传统抗蛇毒血清的改进及新型抗蛇毒抗体的展望.pdf

传统抗蛇毒血清的改进及新型抗蛇毒抗体的展望王磊杨廷潺范泉水(浙江健博生物科技股份有限公司浙江宁波)摘要 毒蛇咬伤病情急、危害大需及时治疗抗蛇毒血清是治疗毒蛇咬伤的唯一特效药 传统的抗蛇毒血清是从动物超免血浆中提取的单蛇毒特异性或多蛇毒特异性免疫球蛋白或免疫球蛋白片段其外源蛋白的本质属性在临床应用时可引起过敏性反应 新型人源化单克隆抗体技术提供了毒蛇咬伤治疗用人源化和高亲和力抗体的制造手段是抗蛇毒血清的发展趋势 本文探讨了传统抗蛇毒血清改进优化的方法以及新型抗蛇毒抗体开发现状及展望以期为提升抗蛇毒血清质量和升级换代提供参考关键词 抗蛇毒血清单克隆抗体单链可变区片段人源化抗体中图分类号 文献标识码 文章编号 ():./.(.).蛇毒是毒蛇从毒腺中分泌出来的一种液体一般贮存于毒腺的腺腔中当毒蛇咬物时在肌群收缩挤压下蛇毒经导管由毒牙注入猎物不仅使猎物中毒且在吞食后帮助消化是毒蛇用于捕食消化与防御敌害的一种生化武器 蛇毒的组成与含量存在较大的科属种间差异如眼镜蛇科蛇毒中含有的三指毒素()、的磷脂酶()而蝰科蛇毒含有 的金属蛋白酶()、的、的丝氨酸蛋白酶()同科不同属及同属不同种的蛇毒也存在明显的差异如眼镜蛇科不同属蛇毒三指毒素的含量不同环蛇属()约含、眼镜蛇属()约含、盾鼻蛇属()高达 而且同种毒蛇不同年龄、性别、季节和地理、猎物等在组分的相对含量上也会存在差异 抗蛇毒毒素是指从超免动物血浆中提取的 或其、()片段即抗蛇毒血清 抗蛇毒血清自 年第一次进行临床使用以来已有近 年的临床应用历史是 认可的治疗毒蛇咬伤中毒的唯一特效药但其特异性只适用于免疫对应蛇种以至于世界各国及不同地域均需研制适合本地区的抗蛇毒血清 根据 公布的资料显示目前全球有 家机构批准商业化生产 种抗蛇毒血清所有抗蛇毒血清均由马源或羊源血浆制备而来对人来说这种外源抗体或其片段本身存在一定的抗原性再加上工艺导致的非目的蛋白杂质使抗蛇毒血清治疗过程中可能引起速发型超敏反应(型变态反应)如过敏性休克、荨麻疹、低血压、哮喘、心跳过速等症状而且还可能引起迟发型过敏反应(型变态反应)如皮疹、寒战、发热和关节酸痛等症状 因此应尽可能采用新纯化手段以提高产品纯度及比活性等质量属性促进传统抗蛇毒血清的升级换代 另外抗蛇毒血清生产需经长期的动物免疫过程其周期长、投资成本高因此生产厂家积极性不高 在我国仅赛伦制药公司一家生产抗蛇毒血清且在 年前后因动物免疫问题出现抗眼镜蛇毒血清短缺导致一家停产全国断货的现象蛇 志 ()年第 卷第 期.近十几年来随着新型抗体治疗药物不断被科学证明安全有效大众及监管机构逐渐认可接受各种类型的抗体药物 据统计全球的商业公司进行了至少 次各种单克隆抗体()的系统性临床试验 种 药物(人源化抗体、人源、嵌合抗体、鼠源)已被美国食品药品监督管理局()批准商用其中 种为抗癌药物 这些抗体药的前瞻性尝试和应用促进了新一代抗蛇毒抗体的启迪和开发 本文对传统抗蛇毒血清提出了改进优化策略总结了新型抗蛇毒抗体的研究成果并作出前瞻性考量 传统抗蛇毒血清与改进优化策略 传统抗蛇毒血清是通过蛇毒(或脱毒蛇毒)免疫动物(马、绵羊、兔等)获得高效价血浆再经纯化(硫酸铵盐析、辛酸沉淀、亲和层析、离子交换层析等手段)得到的 免疫球蛋白或经胃酶消化再纯化后得到的()免疫球蛋白片段或者经木瓜蛋白酶消化再纯化后得到的 免疫球蛋白片段均属于动物源性蛋白均会引起人体异源蛋白过敏不良反应 美国 批准的抗响尾蛇毒血清产品马()临床研究表明与(绵羊)比较不良反应发生率为瘙痒.比.、恶心呕吐为.比.、荨麻疹为.比.、关节痛为.比.、肌痛为.比.