铜绿假单胞菌中S型绿脓杆菌...荧光嗜铁素的功能协同性分析_陈文辉.pdf

陈文辉 等/铜绿假单胞菌中 S 型绿脓杆菌素与荧光嗜铁素的功能协同性分析 Chinese Journal of Biotechnology http:/ Apr.25,2023,39(4):1562-1577 DOI:10.13345/j.cjb.220608 2023 Chin J Biotech,All rights reserved 资 助 项 目：国 家 重 点 研 发 计 划(2020YFA0906900，2018YFA0902700)；中 国 科 学 院 科 研 仪 器 设 备 研 制 项 目(YJKYYQ20200033)This work was supported by the National Key Research and Development Program of China(2020YFA0906900,2018YFA0902700)and the Scientific Instrument Developing Project of the Chinese Academy of Sciences(YJKYYQ20200033).*Corresponding author.Tel:[phone],E-mail: Received:2022-08-02;Accepted:2022-11-30;Published online:2022-12-06 1562 生物工程学报 铜绿假单胞菌中 S 型绿脓杆菌素与荧光嗜铁素的功能协同性分析 陈文辉1，金帆2*1 中国科学技术大学 高分子科学与工程系 合肥微尺度物质科学国家研究中心，安徽 合肥 230026 2 中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所，广东 深圳 518055 陈文辉,金帆.铜绿假单胞菌中 S 型绿脓杆菌素与荧光嗜铁素的功能协同性分析J.生物工程学报,2023,39(4):1562-1577.CHEN Wenhui,JIN Fan.Functional synergism of pyoverdine and the S-type pyocins of Pseudomonas aeruginosaJ.Chinese Journal of Biotechnology,2023,39(4):1562-1577.摘 要：在铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中，S 型绿脓杆菌素 S2 和 S4 与细菌中的铁载体荧光嗜铁素(pyoverdine)使用相同的摄取通道，表明二者之间存在某些联系。本研究表征了细菌中 3个 S 型绿脓杆菌素(Pys2、PA3866、PyoS5)的单细菌基因表达分布，并研究了 S2 型绿脓杆菌素对细菌摄取荧光嗜铁素的影响。结果表明，在 DNA 损伤压力下，S 型绿脓杆菌素基因的表达在细菌种群中呈现出高度分化，外源加入 S2 型绿脓杆菌素会减少细菌对荧光嗜铁素的摄取，因此 S2 型绿脓杆菌素的存在会阻止不合成荧光嗜铁素的“欺骗者”摄取环境中荧光嗜铁素，进而减弱其对活性氧(reactive oxygen species,ROS)压力的抵抗能力。另外我们发现，在细菌中过表达 SOS 响应(SOS response)调节因子PrtN时，荧光嗜铁素相关合成基因的表达量显著降低，进而导致荧光嗜铁素的总合成量和外分泌量显著降低。以上结果表明细菌中 SOS 压力响应系统与铁摄取系统的功能是存在相互联系的。关键词：SOS 响应；绿脓杆菌素；荧光嗜铁素；活性氧压力；铜绿假单胞菌 医药生物技术 陈文辉 等/铜绿假单胞菌中 S 型绿脓杆菌素与荧光嗜铁素的功能协同性分析 ：010-64807509： 1563 Functional synergism of pyoverdine and the S-type pyocins of Pseudomonas aeruginosa CHEN Wenhui1,JIN Fan2*1 Hefei National Laboratory for Physical Sciences at the Microscale,Department of Polymer Science and Engineering,University of Science and Technology of China,Hefei 230026,Anhui,China 2 Shenzhen Institute of Synthetic Biology,Shenzhen Institutes of Advanced Technology,Chinese Academy of Sciences,Shenzhen 518055,Guangdong,China Abstract:Pyocin S2 and S4 in Pseudomonas aeruginosa use the same uptake channels as the pyoverdine does in bacteria,indicating