h；取出冷冻管迅速转入37 水浴锅中进行解冻12 min；解冻后将冷冻管中包埋球取出，放入卸载液中卸载20 min（室温），卸载后将茎尖从包埋球中剥离出来；将茎尖的形态学下端朝下接入SCM（玻璃培养皿直径90 mm），暗培养5 d （252）后转至培养室内正常培养条件下再生培养。1.2.2预培养基的蔗糖浓度将剥取的长1.52.0 mm茎尖培养在不同浓度蔗糖的预培养基上，蔗糖浓度设5个水平：0，0.3，0.6，0.9，1.2 mol/L，黑暗培养1 d，（252）。其他操作同本文“1.2.1”。1.2.3预培养处理时间将剥取的茎尖培养在培养基 PCM 上黑暗培养 （252）不同时间，时间设 6 水平：0，1，2，3，4，5 d。其他同本文“1.2.1”。1.2.4加载处理时间将制成的含有茎尖的包埋球移入装载液中处理（室温）不同时间，处理时间设5个水平：0，0.5，1.0，1.5，2.0 h。其他操作同本文“1.2.1”。1.2.5玻璃化保护液处理时间将加载后的包埋球用 PVS2 处理（0）不同时间，处理时间设9 个水平：0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5 h。其他操作同本文“1.2.1”。1.2.6卸载液处理时间将从液氮中取出的冻A.带顶芽茎段（长约 0.5 cm）；B.剥取出的茎尖（长 11.5 mm）；C.预培养基上的茎尖；D，E.带茎尖的硅藻酸钠包埋球；F.再生培养7 d的成活茎尖；G.再生培养7 d死亡茎尖；H.再生培养30 d后的再生新梢图1包埋玻璃化法超低温保存越橘“密斯梯”茎尖及其再生苗Fig.1Shoot regeneration from cryopreserved shoot tips of blueberry“Misty”by encapsulation-vitrification157吉林农业大学学报 2023 年 4 月Journal of Jilin Agricultural University 2023，April存管在37 水浴12 min迅速解冻后，将包埋球转入卸载溶液中处理不同时间（室温），处理时间设5个水平：10，15，20，25，30 min。其他操作同本文“1.2.1”。1.2.7不同品种的超低温保存按本文“1.2.1”流程要求操作，对8个越橘品种“蓝丰”“都克”“灿烂”“密斯梯”“奥尼尔”“北陆”“蓝金”“美登”做液氮超低温保存，验证本试验技术与参数的广谱性。在上述各试验中，每个超低温冷冻处理（用+LN表示），均设置平行对照处理（用-LN表示），即除了不用液氮冷冻保存外，其他操作均按本文“1.2.1”流程要求执行。试验中每个处理接种 10 个茎尖于培养皿，重复 3 次。1.2.8调查指标与数据处理各试验处理的茎尖在SCM上培养第 7天 时，调查茎尖成活率，培养第30天时调查茎尖再生率。经过超低温处理后存活的茎尖总体上呈鲜绿色（图1-F），死亡的茎尖总体上呈褐色或部分组织略带绿色（图1-G），再生后的新梢长出新的幼叶或节间伸长（图1-H）。茎尖成活率及再生率计算公式：茎尖成活率（%）=（绿色的茎尖数/接种茎尖总数）100；茎尖再生率（%）=（长出新梢的茎尖数/接种茎尖总数）100。用SPSS 19.0软件对数据进行方差分析，用邓肯新复极差法进行差异显著性检测。2结果与分析2.1预培养蔗糖浓度对越橘茎尖成活率和再生率的影响剥离的越橘组培苗茎尖接种在含有不同蔗糖浓度的预培养基上处理，包埋的茎尖经超低温保存（+LN）后培养7 d的成活率和30 d的再生率在各处理间存在显著差异（图2），其中0.3 mol/L处理的成活率与再生率最高，分别为 79.9和78.5，均显著高于其他4个处理。随着蔗糖处理浓度从0.3 mol/L增加到1.2 mol/L，茎尖成活率与再生率均呈降低趋势，1.2 mol/L处理的再生率只有10%。在试验中，平行对照（-LN）的茎尖成活率与再生率普遍高于超低温保存处理（+LN），各处理间也存在显著性差异。随着浓度逐渐增加（0.31.2 mol/L），2项指标均呈现降低趋势，但降低幅度小于超低温保存处理，其中 0.3 mol/L 的-LN处理茎尖成活率与再生率均达到100%。这说明，第一，预培养基中蔗糖浓度过高会使细胞产生渗透胁迫，失水过多，导致茎尖再生率降低；第二，虽然不添加蔗糖处理也可以有一部分茎尖再生，再生率为30%，但适当浓度的蔗糖（0.3 mol/L）可以让茎尖组织适度脱水，提高抗冻能力，更好地适应包埋玻璃化超低温保存，保持较高的再生率。数据表示平均值标准差，不同字母表示用邓肯新复极差法在P0.05 的显著性差异。下图同图2预培养蔗糖浓度对越橘“密斯梯”茎尖成活率和再生率的影响Fig.2Effects of sucrose concentration in preculture on survival rate and regeneration rate of shoot tips of blueberry“Misty”158毛宇金，等：越橘离体茎尖包埋玻璃化超低温保存吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University2.2预培养时间对越橘茎尖成活率和再生率的影响茎尖在PCM培养基上预培养05 d的结果见图 3。