鱼藤酮通过调控JAK_ST...细胞癌细胞增殖、凋亡的影响_马文贤.pdf

收稿日期 修回日期 作者单位 青海省西宁市口腔医院 口腔外科，牙周科，青海 西宁；青海省第五人民医院 口腔科，青海 西宁作者简介 马文贤（），男，主治医师文章编号（）基础医学鱼藤酮通过调控 通路对口腔鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡的影响马文贤，黄 琼，董振耀摘要目的：探究鱼藤酮通过调控酪氨酸激酶 信号转导和转录活化因子（）通路对口腔鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡的影响。方法：将口腔鳞状细胞癌 细胞分为对照组、低浓度鱼藤酮组（）、中浓度鱼藤酮组（）、高浓度鱼藤酮组（）、抑制剂 组（）。法检测各组 细胞活力；克隆形成实验检测 细胞增殖情况；流式细胞术检测 细胞凋亡情况；检测 细胞中增殖、凋亡及通路相关蛋白表达情况。结果：与对照组比较，低浓度鱼藤酮组、中浓度鱼藤酮组、高浓度鱼藤酮组 细胞存活率、克隆细胞数、表达水平呈剂量依赖性显著降低，而凋亡率、表达水平呈剂量依赖性显著增加（），组 细胞存活率、克隆细胞数、表达水平显著降低，而凋亡率、表达水平显著增加（）；与高浓度鱼藤酮组相比，组细胞存活率、克隆细胞数、凋亡率、表达水平差异均无统计学意义（）。结论：鱼藤酮对 细胞增殖的抑制及凋亡的促进可能与抑制 信号通路有关。关键词 口腔鳞状细胞癌；鱼藤酮；酪氨酸激酶 信号转导和转录活化因子 通路中图法分类号 文献标志码 ：，（，；，）：（）：，（），（），（），（），：，（）；，（），（）：；口腔鳞状细胞癌（，）是口腔中最常见的恶性肿瘤之一，在全球癌症中排名第十，已成为世界日益严重的公共卫生问题。尽管放化疗等治疗手段在 治疗中取得极大的进步，但由于其高复发率及转移率，病人的预 ，后仍不容乐观，因此了解其发生机制并开发新型治疗药物十分迫切。鱼藤酮作为一种从豆科鱼藤属植物根中提取到的有毒黄酮类化合物，多作为植物性杀虫剂使用，但近期研究表明其能够抑制肺癌、肝癌等癌细胞的增殖。还有研究 表明鱼藤酮类化合物鱼藤素能抑制头颈部鳞状细胞癌细胞系的增殖。酪氨酸激酶 信号转导和转录活化因子（，）信号通路已被发现其参与癌细胞的增殖、侵袭及肿瘤血管生成，激活该途径可促进 的恶性表型。鱼藤酮已被发现在神经细胞中能够抑制 信号转导，但其是否可通过 信号通路影响 细胞的增殖和凋亡还未可知，因此本研究通过对其探究，以期为鱼藤酮在 中治疗机制的研究提供参考。材料与方法 试剂和仪器 鱼藤酮（货号：）购自上海宝曼生物科技有限公司；细胞系（货号：）购自上海冠导生物工程有限公司；青霉素 链霉素（货号：）购自上海联迈生物工程有限公司；胰酶溶液（货号：）购自武汉博士德生物工程有限公司；胎牛血清（货号：）、培养基（货号：）购自武汉益普生物科技有限公司；、检测试剂盒、蛋白检测试剂盒、标记的山羊抗兔 二抗抗体（货号：、）购自北京百奥莱博科技有限公司；蛋白提取试剂盒（货号：）购自武汉纯度生物科技有限公司；兔抗、（货 号：、）购 自；兔 抗、抗 体（货 号：、）购自；试剂盒（货号：）购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。蛋白免疫印迹成像系统购自赛默飞世尔科技；流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特有限公司。方法 细胞培养 细胞接种到含胎牛血清、青霉素 链霉素 培养基中后置于 、恒温培养箱中培养，更换一次培养基直至细胞融合至左右后通过胰酶消化进行传代。