a possible connection between them.In this study,we characterized the single bacterial gene expression distribution of three S-type pyocins(Pys2,PA3866,and PyoS5)and examined the impact of pyocin S2 on bacterial uptake of pyoverdine.The findings demonstrated that the expression of the S-type pyocin genes was highly differentiated in bacterial population under DNAdamage stress.Moreover,exogenous addition of pyocin S2 reduces the bacterial uptake of pyoverdine so that the presence of pyocin S2 prevents the uptake of environmental pyoverdine by non-pyoverdine synthesizing cheaters,thereby reducing their resistance to oxidative stress.Furthermore,we discovered that overexpression of the SOS response regulator PrtN in bacteria significantly decreased the expression of genes involved in the synthesis of pyoverdine,significantly decreasing the overall synthesis and exocytosis of pyoverdine.These findings imply a connection between the function of the iron absorption system and the SOS stress response mechanism in bacteria.Keywords:SOS response;pyocin;pyoverdine;ROS stress;Pseudomonas aeruginosa 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种兼性厌氧、无芽孢形成的杆状革兰氏阴性菌，广泛存在于自然环境尤其是淡水和土壤中。它是一种条件性致病菌，可以感染植物和动物包括人类宿主并引发疾病。铜绿假单胞菌感染普遍发生在免疫功能不全的人身上，比如囊胞性纤维症(cystic fibrosis,CF)患者、支气管扩张患者、烧伤患者、癌症患者、艾滋病患者或者器官移植术后病人等。它可以引发一系列社区获得性感染，包括毛囊炎、刺伤导致脊髓炎、肺炎、外耳道炎症等。不管是在自然环境中，还是宿主中，细菌的生存都面临着不同的环境压力，如紫外线、抗生素、不适宜的温度和 pH 等。为了在这些极端的条件下生存下来，细菌必须感应到这些压力，并调节自身的一些基因的表达以及蛋白的活性来应对这些压力。在亿万年的演化中，细菌中产生了各种应对不同环境压力的响应系统，比如热休克响应系统、冷休克响应系统以及各种外排泵等1-4。环境中会有很多因素会造成细菌的 DNA损伤，如强烈的紫外线照射、喹诺酮类抗生素等5-6。细菌应对 DNA 损伤的响应机制称为 SOS响应(SOS response)。在铜绿假单胞菌中，LexA、AlpR 和 PrtR 这 3 个转录抑制子调控了 SOS 响应。LexA 蛋白调控了大量负责 DNA 修复的基因的表达，AlpR 调控了细菌的一套程序性死亡通路，PrtR 则通过调控 prtN 基因的表达来间接调控绿脓杆菌素(pyocin)的合成。ISSN1000-3061 CN11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1564 在铜绿假单胞菌中，绿脓杆菌素分为 R 型、F 型和 S 型7。其中 R 型和 F 型绿脓杆菌素由噬菌体的尾部演化而来。S 型绿脓杆菌素是一大类蛋白质细菌素，通常由大分子量的效应蛋白和小分子量的免疫蛋白组成。效应蛋白通常包含 2 个结构域，一个结构域帮助蛋白与细菌细胞膜上特定通道蛋白结合并利用质子动势(proton motive force,PMF)进入胞内，另一个结构域通常是具有成孔功能(如 pyocin S5)、DNase 活性(如 pyocin S2)或者 tRNase 活性(如 pyocin S4)8。S 型绿脓杆菌素的确切的生理学作用尚不清晰。一种可能的生理学作用是确保能够合成绿脓杆菌素的铜绿假单胞菌细菌种群在细菌生态位中的优势地位：利用绿脓杆菌素抑制绿脓杆菌素敏感型细菌的数量9。