巴多昔芬治疗小鼠胶原诱导性关节炎的疗效及对滑膜成纤维细胞的影响.pdf

基金项目:国家自然科学基金(.)作者简介:张莹女博士主治医师研究方向:风湿免疫病发病机制与治疗策略:.通信作者:田吉来男博士讲师研究方向:生物医药纳米技术:.巴多昔芬治疗小鼠胶原诱导性关节炎的疗效及对滑膜成纤维细胞的影响张莹代春燕田静田吉来(.南京大学医学院附属鼓楼医院风湿免疫科江苏 南京.夏津县人民医院内分泌肾病科山东 德州.南京中医药大学医学院 整合医学学院生物化学与分子生物学系江苏 南京)摘要:目的 探究巴多昔芬()对小鼠胶原诱导性关节炎的治疗作用和对 滑膜成纤维细胞增殖、侵袭和迁移的影响 方法 采用牛型胶原诱导()/小鼠类风湿性关节炎模型通过关节炎评分、测量后足厚度等方法评价 对小鼠关节炎的治疗作用采用苏木精伊红和番固红绿染色检测小鼠关节病理变化采用 进一步验证 对关节骨破坏的影响 采用 法、平板克隆实验、细胞划痕实验和 小室的方法考察 对 细胞的存活、增殖、迁移和侵袭的影响 结果 能显著地降低关节炎评分减轻后足肿胀病理切片显示 能显著减少滑膜炎、血管翳、软骨侵袭和骨质破坏 与 抑制剂 均可有效抑制 细胞的增殖降低 细胞迁移和侵袭能力 结论 对小鼠胶原诱导性关节炎有较好治疗作用其作用可能与抑制滑膜成纤维细胞增殖、侵袭和迁移有关关键词:巴多昔芬白细胞介素/糖蛋白 类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞中图分类号:文献标志码:文章编号:():./.()(.):()().().:/药学研究 .类风湿关节炎()是一种主要累及外周关节的自身免疫性疾病早期主要表现为关节晨僵疼痛若疾病不能有效控制最终导致关节畸形、关节毁损甚至致残 尽管目前 治疗方面取得很大进展但仍有部分患者未能达到临床缓解 的主要病变在关节表现为滑膜炎、滑膜增生、血管翳形成、软骨和骨破坏 滑膜成纤维细胞()是关节滑膜衬里层的重要细胞成分 患者 获得过度增殖、迁移和侵袭表型是滑膜炎和血管翳形成的主要原因是介导炎症和骨破坏的“罪魁祸首”目前临床上针对 的治疗方法有限 主动参与 关节局部的免疫炎症是分泌白细胞介素()的主要细胞 与其特异性受体()结合进而招募糖蛋白()三者形成有活性的/三元六聚体复合物激活下游通路如信号转导 和 转 录 激 活 因 子 ()的高度磷酸化促进细胞增殖和侵袭 针对 单抗或受体融合蛋白已成为临床治疗 的重要药物选择性雌激素受体调节剂()巴 多 昔 芬()被再定义为/抑制剂已被广泛认可:其吲哚部分和七元氮杂环拟似 的 和 基团可有效结合 的 区域(见图)从而发挥拮抗 的作用 本文拟采用小鼠胶原诱导性关节炎()模型评估 对 小鼠的治疗作用细胞水平评估 对滑膜成纤维细胞 增殖、侵袭迁移的影响探讨 靶向 是否有可能成为治疗 的新药 左为 的化学结构式右为吲哚部分和七元氮杂环分别模拟 的 和 和 的 区域进行有效结合图 被再定义为/抑制剂 材料与方法.实验动物和细胞/小鼠(雄性 周)购自中国上海 实验室动物有限公司动物使用许可证号:(苏)并在南京鼓楼医院实验动物中心的无特定病原体()条件下饲养饲养环境室温度 湿度 水食自由 交替光照 所有动物实验均在南京鼓楼医院动物研究伦理委员会批准的规程下进行(批准编号:)细胞接种于含有 胎牛血清和 双抗的 培养基中置于含 的 培养箱中培养.药物试剂与仪器免疫用牛型胶原()、完全弗氏佐剂()和不完全弗氏佐剂()均购于美国 公司购于江苏正济药业股份有限公司泊洛沙姆()购于巴斯夫(中国)有限公司 购于上海源叶生物科技有限公司盐酸雷洛昔芬()购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司基质胶()购于美国 公司 小室(孔径)酶标仪()小动物活体 影 像 系 统()倒置显微镜().实验方法.