显微拉曼光谱法检测紫菜中5种微塑料_颜春荣.pdf

292 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食品安全与检测2023年 第48卷 第04期收稿日期：2022-11-03基金项目：江苏省市场监督管理局科技计划项目(KJ207543)。作者简介：颜春荣(1977)，女，山东济宁人，硕士研究生，高级工程师，研究方向为食品安全检测技术。颜春荣，高惠敏，王少伟，徐春祥(江苏省食品药品监督检验研究院，江苏 南京 210008)摘要：目的：微塑料因生物传递和生物富集效应，成为食品链中的新型持久性污染物。通过对前处理方法和检测条件进行优化，建立紫菜中聚对苯二甲酸乙二酯、聚碳酸酯、聚丙烯、高密度聚乙烯、聚氯乙烯5种微塑料的显微拉曼光谱测定方法。方法：1 g紫菜先用纤维素酶于65 酶解12 h，再于10%氢氧化钾溶液中65 消解48 h，用钨酸钠饱和溶液进行悬浮，溢流法收集后过银滤膜，使用显微拉曼光谱面扫描模式进行扫描，多组分分布成像分析法处理数据。结果：紫菜消解率为94.2%，除聚氯乙烯加标回收率为65.1%，其余4种微塑料的加标回收率均高于91.2%，紫菜中5种微塑料均能实现准确定性及可视化计数，最低检测粒径为10 m。结论：建立的方法具有回收率高、定性准确、检测粒径小的优点，适用于紫菜中5种微塑料的定性检测和可视化计数。关键词：紫菜；微塑料；前处理；显微拉曼光谱中图分类号：O657.3 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2023)04-0292-06Detection of 5 Microplastics in Seaweed Nori Based on Micro-Raman SpectraYAN Chunrong,GAO Huimin,WANG Shaowei,XU Chunxiang(Jiangsu Institute for Food and Drug Control,Nanjing 210008,China)Abstract:Objective:Microplastics(MPs)has been the new persistent pollutant in food web due to their biotransfer and bioaccumulation effects.The micro-Raman spectra based measuring method for 5 MPs,including polyethylene terephthalate(PET),polycarbonate(PC),polypropylene(PP),high density polyethylene(HDPE)and polyvinyl chloride(PVC),in Seaweed Nori was established through optimizing the sample preparation and analysis processes.Methods:1 g Seaweed Nori was digested by cellulase at 65 for 12 h followed by 10%potassium hydroxide solution at 65 for 48 h,then was suspended by sodium tungstate saturated solution,solutions were collected by overflow method and filtered by silver membrane.The region scan mode of micro-Raman spectra involved MCR analysis was used to detect the pretreated sample.Results:The sample digesting rate was 94.2%,the spiked recovery of 4 MPs was above 91.2%except that of PVC,which was 65.1%,5 MPs could be identified accurately and be counted visibly.