绿脓杆菌素的表达还会增加细菌对环丙沙星的敏感性10。此外，在临床条件下检测到绿脓杆菌素基因的表达的频率远远大于在自然环境中，同时 S 型绿脓杆菌素在缺铁条件下的抑菌能力更强，表明绿脓杆菌素的分泌可能是有位置偏好的，比如囊性纤维化患者的肺部11-14。目前已经有实验证明了 S2 型绿脓杆菌素(pyocin S2)是通过铜绿假单胞菌外膜上的 FpvAI蛋白进入胞内的15。FpvAI 同时还是铜绿假单胞菌摄取荧光嗜铁素(pyoverdine)的主要通道蛋白。本课题组之前发现，荧光嗜铁素除了能帮助细菌在缺条件下摄取环境中的铁离子之外，还能帮助细菌抵抗活性氧(reactive oxygen species,ROS)压力16。这些结果表明细菌中响应不同环境压力的系统之间可能存在着重要的联系。本研究通过构建启动子荧光报告系统，探究了不同条件下 S 型绿脓杆菌素基因的表达分布，绿脓杆菌素的表达对荧光嗜铁素合成量的影响，以及绿脓杆菌素的存在对细菌抵抗 ROS 压力的影响。结果表明，当环丙沙星超过最小抑制浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)时，S 型绿脓杆菌素的基因表达呈现高度分化；在 S 型绿脓杆菌素高表达的菌种中，荧光嗜铁素的表达量下降；环境中的 S2 型绿脓杆菌素可以阻止pvdA 菌株通过摄取环境中的荧光嗜铁素来减少妥布霉素带来的损伤。表明细菌中响应不同环境压力的系统之间不是相互独立的，而是存在相互作用。1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 菌株和质粒 所用菌株和质粒如表 1 所示。铜绿假单胞菌菌株 PAO1 及其敲除菌种、大肠杆菌(Escherichia coli)Top10和BL21，质 粒pUCP20、pET28a-pys2-His 均由本实验室保存。1.1.2 主要试剂 LB 培养基：胰蛋白胨生工生物工程(上海)有限公司 10 g/L，酵母粉生工生物工程(上海)有限公司 5 g/L，NaCl(阿拉丁试剂有限公司)，10 g/L；固体培养基添加 20 g/L 的琼脂(阿拉丁试剂有限公司)。FAB培 养 基：(NH4)2SO4 2 g/L，Na2HPO412H2O 12.02 g/L，KH2PO4 3 g/L，NaCl 3 g/L，MgCl2 93 mg/L，CaCl22H2O 14 mg/L，微量金属元素溶液 1 mL/L。试剂购自阿拉丁试剂有限公司。SSM 培养基：K2HPO43H2O 7.86 g/L，KH2PO4 3.00 g/L，(NH4)2SO4 1.00 g/L，MgSO47H2O 0.20 g/L，琥珀酸(阿拉丁试剂有限公司)4.00 g/L，用 NaOH 溶液调节 pH 至 7。其他试剂：环丙沙星、庆大霉素、妥布霉素、甘油、FeCl3、阿拉伯糖、HEPES、CuSO4、异丙基-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-D-thiogalactoside,IPTG)购自阿拉丁试剂有限公司，碘化丙啶(PI)陈文辉 等/铜绿假单胞菌中 S 型绿脓杆菌素与荧光嗜铁素的功能协同性分析 ：010-64807509： 1565 表 1 实验所用菌株和质粒 Table 1 Strains and plasmids used in this study Strains and plasmids Characteristics Sources or references Strains P.aeruginosa PAO1 Lab stock pvdA pvdAinactivated in PAO1;nonresistant.Lab stock pys2 pys2 inactivated in PAO1;nonresistant.Lab stock PA3866 PA3866 inactivated in PAO1;nonresistant.Lab stock pyoS5 pyoS5 inactivated in PAO1;nonresistant.Lab stock RFpyo R-and F-type pyocin genes(PA0617-PA0642)inactivated in PAO1;nonresistant.Lab stock Spyo All S-type pyocin genes inactivated in PAO1;nonresistant.Lab stock Other strains Escherichia coli Top10 F-mcrA(mrr-hsdRMS-mcrBC)80lacZ M15 lacX74 recA1 araD139(araleu)7697 galUgalKrpsL(NalR)endA1nupG Lab stock Escherichia coli BL21 E.coli B FompTgaldcmlonhsdSB(rBmB)malB+K-12(S)Lab stock Plasmids pUCP20 E.coli-P.aeruginosa