小鼠模型的建立 小鼠随机分为正常对照组、胶原诱导组 取 浓度为 的 醋酸溶液与等体积的浓度为 的 置于冰上充分混合得到 乳化液 在胶原诱导组的小鼠尾根部进行皮内缓慢注射所得的 乳化液注意避开血管每只(含 )进行初次免疫并设定为第 天 第 天在小鼠尾根部 处采用多点法再次注射 /只同法新鲜配制的等体积 醋酸溶液和 的混合乳化液进行增强免疫 自造模第 天开始每 (每周 次)对免疫小鼠基于关节炎指数()评分表(见表)进行四肢关节评分四肢关节肿胀计分相加为关节炎的总评分 评分最高分为 评分 为模型成功.动物分组给药将胶原诱导组的小鼠随机分 为 两 组 即 模 型 对 照 组(组)和 治疗组(组)并在初次免疫的第 天开始给药至第 天每周 次周日停药 动药学研究 .物实验的实施方案如图 所示 给药剂量与方法如下:正常组:生理盐水.()灌胃 组:的 水溶液灌胃 组:药物 ()灌胃 其中药物的配制方法如下:取浓度为 溶解于 的 溶液 加入 浓度为 的 水溶液中涡旋混匀即得 浓度为 的药物溶液表 小鼠 评分发病情况得分无关节发红、肿胀关节红肿轻度肿胀(限于跗骨或踝关节)关节红肿轻度肿胀(肿胀范围从跗骨延续到踝关节)关节红肿中度肿胀(从跖骨延续到踝关节)关节红肿重度肿胀(从脚趾延续到整个踝关节甚至出现关节强直活动障碍).动物关节肿胀观察与病理学评价增强免疫后每 天使用游标卡尺测量小鼠后肢足厚度以此作为其关节肿胀的指标 采用苏木精伊红染色()观察踝关节病理改变番红固绿染色()观察软骨破坏并从滑膜细胞增生、细胞浸润、关节软骨及骨质破坏进行病理学评分 采用 对小鼠踝关节进行扫描成像观察踝关节的损伤情况.法检测 对 细胞存活率的影响取 细胞并调整细胞密度为 每孔 接种于 孔板贴壁生长过夜后将原有培养基更换为含有不同药物浓度的培养基继续培养 之后每孔加入 试剂置于 含 培养箱孵育 使用酶标仪在 处检测光密度值并计算细胞存活抑制率 实验独立重复 次.平板克隆法检测 对 细胞增殖的影响 细胞接种于 孔板中过夜使其贴壁并使细胞融合度达到 第 天每孔更换为 含药培养基 后消化各孔细胞并用无药的完全培养基收集和重悬然后以每皿 个细胞的密度接种于 的平板培养皿中、培养约 弃去培养基 洗涤用冷甲醇固定.结晶紫染色 用水清洗后扫描所得平板培养皿 实验独立重复 次.细胞划痕法检测 对 细胞迁移的影响 细胞以每孔 细胞密度接种于 孔板中并加入 /孔的含血清培养基至细胞长满后更换无血清培养基使其饥饿过夜 采用无菌枪头进行划痕用 清洗 遍后给予含不同浓度 的无血清培养基使用倒置显微镜记录划痕处细胞迁移的情况 实验独立重复 次.实验检测 对 细胞侵袭的影响 细胞接种于 孔板当细胞融合度达 时加入含有不同 浓度的完全培养基继续培养 之后弃去培养基并用 洗 遍用胰酶消化细胞并以无血清培养基重悬使其密度为 各组细胞取 加入 小室的上层(含基质胶)下层则加入 的含胎牛血清的培养基 其中上层小室基质胶需预先配制具体方法是:基质胶和无血清培养基按体积比 在冰上进行稀释每孔 加入小室的上层 孵育 待基质胶凝固 细胞在 中培养 后取出小室固定染色在显微镜下拍照评价细胞侵袭的能力 实验独立重复 次.统计学分析采用 .软件所有数据以 表示采用 检验比较两组之间的差异 .表 示 差 异 具 有 统 计 学 意 义 采 用 软件绘图 结果.对 小鼠关节炎症和肿胀的影响正常组小鼠无关节发红和肿胀 组即 模型组的小鼠在两次免疫后出现关节肿胀、趾端发红、足趾增厚等状况严重者出现关节活动受限在病情后期部分小鼠踝关节出现强直样改变 与 组相比 治疗组 评分显著降低(见图.)后足厚度也较 组明显下降并在第 天出现显著性差异(.见图)各组小鼠后肢关节外观如图 所示(第 天)由于 模型的自限性小鼠后肢肿胀厚度在实验后期出现轻度消退(见图).减轻 小鼠关节炎 如图 所示正常小鼠踝关节未见炎性细胞浸润滑膜增厚、骨和软骨破坏 与模型对照组相比 治疗组能缓解小鼠踝关节的滑膜炎(见图)、血管翳(见图)、软骨侵蚀(见图)和骨破坏(见图)其各项评分均显著性低于 模型组(见图)以上表明 可减轻小鼠关节病理损伤 的结果显示与 模型组相比 治疗组后肢关节间隙狭窄和骨破坏明显改善(见图)上述结果药学研究 .