SDS-PAGE-聚丙烯酰胺凝胶电泳详解演示课件.ppt

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳,SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE,1,一、什么是,SDS？,十二烷基硫酸钠（,sodium dodecyl sulfate,SDS),是一种阴离子去污剂。它在水溶液中以单体,（,monomer）,和分子团（,micellae）,的混合形,式存在。,2,SDS,的作用,破坏,蛋白质分子之间以及其他物质分子之间的,非共价键,，使蛋白质变性而改变原有的构象，保证蛋白质分子与,SDS,充分结合而形成带负电荷的,蛋白质-,SDS,复合物,。,3,二、,SDS-PAGE,的基本原理,（一）蛋白质分子的解聚,样品介质和聚丙烯酰胺中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于,亚基分子量的大小,，而电荷因素可以被忽略。,4,1、,SDS,阴离子去污剂 变性剂 助溶性试剂 断裂分子内和分子间的氢键 分子去折叠 破坏蛋白质分子的二级和三级结构,5,2、强还原剂 巯基乙醇（,-mercaptoethanal）,二硫苏糖醇（,dithiothreitol，DTT）,使半胱氨酸残基之间的,二硫键,断裂。,6,7,SDS,和还原剂的作用：（1）,分子被解聚,或组成它们的多肽键（2）氨基酸侧链与,SDS,充分结合,形成,带负 电荷的,蛋白质-,SDS,胶束,。（3）蛋白质-,SDS,胶束所带的负电荷大大超 过了蛋白质分子原有的电荷量，,消除,了不同分子之间原有的,电荷差异,。,8,蛋白质-,SDS,胶束的特点（1）形状像一个长椭圆棒（2）短轴对不同的蛋白质亚基-,SDS,胶束基本上是相同的。（3）,长轴的长度,则与亚基分子量的大小成正比。,9,胶束在,SDS-PAGE,系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要,取决于椭圆棒的长轴长度,，即蛋白质或亚基分子量的大小。当蛋白质的分子量在,15,KD200KD,之间时，,电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系,10,3、影响,SDS,电泳的关键因素（1）溶液中,SDS,单体浓度（,1mmol/L),大多数蛋白质与,SDS,结合的重量比为,1：1.4,（2）样品缓冲液的离子强度（不,0.26),低离子强度,的溶液中，,SDS,单体才具有较高的平衡浓度。,11,（3）二硫键是否完全被还原 当二硫键被,彻底还原,后，蛋白质分子才能,被解聚,，,SDS,才能定量地结合到亚基上而给出相对迁移率和分子量对数的线性关系。,12,（二）缓冲系统的选择 一般情况下，在被分析的蛋白质稳定的,pH,范围，凡,不与,SDS,发生相互作用,的缓冲液都可以使用，但缓冲液的选择对蛋白质的分离和电泳的速度是非常关键的。,13,电泳缓冲液的种类：1、磷酸缓冲液2、,Tris-,醋酸钠缓冲系统3、咪唑缓冲液系统：比磷酸缓冲系统的导电性低，电泳速 度要比后者快一倍。4、尿素系统：适用分子量低于15,KD,的蛋白样品。5、,Tris-,甘氨酸,系统：使用最多的缓冲液6、,Tris-,硼酸盐缓冲液：测定糖蛋白的分子量,14,（三）凝胶浓度的选择 由于,SDS,电泳分离并不取决于蛋白质的电荷密度，只取决于分子解聚后,SDS-,蛋白质胶束的大小，因此凝胶浓度的选择会直接影响分辨率。不同分子量范围的蛋白质应选用,不同的凝胶浓度.,15,16,17,18,19,（四）分子量测定1、相对迁移率（,Rf）Rf,即用每个带的迁移距离除以溴酚蓝前沿的迁移距离得到的。测量位置应在蛋白带的中央。