shuttle plasmid,Gmr Lab stock S2-ImmS2-pET28a Plasmid used to induce expression of pys2 Lab stock pUCP20-Ppys2-sfgfp-T0T1-J23102-cyofp1 pys2 transcriptional reporter,sfgfp driven by the pys2 promoter and cyofp1 driven by the J23102 promoter cloned into pUCP20.Gmr This study pUCP20-PPA3866-sfgfp-T0T1-J23102-cyofp1 PA3866 transcriptional reporter,sfgfp driven by the PA3866 promoter and cyofp1 driven by the J23102 promoter cloned into pUCP20.Gmr This study pUCP20-PpyoS5-sfgfp-T0T1-J23102-cyofp1 pyoS5 transcriptional reporter,sfgfp driven by the pyoS5 promoter and cyofp1 driven by the J23102 promoter cloned into pUCP20.Gmr This study pUCP20-PlexA-sfgfp-T0T1-J23102-cyofp1 lexA transcriptional reporter,sfgfp driven by the lexA promoter and cyofp1 driven by the J23102 promoter cloned into pUCP20.Gmr This study pUCP20-PPA2288-sfgfp-T0T1-J23102-cyofp1 PA2288 transcriptional reporter,sfgfp driven by the PA2288 promoter and cyofp1 driven by the J23102 promoter cloned into pUCP20.Gmr This study pUCP20-PdinB-sfgfp-T0T1-J23102-cyofp1 dinB transcriptional reporter,sfgfp driven by the dinB promoter and cyofp1 driven by the J23102 promoter cloned into pUCP20.Gmr This study pUCP20-PpvdQ-sfgfp-T0T1-J23102-cyofp1 pvdQ transcriptional reporter,sfgfp driven by the pvdQ promoter and cyofp1 driven by the J23102 promoter cloned into pUCP20.Gmr This study pUCP20-PpvdA-sfgfp-T0T1-J23102-cyofp1 pvdA transcriptional reporter,sfgfp driven by the pvdA promoter and cyofp1 driven by the J23102 promoter cloned into pUCP20.Gmr This study pUCP20-PfpvI-sfgfp-T0T1-J23102-cyofp1 fpvI transcriptional reporter,sfgfp driven by the fpvI promoter and cyofp1 driven by the J23102 promoter cloned into pUCP20.Gmr This study pUCP20-PpvdP-sfgfp-T0T1-J23102-cyofp1 pvdP transcriptional reporter,sfgfp driven by the pvdP promoter and cyofp1 driven by the J23102 promoter cloned into pUCP20.Gmr This study pUCP20-PpvdF-sfgfp-T0T1-J23102-cyofp1 pvdF transcriptional reporter,sfgfp driven by the pvdF promoter and cyofp1 driven by the J23102 promoter cloned into pUCP20.Gmr This study pUCP20-PpvdE-sfgfp-T0T1-J23102-cyofp1 pvdE transcriptional reporter,sfgfp driven by the pvdE promoter and cyofp1 driven by