显微拉曼光谱法检测紫菜中5种微塑料DOI:10.13684/ki.spkj.2023.04.035 293 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食品安全与检测2023年 第48卷 第04期0 引言2016年，微塑料被联合国环境大会列为全球性重大环境问题之一1，微塑料已被证明在海洋、土壤、人体和食物链中普遍存在，作为一种新型持久性传染物越来越受到全世界关注2-7。由于缺乏统一的检测方法标准和食品中最低限量标准，目前各国食品法规尚未把微塑料作为强制性管理的污染物质。HERMSEN E等8提出海洋生物样本中微塑料检测的初步标准化，应包括取样方案、样品大小、样品处理和储存、预处理、环境条件、阴性对照、阳性对照、目标物组成、前处理和鉴定方法等10个要素，才能获得可靠的、具有比较价值的数据。食品中微塑料的检测面临2个难题：一是样品前处理，二是定性定量检测方法。微塑料在食品中并不像化学污染物一样均匀分布，而是以颗粒、条状、丝状等不规则形状聚集存在，海洋中生长的紫菜、海带等海藻类食品，在生产过程中，可通过黏附、包裹、嵌入、缠绕、浮生生物等方式截留微塑料9。同时食品样品中丰富的有机物和无机矿物质颗粒，会影响仪器分析结果。选择合适的消解和分离方法，充分释放样品中的微塑料，有效去除影响仪器检测的杂质，是提高检测准确性的关键10-11。食品样品中微塑料的提取主要有化学消解法和酶消解法。DEHAUT A等12比较了不同方法从海产品中提取15种类型微塑料的提取效果和提取效率，发现10%KOH在60 提取24 h可以取得比较理想的提取结果。吴文楠等13发现10%KOH溶液消解鱼肉及内脏后没有残留生物组织，处理后微塑料的拉曼光谱峰会产生一些偏移，但不影响与参考物质的匹配。微塑料的分离和去杂质方法直接影响仪器检测的效率。密度分离法可利用沉积物样品中目标组分与杂质的密度差异实现轻组分微塑料与重组分杂质的分离，常用饱和氯化钠(NaCl)溶液进行分离，另外选用密度更大的碘化钠溶液或氯化锌溶液可提高对高密度组分的提取效率，但是也会相应增加分析成本14-15。微塑料消解后经滤膜过滤较密度分离法可有效节约时间提高分离效率。李珊等16对6种滤膜从孔径、价格、使用感受等方面进行了性能比较，并通过纯水加标试验对6种滤膜上PVC微粒的平均截留率和平均洗脱率等数据进行分析，最终推荐不锈钢滤膜用于饮用水中微塑料检测过滤过程。除此之外还有氧化铝膜或者添加金属镀层的滤膜，但成本昂贵，用于日常检测具有一定的局限性。微塑料检测设备通常有傅里叶红外光谱仪、拉曼光谱仪、热分析仪、液相色谱-质谱联用仪等，这些检测方法各有利弊16-21。其中红外光谱仪和拉曼光谱目前应用较广泛，与红外光谱检测粒径下限(75 m)相比，显微-拉曼技术能提供更小粒径下限(15 m)的需求21。PRATA J C等22运用显微拉曼技术成功识别出使用聚乙烯瓶塞的白葡萄酒中的微塑料颗粒。肖宇等23通过抽滤方法，分离并富集饮用水中微塑料，用显微拉曼光谱仪测得粒径20 m的聚乙烯碎片。显微拉曼光谱法回收率高、能检测更小的粒子，但对样品前处理、过滤装置以及拉曼光谱仪参数设置的要求也较高。本文针对紫菜中微塑料的前处理和显微拉曼光谱检测法开展研究，以期为微塑料的监测和管理提供技术支持。1 材料与方法1.1 主要材料样品：市售预包装干紫菜；聚对苯二甲酸乙二酯(Polyethylene terephthalate，PET)、聚碳酸酯(Polycarbonate，PC)、聚丙烯(Polypropylene，PP)、高密度聚乙烯(High density polyethylene，HDPE)、聚氯乙烯(Polyvinyl chloride，PVC)粉末：粒径5100 m，山东优索化工科技有限公司；玻璃纤维滤膜：美国Pall公司；银滤膜：美国Sterlitech公司；有机滤膜(材质为尼龙，Polyamide)：上海安谱实验科技股份有限公司；硝酸纤维素滤膜：上海兴亚净化材料厂，4种滤膜规格均为孔径1 m，直径47 mm。