从+LN 处理的结果看，不进行预培养的再生率为21.7%，培养1 d的成活率与再生率均显著高于其他5个处理，之后随着预培养时间延长，成活率与再生率均逐渐降低。-LN 处理中预培养4 d和5 d的成活率和再生率显著下降。由此可以看出，尽管蔗糖浓度合适，但预培养时间过长也会使细胞过度脱水，从而导致部分越橘茎尖死亡。2.3加载时间对越橘茎尖成活率和再生率的影响由预培养基经包埋球到加载液（LS）处理过程，蔗糖浓度从0.3 mol/L逐渐增加至1.0 mol/L，可进一步提高植物细胞的耐渗透性，但加载时间也会影响+LN 保存效果。试验结果显示，经过预培养和包埋后的越橘茎尖在加载液中处理 02.0 h，+LN 处理的成活率与再生率均随加载液处理时间的延长呈现出先升高再降低的趋势，-LN 处理则变化不大，其中加载 1.5 h 的+LN 处 理 成 活 率 与 再 生 率 显 著 高 于 其 他 处理（图4）。2.4PVS2处理时间对越橘茎尖成活率和再生率的影响PVS2对超低温处理的植物材料起保护作用，茎尖包埋球在PVS2中的处理时间对茎尖的再生影响较大。试验中PVS2设置的9个不同时间处理结果见图5。处理时间从0.5 h增加至4 h，+LN处理的成活率与再生率均呈上升趋势，0.5 h处理的再生率仅有2.7%，4.0 h处理的再生率最高，为78.5，且显著高于其他 8个处理。时间延长至4.5 h 时，成活率和再生率分别下降至 60.5%和 52.5%。PVS2不同时间处理的平行对照-LN茎尖的成活率与再生率均无显著差异（图5）。图3预培养时间对越橘“密斯梯”茎尖成活率和再生率的影响Fig.3Effects of preculture time on survival rate and regeneration rate of shoot tips of blueberry“Misty”图4加载处理时间对越橘“密斯梯”茎尖成活率和再生率的影响Fig.4Effects of loading treatment time on survival rate and regeneration rate of shoot tips of blueberry“Misty”159吉林农业大学学报 2023 年 4 月Journal of Jilin Agricultural University 2023，April2.5卸载液处理时间对越橘茎尖成活率和再生率的影响从+LN处理后的包埋球内剥离出越橘茎尖进入卸载液，卸载液处理时间长短显著影响茎尖的成活率和再生率，卸载10 min或30 min的成活率和再生率均较低，卸载15 min或25 min的成活率和再生率相对较高，卸载20 min时效果最好，显著高于其他4个处理。各不同处理间-LN的成活率与再生率均无显著差异（图6）。2.6越橘不同基因型茎尖的超低温保存效果采用优化后的参数对北高丛、南高丛、半高丛、矮丛和兔眼越橘的8份种质资源进行广谱性验证，结果显示，经超低温处理后的茎尖成活率与再生率在不同品种之间表现出显著性差异（表1）。“密斯梯”再生率最高，为78.5%，显著高于其他品种。“蓝丰”和“蓝金”再生率次之，分别为70.0和68.3，两者之间无显著差异，但显著高于剩余的其他 5个品种。“都克”“奥尼尔”和“美登”再生率较低，且3个品种间没有显著性差异。“灿烂”的再生率最低，为41.7%。8个品种间的成活率差异性与再生率的表现一致。总体上看，平均再生率为57.9%，75%的试验品种再生率达到或超过了50，说明该方法可用于越橘种质资源保存。图5PVS2处理时间对越橘“密斯梯”茎尖成活率和再生率的影响Fig.5Effects of time duration of exposure to PVS2 on survival rate and regeneration rate of shoot tips of blueberry“Misty”图6卸载时间对越橘“密斯梯”茎尖成活率和再生率的影响Fig.6Effects of time duration of unloading treatment on survival rate and regeneration rate of shoot tips of blueberry“Misty”160毛宇金，等：越橘离体茎尖包埋玻璃化超低温保存吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University3讨论Reed25用程序控温法保存4个越橘属植物组培苗，得到658的再生率。