the J23102 promoter cloned into pUCP20.Gmr This study pUCP20-PpvdH-sfgfp-T0T1-J23102-cyofp1 pvdH transcriptional reporter,sfgfp driven by the pvdH promoter and cyofp1 driven by the J23102 promoter cloned into pUCP20.Gmr This study pUCP20-PpvdS-sfgfp-T0T1-J23102-cyofp1 pvdS transcriptional reporter,sfgfp driven by the pvdS promoter and cyofp1 driven by the J23102 promoter cloned into pUCP20.Gmr This study pUCP20-Ppys2-sfgfp-T0T1-J23102-cyofp1-T-araC-PBAD-prtN pys2 transcriptional reporter,sfgfp driven by the pys2 promoter,cyofp1 driven by theJ23102 promoter and cloned into pUCP20.Gmr This study (待续)ISSN1000-3061 CN11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1566 (续表 1)Strains and plasmids Characteristics Sources or references pUCP20-PPA3866-sfgfp-T0T1-J23102-cyofp1-T-araC-PBAD-prtN Sfgfp driven by the PA3866 promoter,cyofp1 driven by theJ23102 promoter,prtN driven by the PBAD promoter and cloned into pUCP20.Gmr This study pUCP20-PpyoS5-sfgfp-T0T1-J23102-cyofp1-T-araC-PBAD-prtN Sfgfp driven by the pyoS5 promote,cyofp1 driven by theJ23102 promoter,prtN driven by the PBAD promoter and cloned into pUCP20.Gmr This study pUCP20-PpvdQ-sfgfp-T0T1-J23102-cyofp1-T-araC-PBAD-prtN Sfgfp driven by the pvdQ promote,cyofp1 driven by theJ23102 promoter,prtN driven by the PBAD promoter and cloned into pUCP20.Gmr This study pUCP20-PpvdA-sfgfp-T0T1-J23102-cyofp1-T-araC-PBAD-prtN Sfgfp driven by the pvdA promoter,cyofp1 driven by theJ23102 promoter,prtN driven by the PBAD promoter and cloned into pUCP20.Gmr This study pUCP20-PfpvI-sfgfp-T0T1-J23102-cyofp1-T-araC-PBAD-prtN Sfgfp driven by the fpvI promote,cyofp1 driven by theJ23102 promoter,prtN driven by the PBAD promoter and cloned into pUCP20.Gmr This study pUCP20-PpvdP-sfgfp-T0T1-J23102-cyofp1-T-araC-PBAD-prtN Sfgfp driven by the pvdP promoter,cyofp1 driven by theJ23102 promoter,prtN driven by the PBAD promoter and cloned into pUCP20.Gmr This study pUCP20-PpvdF-sfgfp-T0T1-J23102-cyofp1-T-araC-PBAD-prtN Sfgfp driven by the pvdF promoter,cyofp1 driven by theJ23102 promoter,prtN driven by the PBAD promoter and cloned into pUCP20.Gmr This study pUCP20-PpvdE-sfgfp-T0T1-J23102-cyofp1-T-araC-PBAD-prtN Sfgfp driven