1.2 试剂氢氧化钾(KOH)、氯化钠(NaCl)、二水合钨酸Conclusion:With the advantages of high recovery rate,accurate identification and smaller detecting particle size,the developed method in this study is applicable for determination of 5 MPs in Seaweed Nori.Key words:Seaweed Nori;microplastics;pretreatment;micro-Raman spectra 294 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食品安全与检测2023年 第48卷 第04期钠(Na2WO42H2O)、过氧化氢(H2O2)30%溶液：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；纤维素酶冻干粉(10000 u/g，使用时配制成1 mg/mL的溶液，用柠檬酸调节pH值至5.0)、胰蛋白酶冻干粉(4000 u/g，使用时配制成2mg/mL的溶液)：南宁庞博生物工程有限公司。1.3 主要仪器与设备D X R x i 显 微 拉 曼 成 像 光 谱 仪：美 国Thermofisher公司；HS-7磁力加热搅拌器：德国IKA公司；VF205A真空抽滤装置：德国Wiggens公司。1.4 样品前处理1.4.1 样品消解 取100 g干紫菜，剪成小于5 mm的小段，混合均匀备用。每个方案设2个平行样品。称取1.0 g样品于200 mL具塞玻璃锥形瓶中，分别采用10%KOH溶液、30%H2O2溶液、纤维素酶和胰蛋白酶的6种不同组合方案，于设定温度下以140 r/min的速率振荡消解。消解结束后，观察样品状态并进行消解率评价。将样品全部转移到抽滤杯中，过孔径为1 m的银滤膜，用300 mL蒸馏水分3次冲洗滤膜，将抽干后的滤膜置于60 干燥箱2 h，滤膜上截留的样品代表未完全消解的样品，以过滤后滤膜质量L减去过滤前滤膜质量L0代表未完全消解的样品质量，样品称样量为M0，消解率X计算公式如下：X(%)=(M0(LL0)100/M01.4.2 浮选与过滤 密度分离法是利用样品中目标组分与杂质的密度差异实现轻组分微塑料与重组分杂质的分离，即如果消解后的溶液中含有未消解的高密度颗粒(如沙子、骨头、几丁质等)，可用高密度溶液进行分离。分别称取5种微塑料粉末20 mg添加到称有1.0 g样品的200 mL具塞玻璃锥形瓶中，按照1.4.1选定的方案进行消解。每种微塑料设2个平行样和1个空白对照，空白对照不添加微塑料，其他同样品处理。将消解后的样品全部转移至250 mL烧杯中。再将烧杯置于磁力搅拌器上，每组分别加入悬浮试剂(90 g氯化钠或225 g二水合钨酸钠)进行对比，500 r/min搅拌至完全溶解，静置24 h，采用溢流法将烧杯上层微塑料转移到真空抽滤杯中24，过孔径为1 m的银滤膜，同时用300 mL蒸馏水分3次冲洗滤杯壁和滤膜，使微塑料全部转移到滤膜上。将抽干后的滤膜于60 干燥2 h，过滤面朝上保存于带盖玻璃皿中备测。以过滤前后滤膜的质量差与微塑料添加量的百分比作为添加回收率。1.5 拉曼光谱检测1.5.1 滤膜背景检测 滤膜作为微塑料拉曼光谱检测的载体，为获得较高质量的拉曼光谱，应选用对背景和信号干扰较小的材质。本文选择玻璃纤维滤膜、硝酸纤维素滤膜、银滤膜、有机滤膜为研究对象，用拉曼光谱对膜进行点扫描测定，评价其信号是否对微塑料检测造成干扰。仪器参数为：10X物镜，反射模式，激发光源532 nm，激光功率10 mW，狭缝25 m，曝光时间0.1 s，扫描数量100个。1.5.2 样品中微塑料拉曼光谱检测 将5种微塑料对照品置于载玻片上，用拉曼光谱点扫描模式，采集对照品光谱图，并导入谱库。样品中添加的5种微塑料粉末经悬浮、过滤和干燥后，使用显微拉曼成像光谱仪进行拉曼光谱面扫描，采用多组分分析法进行分析。2 结果与分析2.1 消解方案的选择为充分分离紫菜中的微塑料，需要对其生物组织进行消解。由表1数据可知，方案D1和D2未使用纤维素酶，消解率较低。D3和D5消解方案消解率较高，其中D5增加了胰蛋白酶消解步骤，但消解率并没有明显提高，说明紫菜样品经过纤维素酶的消解，破坏其细胞壁，在10%KOH溶液的作用下即可实现完全消解。D4和D6中酶和30%H2O2溶液组合方案的消解率偏低是因为体系中H2O2溶液的浓度被稀释，氧化效果减弱。因此选择D3纤维素酶和KOH溶液组合方案作为紫菜最佳消解方案。2.2 添加回收率为在浮选收集过程中获得更高的回收率，选择合适的浮选试剂很重要。选用氯化钠和二水合钨酸钠进行对比，5种微塑料的回收率见表2。