Uchendu 等26采用包埋脱水法、玻璃化法和程序控温法冷冻保存越橘茎尖，其中包埋脱水法获得“Berkeley”“Brigitta Blue”和“ONeal”的再生率分别为92、87和67；而玻璃化法的再生率为33%87%，其中“ONeal”再生率最低。Dhungana 等28用改良包埋脱水法冷冻保存越橘茎尖时，兔眼品种“Tifblue”“Festival”和“Climax”再生率分别为 93.6%、96.9%和 68.8%，南高丛“Magnolia”“Sharpblue”和“Brigitta”再生率分别为 68.5%、77.5%和 90.2%，北 高 丛“Weymouth”再 生 率 为 46.7%，半 高 丛“Bluegold”再生率为 100.0%。Wang 等27用小滴玻璃化法保存越橘茎尖获得了65.5%总再生率，其中南高丛“Misty”和“ONeal”再生率分别为 91.7%和 46.7%，北高丛“Duke”再生率为 58.9%，半高丛“Northland”和“Bluegold”再生率分别为70%和65.6%。本试验用包埋玻璃化法冷冻保存后，其中“ONeal”再生率相对较低，“Misty”相对较高的结果与其他学者的研究类似26-27，这反映了越橘基因型之间的差异性，因此，针对“ONeal”等再生率低的品种超低温保存尚有待深入研究。本试验的总再生率略低于小滴玻璃化冷冻保存效果27，这可能是由于没有采用低温炼苗过程所致。本研究采用了茎尖包埋玻璃化冷冻法保存5 个种群的 8个蓝果越橘基因型，获得58%的总再生率，该方法具有广谱性，可以作为长期保存越橘种质资源的一种有效技术。用含有较高浓度的蔗糖培养基预培养数天，让植物材料脱去部分水分，提高茎尖胞质浓度以增加抗冻能力，从而使超低温保存后的材料再生率升高11。但预培养浓度过高或时间过长会造成细胞过度脱水，从而导致再生率降低23。本研究中，包埋玻璃化法冷冻保存越橘茎尖的预培养蔗糖浓度与预培养时间的结果也验证了上述观点。包埋玻璃化法冷冻保存草莓（Fragaria ananassa Duch.）茎 尖29化 冻 后 卸 载 液 处 理10 min；保存李（Prunus salicind L.）茎尖30与青岛百合（Lilium spp）属31卸载分为2次，每次10 min；保存红芽芋（Colocasia esculenta var.）茎尖32卸载分为 3 次，每次 10 min；保存木薯（Manihot esculenta Crantz.）茎尖33卸载1次20 min，它们在PVS2和卸载液中采用的蔗糖浓度均分别为 0.4 mol/L和 1.2 mol/L，本试验中越橘茎尖处理时 PVS2 和卸载液中采用了与上面相同的蔗糖浓度，卸载1 次20 min的恢复生长效果最好，这说明卸载时间与卸载次数与植物种类关系更为密切。同时，也发现多数研究27，29-34中卸载液的蔗糖浓度高于PVS2中蔗糖浓度是一个有效的方法，本试验中越橘茎尖如此。但也有例外，如高山红景天（Rhodiola sachalinensis A Bor）茎尖35采用PVS2和卸载液中蔗糖浓度均为1 mol/L。在剥离茎尖前经过低温炼苗可增强材料耐低温能力，提高超低温保存后茎尖的再生率25-27。Wang等27采用小滴玻璃化法冷冻保存“Misty”经过4 黑暗下培养1周的再生率最高，而未经低温炼苗的茎尖没有获得再生植株。本试验用包埋玻璃化法冷冻保存的“Misty”组培苗虽然没有经过低温炼苗，但获得了78.5%的再生率，其原因有待进一步研究。综上，茎尖包埋玻璃化法超低温保存技术，操作方便，能同时处理大量材料，茎尖再生率较高，广谱性好，可作为长期保存越橘种质资源的一种有效方法。参考文献：1 李亚东，郭修武，张冰冰.浆果栽培学 M.北京：中国农业出版社，2012：125-196.表1越橘不同基因型对茎尖成活率和再生率的影响Table 1Effects of blueberry genotypes on survival rate and regeneration rate of shoot tips of blueberry%品种密斯梯蓝丰蓝金都克奥尼尔美登北陆灿烂平均值成活率79.91.9a73.32.9b70.05.0b60.05.0c53.32.9cd51.72.9cd48.35.8de41.72.9e59.8再生率78.51.8a70.0 0b68.37.6b56.72.9c51.72.9cd50.00cd46.72.9de41.72.9e57.9注：数据表示平均值标准差，不同字母表示用邓肯新复极差法在P0.05 的显著性差异161吉林农业大学学报 2023 年 4 月Journal of Jilin Agricultural University 2023，April2 李亚东，孙海悦，陈丽.我国蓝莓产业发展报告 J.中国果树，2016（5）：1-10.3 顾姻，贺善安.蓝浆果与蔓越桔 M.北京：中国农业出版社，2001：16.4 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