在哥伦比亚开展的抗矛头蝮蛇毒血清临床研究表明用相同血浆制备的()片段抗蛇毒血清(胃酶消化结合辛酸沉淀工艺)与 抗蛇毒血清(辛酸沉淀结合离子交换层析工艺)比较早期不良反应发生率()分别为荨麻疹.比.、恶心呕吐.比.、腹痛.比.、发热/发冷.比.二者均无显著统计学差异 为提高产品安全性和有效性在改良传统抗蛇毒血清上普遍采用以下方法.优选免疫球蛋白片段完整的、()和 具有相同的中和蛇毒的特异性免疫球蛋白可变区()但是三者的分子大小不同分别约、和 导致三者在机体内的药物分布速率以及消除时间的差异由此可能影响达到药效时间及持久性 采用家兔模型的实验发现:马 的分布半衰期(/)为(.)消除半衰期(/)为(.)马()的/为(.)/为()马 分布明显比 和()快消除也更快/为(.)/为(.)不同种的蛇毒主要致病因子存在多样化如眼镜蛇科毒蛇的神经毒素分子小(但免疫化学纯度(抗蛇毒血清针对蛇毒产生毒性的抗体部分)可能 这些成分的产品比活性低增加了外源蛋白的摄入量 因此毒性组分提取后免疫获得针对性抗毒性作用抗体或者在全毒免疫过程中增加针对性蛇毒毒性组分免疫是提高产品比活性的最有效方法.人工合成毒素或肽段免疫蛇毒蛋白质组分复杂特别是相同蛋白质家族内性质差异不大的毒性蛋白分离困难这种情况可以采用人工合成毒素或肽段作为免疫抗原的技术 以提高免疫效果如眼镜蛇科的 型 神经毒素 普遍存在棘蛇属()、太攀属()、沙漠眼镜蛇属()、眼镜蛇属()、曼巴属()、珊瑚蛇属()通过大肠杆菌表达系统合成含 个氨基酸残基其毒性测定小鼠 为./与野生型相差不大将其免疫接种家兔可产生强的免疫原性 酶联免疫反应()滴度达 与各眼镜蛇科蛇毒均能产生交叉中和反应.疫苗策略对于较大的蛇毒毒性组分因表达和翻译后肽段组装复杂可直接采用 免疫策略也能得到高效价免疫血浆 蝰科蛇毒富含 将非洲锯鳞蝰()编码 中的整合素和丝氨酸富集区的基因(代码:)通过 技术扩增导入哺乳动物表达载体()后基因枪免疫小鼠产生的抗体均能在体外和体内限制蛇毒金属蛋白酶的催化活性表明 载体免疫方法完全可以获得蛇毒毒性成分特异性抗体.升级纯化技术提高产品纯度无论采用完整的 还是()或 片段传统抗蛇毒血清纯化工艺基本采用硫酸铵二步盐析或辛酸沉淀的方法其操作简便且获得的产品纯度高(通过 法测定纯度可达 以上)但随着现代层析技术的发展有必要开发适合抗蛇毒血清精纯的层析方法从而进一步提高抗蛇毒血清纯度甚至组合层析柱可以筛分出比活较高的 型别如纯化的()或、的亚组分()采用离子交换层析法 离子交换层析分离蛋白质基于一定的 条件下各组分蛋白质表面带电荷不同与填料间电吸附力差异而得到分离 是碱性蛋白质等电点平均在.左右明显区别于大多数血浆蛋白及其他杂质成分适合采用离子交换层析的方法提纯 如采用阴离子交换层析选择二乙胺基乙基()或季铵盐()配基在中性缓冲体系下可明显去除其他杂质蛋白和细菌内毒素或者采用阳离子交换层析选择羧甲基()或磺酸基丙基()配基在 .缓冲体系下可有效除去白蛋白、胃酶及其他杂质提高纯度()采用亲和层析法 亲和层析是利用生物分子间专一的亲和力进行分离的一种层析技术 蛋白 或蛋白 特异性结合到抗体的 区蛋白 能够结合含有 轻链的抗体为抗体的亲和层析提供了良好的选择性配基 如在美国注册获批使用的多价绵羊抗响尾蛇属蛇毒血清 其采用木瓜蛋白酶消化原料血浆后只用一步亲和层析(蛋白)纯化 ()采用凝胶过滤层析法 凝胶过滤层析是根据被分离样品中各组分相对分子质量大小和性状的差异进行洗脱分离的一项技术 抗蛇毒血清特别是采用酶解工艺的()或 片段中的杂质组分往往与原抗体的电荷甚至亲和能力接近但是分子量大小却有明显差异这种情况适宜采用凝胶过滤层析法 如浙江健博生物科技股份有限公司开发的抗蛇毒()抗体凝胶过滤层析工艺可有效去除抗体聚合体、以及 以下的各种小分子蛋白质从而提高了产品纯度和比活 新型抗蛇毒抗体的展望 蛇毒蛋白质组学取得了较大的进展已经明确了眼镜蛇科的 个主要蛋白质家族和蝰亚科的 个主要蛋白质家族 根据含量比例的不同有 个一类蛋白质家族(家族、家族、家族、家族)个二类蛋白质家族富含半胱氨酸分泌蛋白家族()、氨基酸氧化酶家族()、库尼茨肽家族()、型凝集素家蛇 志 ()年第 卷第 期.