其中PP、HDPE、PC的回收率在使用2种悬浮试剂时均高于98.2%；PVC由于自身密度较大，在Na2WO4作为悬浮试剂时回收率为65.1%，明显高于NaCl作为悬浮剂时的46.2%；PET在Na2WO4作为悬浮剂时回收率为91.2%，高于NaCl作为悬浮剂时的85.3%，所以选择Na2WO4作为悬浮试剂。295 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食品安全与检测2023年 第48卷 第04期表1 紫菜样本消解结果消解方案编号消解试剂及步骤消解后样品状态消解率/%D1加入10%KOH溶液100 mL，65 水浴，振荡48 h消解液绿色澄清，样品呈片状，残留较多51.0D2加入30%H2O2溶液100 mL，65 水浴，振荡48 h消解液无色澄清，样品呈片状，残留较多74.8D3加入纤维素酶溶液50 mL，于65 水浴，振荡12 h，加入20%KOH溶液50 mL，继续消解48 h。消解液绿色澄清，有微量粉末状沉淀94.2D4加入纤维素酶溶液50 mL，于65 水浴，振荡12 h，加30%H2O2溶液100 mL，继续消解48 h消解液无色澄清，有少量片状沉淀84.1D5加入纤维素酶溶液50 mL，于65 水浴，振荡12 h。加入胰蛋白酶溶液50 mL，于37 水浴振荡6 h。加入20%KOH溶液100 mL，于65 继续振荡消解48 h。消解液绿色澄清，有微量粉末状沉淀94.4D6加入纤维素酶溶液50 mL，于65 80 r/min水浴震荡12 h。加入胰蛋白酶溶液50 mL，于37 水浴振荡6 h。加入30%H2O2溶液100 mL，于65 继续消解48 h。消解液无色澄清，有少量絮状沉淀78.0表2 悬浮试剂处理后的微塑料添加回收率微塑料名称 采用Na2WO4的回收率/%采用NaCl的回收率/%PP100.0100.0PET91.285.3PVC65.146.2HDPE100.298.2PC98.299.22.3 显微拉曼光谱测定结果2.3.1 滤膜的拉曼光谱测定 图1图4为4种滤膜的拉曼光谱图。由图1可知，银膜的拉曼光谱点扫描谱线较平整，无明显波峰，对微塑料检测影响较小。有机滤膜(图2)在2900 cm1和850 cm1处，硝酸纤维素滤膜(图3)在2900、1250 cm1和850 cm1处，存在干扰微塑料检测的拉曼响应，所以不适用于微塑料检测。图4中玻璃纤维滤膜的拉曼信号噪音较大，虽然没有明显的波峰，但有研究25提出玻璃纤维膜表面为杂乱排序的纤维基质，参差不平，导致被截留的较小颗粒极有可能隐藏在滤膜内部，无法被识别；当采用面扫模式，滤膜的不平整使得各颗粒物不在同一水平面上，不能全部清晰对焦，图像效果欠佳。金属材料没有红外反射和拉曼散射，是优质的背景材料，OSSMANN B E等26证明金属镀层作为显微拉曼光谱的检测基质可以呈现出理想的效果。本研究结果表明银滤膜最适合用于微塑料的过滤和检测。图1 银滤膜拉曼光谱图图2 有机滤膜拉曼光谱图图3 硝酸纤维素滤膜拉曼光谱图图4 玻璃纤维滤膜拉曼光谱图 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600Int 500 1000 1500 2000 2500 3000 拉曼光谱/cm-1-90-70-50-30-10 10 30 50 70 90Int 500 1000 1500 2000 2500 3000 拉曼光谱/cm-1-10 10 30 50 70 90 110 130 150 170Int 500 1000 1500 2000 2500 3000 拉曼光谱/cm-1-2 2 6 10 14 18 22 26 30Int 500 1000 1500 2000 2500 3000 拉曼光谱/cm-1 296 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食品安全与检测2023年 第48卷 第04期2.3.2 5种微塑料对照品点扫描谱图 图5图9为5种微塑料对照品的拉曼光谱图，均具备明显的特征峰，使用软件的Library search(谱库搜索)功能，匹配度均在90%以上。点扫描模式可用于微塑料单点的定性检测。2.3.3 5种微塑料面扫描拉曼成像分析结果 样品经银滤膜过滤干燥后，置于显微镜载物台上，截取0.8 mm0.8 mm的区域进行面扫描。经多组分分布分析法处理的面扫描图像，可以分别看到各组分的分布和尺寸，易于计数，区域内检测到到PP颗粒7个、PC颗粒3个、PET颗粒6个、HDPE颗粒1个、PVC颗粒3个，粒径在10100 m之间。