法检测 细胞活力 将 细胞分为对照组、低浓度鱼藤酮组（）、中浓度鱼 藤 酮 组（）、高 浓 度 鱼 藤 酮 组（）、抑制剂 组（），以 个 孔的密度（重复 孔，每孔）在 孔板中培养至对数生长期，分别添加相应剂量鱼藤酮和 培养 后添加（，微升 孔），后弃上清液培养液加入 ，震荡直至 反应结晶充分溶解后在 处测定吸光度（）值，计算 细胞存活率（）（处理组 空白对照组）（对照组 空白对照组）。克隆形成实验检测 细胞的增殖将各组 细胞以 个 孔的密度（重复 孔）接种至 孔板中培养，贴壁后添加相应剂量鱼藤酮和 进行处理，直至培养到克隆细胞肉眼可见后弃上清，多聚甲醛（）进行 固定后结晶紫溶液染色 ，流水冲洗、晾干并随机选取 个视野进行克隆细胞计数（细胞集落 个）。流式细胞术检测 细胞凋亡情况胰酶消化各组已处理培养 后的 细胞，洗涤后调整细胞浓度（个 孔），添加 和 各 后混匀并避光孵育，内于流式仪观察 细胞凋亡情况（）。检测 细胞蛋白表达情况 裂解液于冰上裂解各组 细胞后，通过 蛋白试剂盒检测细胞总蛋白含量；凝胶电泳后低温转移蛋白至 膜上，脱脂奶粉封闭 后，一抗 （兔抗、，）孵育过夜，清洗、标记的山羊抗兔 二抗（）孵育 后于蛋白凝胶成像仪定量分析各蛋白含量（）。统计学方法 采用 检验、单因素方差分析和 检验。结果 法检测鱼藤酮对 细胞活力的影响 与对照组比较，低浓度鱼藤酮组、中浓度鱼藤酮组、高浓度鱼藤酮组 细胞存活率显著降低，且呈剂量依赖性（）；与高浓度鱼藤酮组相比，组细胞存活率差异无统计学意义（蚌埠医学院学报 年 月第 卷第 期）（见表）。表 不同浓度鱼藤酮及 对 细胞活力的影响（）分组细胞存活率 对照组 低浓度鱼藤酮组 中浓度鱼藤酮组 高浓度鱼藤酮组 组 组内 检验：与对照组比较 ；与低浓度鱼藤酮组比较 ；与中浓度鱼藤酮组比较 克隆形成实验检测鱼藤酮对 细胞增殖的影响 与对照组比较，低浓度鱼藤酮组、中浓度鱼藤酮组、高浓度鱼藤酮组 克隆细胞数显著降低，且呈剂量依赖性（）；与高浓度鱼藤酮组相比，组克隆细胞数差异无统计学意义（）（见图、表）。鱼藤酮对 细胞凋亡的影响与对照组比较，低浓度鱼藤酮组、中浓度鱼藤酮组、高浓度鱼藤酮组 细胞早期和晚期凋亡率显著增加，且呈剂量依赖性（）；与高浓度鱼藤酮组相比，组细胞早期和晚期凋亡率差异无统计学意义（）（见表、图）。表 不同浓度鱼藤酮及 对 细胞增殖的影响（）分组克隆细胞数 个对照组 低浓度鱼藤酮组 中浓度鱼藤酮组 高浓度鱼藤酮组 组 组内 检验：与对照组比较 ；与低浓度鱼藤酮组比较，；与中浓度鱼藤酮组比较 鱼藤酮对 细胞中增殖、凋亡相关蛋白表达的影响 与对照组比较，低浓度鱼藤酮组、中浓度鱼藤酮组、高浓度鱼藤酮组 细胞内、表达水平均显著降低，而、表达水平均显著增加，且呈剂量依赖性（）；与高浓度鱼藤酮组相比，组细胞内、表达水平差异均无统计学意义（）（见图、表）。鱼藤酮对 通路相关蛋白表达的影响 与对照组比较，低浓度鱼藤酮组、中浓度鱼藤酮组、高 浓 度 鱼 藤 酮 组 细 胞 内、水平呈剂量依赖性显著降低（）；与高浓度鱼藤酮组相比，组细胞内 、水平差异无统计学意义（）（见图、表）。表 不同浓度鱼藤酮及 对 细胞凋亡的影响（）分组早期凋亡率 晚期凋亡率 凋亡率 对照组 低浓度鱼藤酮组 中浓度鱼藤酮组 高浓度鱼藤酮组 组 组内 检验：与对照组比较，；与低浓度鱼藤酮组比较 ；与中浓度鱼藤酮组比较，讨论 头颈部癌症在世界恶性肿瘤中排名第六，而 占其中的 以上，其最致命的原因是其从形成肿瘤开始，癌细胞就可远程转移至身体其他部位形成新肿瘤，最终导致病人 年预后生存率不足。每年有近 万的 新病人出现，其发生发展是原癌基因的激活和抑癌基因的丧失共同 ，作用的结果。