族()、去 整 合 素 家 族()、利 钠 肽 家 族()另外还存在其他蛋白质家族但含量极少 同一蛋白质家族内存在共有的抗原表位为新型抗蛇毒抗体的开展提供了物质基础.传统抗蛇毒杂交瘤单克隆抗体单克隆抗体技术是采用细胞融合的方法将具有分泌特异性抗体能力的 细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞该细胞可不断产生高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体 单克隆抗体()特异性高结合位点明确在体外和体内均能中和相应蛇毒 鼠源抗蛇毒单克隆抗体开发已有一系列进展.针对出血毒的鼠单克隆抗体黄绿原矛头蝮()是日本本土主要蝮亚科毒蛇从其毒液中分离出出血性金属蛋白酶组分(:.)用于免疫 小鼠分离出脾细胞与/骨髓瘤细胞融合再通过 蛋白捕获杂交瘤细胞培养上清中的单克隆抗体该抗体可明显抑制 的蛋白水解酶活性和出血活性经重叠肽识别法确定该抗体结合的抗原表位位于 的第 和 残基构成的空间域上 美洲矛头蝮()是主要分布于中美洲和南美洲的致命毒蛇其毒液中含美洲矛头蝮出血毒素()该毒素含金属蛋白酶活性区、去整合素样和富含半胱氨酸域能够催化强烈的出血活性 将 免疫小鼠后取小鼠腘窝淋巴结细胞与 骨髓瘤细胞融合制备单克隆抗体共获得 个抗 的单抗细胞株均为 型但只有 号()可完全中和 的出血毒性 锯鳞蝰()是分布于亚洲和非洲两个大陆的剧毒蛇将其蛇毒免疫小鼠后采用小鼠脾细胞与 骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞从中筛选出一株生产株(/)其分泌蛋白可有效结合锯鳞蝰蛇毒并抑制其出血活性.针对神经毒的鼠单克隆抗体黑颈喷毒眼镜蛇()是分布于非洲中部的大型蛇类其善于喷毒攻击当毒液进入眼后会导致瞬间失明 采用其毒液中提取的 毒素免疫小鼠脾细胞并与 骨髓瘤细胞融合后制备杂交瘤细胞产出的鼠单克隆抗体于小鼠腹腔注入 同时注入致死剂量()的 毒素小鼠全部存活表明该抗体可限制毒素攻击起到良好的保护作用该抗体的中和表位位于毒素的首个 折叠环处由氮端位置的两个正电荷、号赖氨酸、号脯氨酸和 号苏氨酸残基构成 三色矛头蝮()是墨西哥和中美洲地区危害性最大的一种毒蛇其毒液可以破坏肌肉导致大范围的组织损伤和剧烈的疼痛肌肉毒素()是其主要毒性成分通过 填料色谱分离制备再结合弗氏佐剂免疫/小鼠选取血清抗体活性高的小鼠脾细胞与/骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞共获得 个 型特异性抗肌肉毒素的细胞株其中 株的 可使中毒小鼠肌酸激酶值(值)显著下降表明有良好的中和活性 中华眼镜蛇是分布在我国南部、台湾地区和中南半岛的主要眼镜蛇蛇种从其毒液中分离出的眼镜蛇毒神经毒素()是一种短链神经毒素作用于突触后膜上的烟酰胺型乙酰胆碱受体阻止神经肌肉通路的去极化从而阻断神经冲动传导 这种作用的 被开发成镇 痛 药物 的 约./其 毒 性 是 粗 毒 的 倍左右将其配合 佐剂免疫/小 鼠每次 共 次将血清抗体滴度高的小鼠脾细胞与/型骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞获得了 