by the pvdE promote,cyofp1 driven by theJ23102 promoter,prtN driven by the PBAD promoter and cloned into pUCP20.Gmr This study pUCP20-PpvdH-sfgfp-T0T1-J23102-cyofp1-T-araC-PBAD-prtN Sfgfp driven by the pvdH promoter,cyofp1 driven by theJ23102 promoter,prtN driven by the PBAD promoter and cloned into pUCP20.Gmr This study pUCP20-PpvdS-sfgfp-T0T1-J23102-cyofp1-T-araC-PBAD-prtN Sfgfp driven by the pvdS promoter,cyofp1 driven by theJ23102 promoter,prtN driven by the PBAD promoter and cloned into pUCP20.Gmr This study 购自日本同仁化学研究所。1.1.3 主要仪器 倒置显微镜(奥林巴斯株式会社，型号 IX-71)，去离子水机(默克密理博，型号 Advantage A10)，医用型超净工作台(艺思高科技有限公司，型号SVE-4A1)，大容量振荡器摇床(太仓华大实验仪器科技有限公司，型号 HZ-6090A)，NanoDrop 2000(赛默飞世尔科技公司)，台式高速冷冻离心机(长沙平凡仪器仪表有限公司，型号 TGL-16A)，低速离心机(北京京立离心机有限公司，型号 LD5-2B)，细菌电穿孔仪(伯乐生命医学产品有限公司，型号617BR109469)，生化培养箱(上海丙林电子科技公司，SPX 系列)，冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司，型号 FD-1A-50)。1.2 方法 1.2.1 质粒及启动子荧光报告菌株构建 质粒构建过程中各片段通过 PCR 反应扩增得到，所涉及的引物及其序列如表 2 所示。利用 Gibson Assembly 的方法将各个片段插入到线性化的 pUCP20 质粒17。随后用化学转化法将连接产物转化到大肠杆菌 Top10感受态细胞中。利用 PCR 反应以及测序鉴定得到正确的质粒。随后利用电化学转化法将质粒转化至PAO1 或 pvdA 菌株中，利用抗性挑选出正确的单克隆扩大培养保存至80 冰箱，以便后续使用。所有 PCR 反应以及 Gibson Assembly 反应的组分配制和反应温度均参照试剂盒说明书。1.2.2 荧光图像拍摄 使用倒置显微镜(IX-71 Olympus)来进行菌株的荧光数据采集。拍摄 SfGFP 和 CyOFP1 的荧光使用的激发光波长均为 488 nm，SfGFP 的发射波长为(52028)nm，CyOFP1 的发射波长为(58322)nm，拍摄时激发光曝光时间均为200 ms。测定的荧光嗜铁素的荧光强度时的激发波长为405 nm，发射波长为 450 nm；生死染色实验 中 PI 荧光的激发波长为 561 nm，发射波长为605 nm。为了统计足够多单细菌的荧光数据，每个菌种样品都采集了多个视野的数据。陈文辉 等/铜绿假单胞菌中 S 型绿脓杆菌素与荧光嗜铁素的功能协同性分析 ：010-64807509： 1567 表 2 文中所用引物序列 Table 2 Primer sequences used in this study Primer name Sequence(53)Size(bp)promoter-test-F GGGGACACTGTATCTGCG 18 promoter-test-R TCTTGCGAATGACCTTGA 18 pucZL-F2 CTAGCGATCCCGACTCACTATAGAGGG 27 pucZL-R2 AACTGGTTGGACTTGCCCTCCCTCT 25 add-sfgfp-F GGAGGGCAAGTCCAACCAGTT 21 add-sfgfp-R GTCAACCGCAAGCTCCTAGCGGCGG 25 add-cyofp1-F GGAGCTTGCGGTTGACAGCTAGCTCAG 27 add-cyofp1-R CGGAAGAGCGCCCAATACGC 20 add-prtN-F GCGTATTGGGCGCTCTTCCGGCCAAGCGCGCAATTAACCCTC 42 add-prtN-R AGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGGCGTTTAAGGGCACCAATAAC 43 pUCP(prtN)-F CTTCCTCGCTCACTGACTCGCT 22 pUCP(prtN)-R CTTGGCCGGAAGAGCGCCCAATACG 25 PA0923-F AGAGGGAGGGCAAGTCCAACCAGTTTCAGCATCTGTCTGTCCTTTCCGTATC 