放化疗综合治疗已成为治疗癌症的主要手段，但由于化疗药物耐药性及药物不良反应的出现，导致 病人仍出现五年预后生存不良现象，因此寻找新型治疗药物十分必要。表 不同浓度鱼藤酮及 对 细胞中增殖、凋亡相关蛋白表达的影响（）分组 对照组 低浓度鱼藤酮组 中浓度鱼藤酮组 高浓度鱼藤酮组 组 组内 检验：与对照组比较，；与低浓度鱼藤酮组比较 ，鱼藤酮是从豆科植物中提取出的一种线粒体复合体抑制剂，其已显示出通过诱导肺癌、乳腺癌等癌细胞凋亡而具有抗癌活性。在肺癌 细胞中，鱼藤酮通过促进活性氧生成促进细胞自噬及增加自噬通量。鱼藤酮在结肠癌异体移植小鼠中通过抑制 途径来抑制肿瘤增长及上皮间质转化。神经酰胺水平增加可激活 依赖的蛋白激酶，以此磷酸化，导致细胞自噬的发生，而鱼藤酮类化合物鱼藤素可通过诱导神经酰胺生成来促进 细胞凋 亡。、作为常见的促增殖相关蛋白，而、作为促凋亡相关蛋白，在癌细胞的增殖、凋亡过程中发挥有重要作用。本研究发现，鱼藤酮可呈剂量依赖性降低 细胞存活率、克隆细胞数、表 达 水 平，而 增 加 细 胞 凋 亡 率、表达水平。该结果表明鱼藤酮在 中能够通过抑制癌细胞增殖、促进细胞凋亡，从而起到抗癌作用。表 不同浓度鱼藤酮及 对 通路相关蛋白表达的影响（）分组 对照组 低浓度鱼藤酮组 中浓度鱼藤酮组 高浓度鱼藤酮组 组 组内 检验：与对照组比较 ，；与低浓度鱼藤酮组比较 细胞增殖、凋亡及转移的紊乱是导致肿瘤发生发展的主要引发因素。信号通路在肿瘤中参与细胞增殖、侵袭及血管生成已被多项研究所证明，。作为一种酪氨酸激酶可通过信号转导激活，而 是 家族成员之蚌埠医学院学报 年 月第 卷第 期一，可在细胞质中被 所磷酸化，并转移至细胞核发挥转录因子的作用，。激活可通过促进结直肠癌上皮间质转化增加癌症的发生、化学抗性及癌症干细胞转化的能力。甘草查尔酮 通过抑制 信号通路来诱导 凋亡，抑制细胞生长。有研究发现，鱼藤酮在神经细胞中可抑制干扰素 介导的 的激活。本研究发现，鱼藤酮能够显著降低、表达。该结果表明，在 中，鱼藤酮可能通过抑制 及 的磷酸化来抑制 信号通路的激活。本研究还发现，与高浓度鱼藤酮组相比，组细胞存活率、克隆细胞数、表 达 水 平、细 胞 凋 亡 率、表达水平差异无统计学意义。该结果表明，鱼藤酮与 作用效果相同，鱼藤酮对 细胞增殖的抑制和凋亡的促进可能与其抑制 信号通路有关。综上所述，鱼藤酮可能通过抑制 信号通路来抑制 细胞的增殖和促进细胞凋亡，以此在 中起到抑癌作用。本研究不仅对鱼藤酮在 中的治疗机制研究具有重要意义，还对疾病新型治疗药物的寻找具有一定参考价值，但关于鱼藤酮在 中对该通路下游机制的影响还需进一步研究。参考文献，：，（）：王晓乐，贾荣 口腔鳞状细胞癌患者年龄分布与肿瘤分子标记物的关系研究 口腔医学研究，（）：，（）：，（）：何海，姜志辉，周杏子，等 新型含游离羟基鱼藤素衍生物的合成及其抗肿瘤活性 合成化学，（）：，（）：，（）：，（）：肖美芳，陆喆，陈柳英，等 木犀草素通过调控 信号通路对 细胞增殖和凋亡的影响 中成药，（）：，（）：李玮柏，曹娟，刘璐瑶，等 口腔鳞状细胞癌发病机制及药物干预的研究进展 中国医药导报，（）：，（）：储菲，姚扬，李正红 黄连素对 诱导的肺癌 细胞侵袭和迁移的影响 蚌埠医学院学报，（）：，（）：，（）：，（）：王一祺，徐明，修文超 丹参酮联合大黄素通过 信号通路抑制结直肠癌细胞增殖，迁移的实验研究 中国现代普通外科进展，（）：余灵芝，戴丹平，项秀瑶 通过抑制 信号通路逆转结肠癌细胞 耐药性的研究 世界华人消化杂志，（）：，（）：，（）：，（）：（本文编辑 周洋），