个与 有交叉反应的细胞株其中 个细胞株 可结合 的线性表位阻止 与乙酰胆碱受体结合保护致死剂量眼镜蛇毒攻击下的小鼠免于死亡 此外采用鼠源单克隆抗体虽然明显提高了产品比活性但同样存在外源蛋白摄入引发的过敏反应风险另外毒蛇咬伤的救治不能只采用单一抗体治疗而是多种单克隆抗体的组合但鼠单克隆抗体筛选制备繁琐这些因素限制了单克隆抗体替代传统抗蛇毒血清 然而随着单克隆抗体技术的成熟及与基因克隆重组等技术结合开发为新型抗蛇毒抗体的开发应用提供了可能性各种鼠源经人源化改造的抗体如嵌合抗体是将蛇毒或蛇毒类毒素异源单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中转化哺乳动物细胞表达出嵌合抗体 这种表达的抗体分子中轻重链 区是异源的而 区是人源的 此外改型抗体是将蛇毒或蛇毒类毒素异源单抗的 移植至人源抗体可变区替代人源抗体 使人源抗体获得鼠源单抗的抗原结合特异性同时减少其异源性表面重塑抗体是指对异源抗体表面氨基酸残基进行人源化改造仅替换与人抗体表面氨基酸残基差别明显的区域在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换蛇 志 ()年第 卷第 期.人源化单克隆抗体人源化抗体技术是新型抗蛇毒抗体的开发趋势因其具备组织兼容性基本不产生免疫原性这样可以减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应且随着技术成熟抗体开发的效率在不断提高 人源化抗体按动物源占比可分为三代第一代为嵌合抗体 的 区由动物源区为人源第二代为改型抗体 区为动物源其余为人源第三代为全人源化抗体指抗体表达基因全部为人源 目前制备全人源单克隆抗体的技术主要包括噬菌体展示技术、细胞克隆技术、细胞永生化技术等.以噬菌体展示技术开发抗蛇毒全人源化抗体 人源化噬菌体展示技术()是将人的蛋白或多肽的核酸插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置使外源基因随外壳蛋白的表达而在噬菌体表面展示 一般采用 法直接扩增多样化的人抗体基因或人工合成或部分合成抗体可变区基因构建噬菌体文库再从文库中筛选出抗蛇毒单链抗体()是由抗体重链可变区和轻链可变区通过短肽连接而成的免疫球蛋白保留了抗原结合特性但没有恒定区因此免疫原性极少组织渗透性更快不会激活补体活性 南美响尾蛇恐怖亚种()是致死率最高的响尾蛇从其毒液中分离出的响尾蛇毒素()是主要致病因子属于 家族中的 神经毒素类 从 等建立的半合成人噬菌体文库中筛选出两个抗 的 株其中一株可明显抑制 的 活性 利用.人工合成人 噬菌体文库筛选出的单抗株对巴西矛头蝮()、美洲矛头蝮()、莫氏矛头蝮()和纽维特矛头蝮()蛇毒不仅有中和活性而且还有抗出血活性、抗致死活性以及抗肌肉毒性 尖吻蝮()是我国主要的陆生毒蛇之一其排毒量大毒液成分对机体表现多种混合毒效应 第三军医大学以尖吻蝮蛇咬伤后恢复期患者的外周血淋巴细胞为材料提取其总经 扩增全套抗体可变区基因构建了包含人源尖吻蝮蛇毒蛋白抗体基因的 基因噬菌体文库 银环蛇()是我国陆生毒蛇中蛇毒性最强的毒蛇其蛇毒有、两种神经毒素患者被咬时无疼痛感但可引起呼吸麻痹如未及时救治死亡率极高 乔媛媛等采用正常成人外周血和新生儿脐血的淋巴细胞轻链可变区基因()和重链可变区基因()构建大容量接 噬菌体抗体库以银环蛇毒素为靶抗原通过“吸附洗脱扩增”过程从大容量天然噬菌体抗体库中筛选出 株特异性抗体其中 株 具有银环蛇毒素的中和活性.