样品中5种微塑料拉曼光谱图与谱图库中结果一致，说明微塑料在消解处理和基质的影响下，仍然与谱库中谱图匹配度较高，可实现准确定性。由于拉曼光谱面扫描耗时较长，难以对整张滤膜上所有的点进行扫描。有研究采用在滤膜上取3个或5个检测点，用检测点的微塑料数量乘以滤膜总面积与所有检测点面积之和的比值，以所得结果代表整张滤膜上微塑料的结果16,25，但由于微塑料在滤膜上并非均匀分布，这种定量结果表达方法存在较大误差，微塑料的准确定量有待进一步研究。2.4 质量控制塑料在环境中广泛分布，采取措施避免试验过程中实验器具、环境沉降等外源干扰因素非常重要27-28，本研究采取以下防护措施：(1)取样和试验过程中所有器具，均为不锈钢、硅胶或玻璃材质；所有试验中用到的器皿都用75%乙醇溶液清洗后再用蒸馏水润洗3遍。(2)试验人员始终穿着纯棉实验服，使用丁腈无粉手套。(3)在每个单独步骤后，所有材料和容器均用玻璃盖或铝箔纸覆盖开口，所有操作在通风橱中进行，以避免带入外源微塑料。(4)在每组试验中设置空白对照，除不加入紫菜外，其余操作均一致，以监控实验室环境和试剂中可能存在的微塑料污染，结果均未观察到。3 结论纤维素酶消解和碱消解相结合的方案对紫菜消解效率最高，1 g紫菜消解率为94.2%。采用钨酸钠饱和溶液为悬浮液，溢流法收集，银滤膜过滤处理的样本，回收率最高，对仪器干扰最低，适用于显微拉曼光谱检测。通过拉曼光谱面扫描成像结合多组分分布分图5 HDPE对照品的点扫描拉曼光谱图图6 PET对照品的点扫描拉曼光谱图图图7 PP的点扫描拉曼光谱图图8 PC的点扫描拉曼光谱图图9 PVC的点扫描拉曼光谱图 200 600 1000 1400 1800 2200 2600 3000 3400 3800 4200Int 500 1000 1500 2000 2500 3000 拉曼光谱/cm-1-2000 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000Int 500 1000 1500 2000 2500 3000 拉曼光谱/cm-1 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500Int 500 1000 1500 2000 2500 3000 拉曼光谱/cm-1 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000Int 500 1000 1500 2000 2500 3000 拉曼光谱/cm-1 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000Int 500 1000 1500 2000 2500 3000 拉曼光谱/cm-1 297 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食品安全与检测2023年 第48卷 第04期析法，可以实现扫描区域内5种微塑料的准确定性和可视化计数，测得最小粒径为10 m。参考文献：1蓝益添,陈星霖,刘漫琳,等.微塑料对淡水鱼生长的影响研究J.生物学通报,2019,54(5):50-52.2THOMPSON R C,OLSEN Y,MITCHELL R P,et al.Lost at sea:where is all the plastic?J.Science,2004,304(5672):838.3MU H Y,WANG Y P,ZHANG H N,et al.High abundance of microplastics in groundwater in Jiaodong peninsula,ChinaJ.Science of the Total Environment,2022,839:156318.4CONTI G O,FERRANTE M,BANNI M,et al.Micro-and nano-plastics in edible fruit and vegetables.The First Diet Risks Assessment for the General PopulationJ.Environmental 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