52 PA0923-R CTCTATAGTGAGTCGGGATCGCTAGCGGCGAACCGCCAACCGCCA 45 PA3007-F AGAGGGAGGGCAAGTCCAACCAGTTAAGAACGGCACCATCAGG 43 PA3007-R CTCTATAGTGAGTCGGGATCGCTAGTTGAAGCCGAGTTCCTGG 43 PA2288-F AGAGGGAGGGCAAGTCCAACCAGTTTGCGGTATTCAACTGGCG 43 PA2288-R CTCTATAGTGAGTCGGGATCGCTAGAGTTCGGCAAGGTTGTGG 43 PA1150-F AGAGGGAGGGCAAGTCCAACCAGTTTCTTGAAGCACGAGGCTG 43 PA1150-R CTCTATAGTGAGTCGGGATCGCTAGTCCTGGTGGGACAAATGG 43 PA3866-F AGAGGGAGGGCAAGTCCAACCAGTTATCCAGGCGTTTCTTGCG 43 PA3866-R CTCTATAGTGAGTCGGGATCGCTAGTGGTCACGACAAGTGGTG 43 PA0985-F AGAGGGAGGGCAAGTCCAACCAGTTACCACTTTCAGCGACTCG 43 PA0985-R CTCTATAGTGAGTCGGGATCGCTAGATCGTCTGGACCTTGTGC 43 PA2385-F AGAGGGAGGGCAAGTCCAACCAGTTCGCCGGTAGCGGCGAGCTAAGCGTA 50 PA2385-R CTCTATAGTGAGTCGGGATCGCTAGATAGGCGGTCCAGCGGAT 43 PA2386-F AGAGGGAGGGCAAGTCCAACCAGTTTGCTGCGATTCCTCAGTG 43 PA2386-R CTCTATAGTGAGTCGGGATCGCTAGTGCTTGTCCAGGAACAGC 43 PA2387-F AGAGGGAGGGCAAGTCCAACCAGTTAACATAAGCAGGGCGAGG 43 PA2387-R CTCTATAGTGAGTCGGGATCGCTAGAAAGCCTTCGGATGCTCG 43 PA2392-F AGAGGGAGGGCAAGTCCAACCAGTTAAGAATGGCAAGGGACGG 43 PA2392-R CTCTATAGTGAGTCGGGATCGCTAGCCGCCAGGTCGAGCGAAGC 44 PA2396-F AGAGGGAGGGCAAGTCCAACCAGTTATGGCGGTGTAGTGCTTC 43 PA2396-R CTCTATAGTGAGTCGGGATCGCTAGCAGCGCAGTCTGGTTCAGCGCCT 48 PA2397-F AGAGGGAGGGCAAGTCCAACCAGTTAATACCACCACATCGGCG 43 PA2397-R CTCTATAGTGAGTCGGGATCGCTAGGCAAGGCGTTGTTGATGC 43 PA2413-F AGAGGGAGGGCAAGTCCAACCAGTTACCATCAACCACCACTGG 43 PA2413-R CTCTATAGTGAGTCGGGATCGCTAGCGGAATCCGCCGCGGATAG 44 PA2426-F AGAGGGAGGGCAAGTCCAACCAGTTACCACTGGCAACAGCATC 43 PA2426-R CTCTATAGTGAGTCGGGATCGCTAGAGCCTGAAGAACGCATCC 43 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1568 1.2.3 基因表达水平的测定 荧光图像的细菌识别和分割是利用课题组之前开发的 MATLAB 程序实现的18-20。简而言之，图像分割是用 CyOFP1 通道拍摄的荧光图片。首先利用高斯拉普拉斯算子(Laplacian of Gaussian,LoG)确定细菌的轮廓。随后利用光谱串扰(spectral crosstalk)矫正矩阵去除光谱串扰的影响，获得矫正光强。最后单细菌的基因表达水平是通过细菌轮廓内部的像素点的矫正光强的平均值直接确定。对于一个包含 SfGFP、CyOFP1、荧光嗜铁素 3 种荧光物质的体系，体系中 3 种荧光物质的真实浓度分别用 c1、c2、c3表示，3 个荧光通道拍摄的荧光强度分别用 Ia、Ib、Ic表示，由于光谱串扰的原因，荧光强度 I 和真实浓度 c 之间满足如下关系：111123222333abcabcabcabcIIIccc=|(1)其中ij是 j 荧光物质在 i荧光通道中的权重系数。因此真实浓度的确定可以通过如下公式：1cI=(2)1是权重系数矩阵的逆矩阵。权重系数矩阵的确定是通过只包含提纯的某一种荧光物质的体系来确定的。比如，体系中只存在 SfGFP荧光蛋白，拍摄 SfGFP、CyOFP1、荧光嗜铁素通道的荧光图像，确定各通道中的荧光强度，此时荧光强度 I 和真实浓度 c 满足如下关系：1123 abcaaaIIIc=(3)1