表明 对 小鼠关节炎有治疗作用.对 细胞存活和增殖的作用结果如图 所示随 浓度的增加 的细胞存活率明显降低 是 的抑制剂该药对 的细胞存活率具有浓度依赖性的抑制作用(见图)和 对 细胞的 值分别是.、.说明靶向 可以抑制滑膜细胞存活 图 的平板克隆实验结果进一步证实 浓度依赖性抑制 细胞增殖在 组未见明显的 细胞增殖 和 均是 调节剂但 在抑制 方面较 弱 不能有效抑制 的增殖(见图).动物实验的免疫和药物干预的时间安排.小鼠在开始免疫后不同天数下的 评分().第 天小鼠后足外观的代表图.小鼠在开始免疫后不同天数下的后肢足厚度()(.)图 对 小鼠的关节炎症和肿胀影响.和 染色结果其中 为血管翳 为软骨侵蚀 为骨破坏 为滑膜炎.对各组小鼠进行病理评分其中 依次为骨质破坏、滑膜炎、血管翳、关节软骨的病理学评分.第 天小鼠后足 的代表图(检验.)图 小鼠踝关节的病理和 影像结果().对 细胞划痕愈合的作用如图 所示在 细胞划痕 后与未接受药物的细胞组相比 给药组划痕的愈合明显受到抑制其中 给药组最为明显划痕依然可见未给药组愈合修复接近 融合 组的划痕处部分出现了迁移的细胞 所有各组在 时的划痕一致(数据未列出)以上说明了 抑制细胞迁移的作用.对 细胞侵袭的作用如图 所示 给药的、均能明显减少细胞侵袭迁移到下室的数量 说明了 对 细胞侵袭和迁移的抑制作用 讨论 模型采用异源性 免疫动物诱导自身免疫性反应从而产生类似类风湿关节炎的关节红药学研究 .肿、滑膜增生、炎性细胞浸润、血管翳形成、关节及周围软骨坏损 模型是目前公认的 最佳模型 本研究以 周雄性 小鼠为研究对象说明 能有效降低 评分缓解小鼠后足肿胀减轻 病变证实 对 的治疗作用 在此基础上本研究以 为模型细胞发现 具有抑制 增殖、侵袭和迁移的作用进而从 干预 角度解释了 治疗 的具体机制.对 细胞存活的影响.对 细胞存活的影响.和 对 细胞的平板克隆实验结果图 的细胞存活与增殖图 划痕给药 后 细胞愈合图(各组 时未列出)图 细胞在接受 作用 后接种于 小室继续培养 之后细胞侵袭检测的各组代表 最初是作为 联合结合雌激素()以 组 织 选 择 性 雌 激 素 复 合 物()的形式被美国 批准用于绝经后女性骨质疏松症的治疗 在骨组织 能作为雌激素受体()的激动剂具有调节骨转换(药学研究 .)的作用 最近临床报道 能有效预防绝经后 患者糖皮质激素诱导的骨质疏松在动物实验水平采用去卵巢()的()小鼠模型可模拟女性绝经后的 症状 基于此因为雌二醇()的抗炎作用 学者们研究发现 联合 组()发挥对骨关节炎的治疗作用与单用 近似但 组更能有效降低骨髓中 水平、抑制破骨前体细胞()形成、减少血清中的抗胶原蛋白抗体()以同为第三代 的拉索昔芬()做对照发现 和 都能降低 小鼠关节炎的 评分抑制滑膜炎减少软骨及骨的侵蚀 和 在 模型中表现出抗关节炎和骨保护作用的双重作用强调了 在应用于绝经后女性 治疗的价值事实上 是多靶点药物 既充当 配体又是/的抑制剂干预 信号通路发挥抗炎作用 本研究发现 抑 制 剂 和 均能抑制滑膜细胞存活 有报道采用抗 单抗能抑制 患者破骨细胞的分化和形成说明了 作为 治疗靶点而充满前景 无论小鼠是否 都显示了对 小鼠关节炎的治疗作用但 对 小鼠关节炎症的抑制能力弱于 和 由于 病理炎症是由大量分子调控的我们建议合理采用联合用药的策略通过抑制多个靶点分子更好的阻止或逆转 进展参考文献:.():.():.():./.():.:.():.():.()():/.():./.():.():.():.():.():.():.()():.吴锦雯张莹田吉来./在类风湿性关节炎疾病中的作用:从机制到临床转化进展.药学研究():./.():.(收稿日期:)药学研究 .