以 细胞克隆技术开发抗蛇毒全人源化抗体 单 细胞技术()可以以随机或抗原选择方式从外周血或淋巴组织中直接分离单 细胞 针对特定的抗原成分可先通过人体免疫或患者获得淋巴细胞再用 技术扩增目标抗体序列重新构建、或 区纳米抗体等序列最终转染至动物细胞、微生物细胞或转基因动物表达 目前已有许多单 细胞抗体技术平台如:平台通过免疫破伤风的志愿者浆细胞和记忆细胞获得全人源化抗破伤风抗体 平台获得靶向寡聚的 这些都有望成为首个可以逆转阿尔茨海默病进程的药物 目前仍未见采用 细胞克隆技术开发抗蛇毒全人源化抗体的报道但随着平台的成熟实现高通量筛选和测序这一目标正不断接近 结语 抗蛇毒血清为救治蛇毒咬伤患者作出了巨大贡献明确了蛇伤诊疗需采用特异性抗体的方向 但是传统抗蛇毒血清是从动物血浆中提取如何降低抗蛇毒血清的过敏反应是一直探讨的问题 抗蛇毒血清已经应用 多年全球的制备工艺与质控标准整体上没有发生多大的改变不过一些厂家已经做出了改进如采用了亲和层析、离子交换层析以及纳米膜过滤等新兴技术在动物免疫方面也尝试采用新型佐剂、人工合成毒素免疫等手段 无论采用何种方法传统抗蛇毒血清只能从纯度和比活性方面提高产品质量而无法彻底消除外源蛋白引起的过敏反应 新型抗蛇毒抗体技术的开发为抗蛇毒血清的替代更新提供了新的策略 特别是全人源化的短链抗体(如、纳米抗体等)不仅从根本上消除过敏反应而且药动学上分布快、组织渗透性好有利于清除进入组织器官靶位的蛇毒 但由于蛇毒组分复杂其多个蛋白质家族均有毒性作用即便同一个家族的毒性机理也不尽相同因此必须采用多种单抗组合才能满足临床应用 筛定有临床意义且有广泛交叉作用的抗蛇毒单抗是耗时耗力的还需大量的试验数据证明 然而一旦认定单抗与临床表征的相关性无论对何种毒蛇咬伤只要通过临床表征就蛇 志 ()年第 卷第 期.可以选择类似于鸡尾酒疗法的单抗组合治疗这将会成为抗蛇毒血清应用的历史重大变革 年 月第 届世界卫生大会由于认识到毒蛇咬伤造成过多的痛苦且迄今全球卫生界基本上忽视了该问题 审议了关于全球蛇咬伤负担的报告启动了预防和控制毒蛇咬伤全球战略 战略的目的是在未来 年减少一半数量的死亡和残疾一个中心目标将是必须确保拯救生命的抗蛇毒血清的生产和供应和改进参考文献 覃公平.中国毒蛇学.版.南宁:广西科学技术出版社:.():.():.王立兰董联珠.抗蛇毒毒素研究应用进展.现代临床医学生物工程学杂志():.():.:.:.:.():.().():.:./.:/./.():.:.().:.:.():.:.:.:.():.():.:.():.:.():.():.():.(/):.蛇 志 ()年第 卷第 期.(/):.()():.():.:.:.().():.:/.():.():.:.():.刘明华曹宇亮张雷等.人源尖吻蝮蛇毒蛋白抗体单链可变区片段噬菌体文库的初建.中国生物制品学杂志():.乔媛媛王琰陈晓穗等.大容量噬菌体抗体库的构建及鉴定.中华微生物学和免疫学杂志():.王欲晓周丽君张海荣等.抗银环蛇毒素人源单链抗体的筛选及鉴定.中国生物制品学杂志():.().:.:/.:/./.本刊来稿要求 来稿勿一稿两投 为提高稿件录用率请把文章通过电子邮件发送到蛇志邮箱 有重大发现或国际竞争价值的研究论文请作者附信说明本刊将根据情况优先发表 获得基金项目资助产出的文章应说明基金项目名称、编号多项基金项目应依次列出 来稿需附上单位介绍信稿件的真实性和保密性审查由研究单位负责 编辑部收到文稿后给予回执 需退回修改的论文作者修改后注明“回修稿”以邮件方式发回编辑部不符合本刊发表的文稿一般不退稿请作者自留底稿 文责自负 本刊编辑部可以对来稿作修改、删节如作者不允许修改、删节请在来稿中注明 来稿不得侵犯他人版权如有侵权则由投稿者负完全责任蛇 志 ()年第 卷第 期.