蛋白带迁移距离,Rf=,溴酚蓝迁移距离,20,蛋白带迁移距离 固定前的凝胶长度,Rf=X ,干燥后的凝胶长度 溴酚蓝迁移距离,21,2、作图 以已知蛋白质分子量的常用对数值为纵坐标，,Rf,为横坐标绘图,22,23,3、通过测定未知蛋白质的,Rf,值，便可在标 准曲线上读出他的分子量,24,三、去污剂的选择无离子去污剂：,Lubro W；Brij35，Tween Triton,阳离子去污剂：,cetyltrimethyl ammonium bromide（CTAB）cetylpyyridinium（CPC）,阴离子去污剂：,SDS deoxycholate,25,四、方法1、分类（1）根据对样品的处理方式的不同 还原,SDS,电泳 非还原,SDS,电泳 带有烷基化作用的还原,SDS,电泳,26,（2）根据缓冲系统和凝胶孔径的不同 连续电泳 不连续电泳（3）根据电泳的形式 圆盘电泳 垂直电泳 平板电泳 水平电泳,27,28,29,30,2、操作（1）制备分离胶（2）制备积层胶(堆积胶）,31,32,33,34,35,36,分离胶聚合之后,37,38,39,40,41,42,43,（3）加样品,样品的处理 在蛋白溶液中加入过量的,SDS,后，可引起以下的反应：蛋白质,本身的电荷被屏蔽,氢键断裂 疏水相互作用被取消 多肽被去折叠(二级结构破坏),并形成椭球形,44,还原,SDS,处理,当加入还原试剂,DTT,或,-,二巯基乙醇后，蛋白质被,完全去折叠,，只根据分子量分离。,45,带有烷基化作用的还原,SDS,处理,烷基化作用,可以很好地并经久牢固地保护,SH,基团，而得到窄的电泳带。,46,非还原的,SDS,处理,许多样品，如生理体液、血清或尿素，一般只需用1%,SDS,在100煮沸3分钟，并不需要加还原剂，此时二硫键不能被断裂，蛋白并没有完全被去折叠。,47,（4）电泳,（5）固定,48,（6）染色考马斯亮蓝（,coomassie brilliant blue）R-250,三苯基甲烷，红蓝色，每个分子含有两个,SO,3,H,基团，偏酸性，和氨基黑一样也是结合在蛋白质的碱性基团上。,49,50,G-250,二甲花青亮蓝，蓝绿色。,51,52,银染色 银染的机制是将蛋白带上的硝酸银（银离子）,还原成金属银,，以使银颗粒沉积在蛋白带上。,53,54,（7）照相，凝胶干燥,（8）定量测定,55,3、电泳过程中的不正常现象（1）,“微笑”现象,指示剂前沿呈现两边向上的曲线形，说明凝胶的,不均匀冷却,，中间部分冷却不好。,56,（2）,“皱眉”现象,由于垂直电泳槽的,装置不合适,引起的，特别是当凝胶和玻璃板组成的“三明治”底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全。,57,58,（3）“拖尾”现象,样品溶解不佳,引起。,59,（4）“纹理”现象,由于样品中的,不溶颗粒,引起的。,60,（5）偏斜现象,电极放置不平行,引起或,加样位置偏斜,而引起,61,（6）带太宽 加样,量太多,或加样,孔泄漏,引起,62,63,64,Molecular mass versus molecular weight,Molecular mass(symbol m)is expressed in Daltons(Da).One Dalton is defined as 1/12 the mass of carbon 12.Most macromolecules are large enough to use the kiloDalton(kDa)to describe molecular mass.Molecular weight is not the same as molecular mass.It is also known as relative molecular mass(symbol Mr,where r is a subscript).Molecular weight is defined as the ratio of the mass of a macromolecule to 1/12 the mass of a carbon 12 atom.It is a dimensionless quantity.,When the literature gives a mass in Da or kDa it refers to molecular mass.It is incorrect to express molecular weight(relative molecular mass)in Daltons.Nevertheless you will find the term molecular weight used with Daltons or kiloDaltons in some literature,often using the abbreviation MW for molecular weight.,65,