生脉散对2型糖尿病模型大鼠糖脂代谢和肠道菌群的影响_丘文龙.pdf

第 41 卷第 2 期2023 年 4 月广东医科大学学报JOURNAL OF GUANGDONG MEDICAL UNIVERSITYVol.41 No.2Apr.2023127生脉散对 2 型糖尿病模型大鼠糖脂代谢和肠道菌群的影响丘文龙1，彭瑜威1，杨心怡1，谭晓君1，张雪杨1，赵文昌1，吴都督1，卢洪梅2，刘小柳3，阮永队2*，陈稚1*（1.广东医科大学药学院，广东东莞 523808；2.广东医科大学附属东莞第一医院，广东东莞 523710；3.中国深圳市深圳罗湖人民医院医学实验室，广东深圳 518001）摘要：目的探索生脉散对 2 型糖尿病（T2DM）模型大鼠糖脂代谢和肠道菌群的影响。方法采用腹腔注射低剂量链脲佐菌素（STZ）联合高糖高脂饲料喂养的方法，建立T2DM 胰岛素抵抗大鼠模型。将大鼠分为正常组、模型组、二甲双胍组、辛伐他汀组、生脉散低、中、高剂量组，连续给药 6 周后，检测其空腹血糖（FBG）、空腹胰岛素（FINS）、糖化血红蛋白（HbAlc）水平，以及总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的水平；并采用 16srDNA 高通量测序检测大鼠肠道菌群组成和结构，采用高效液相色谱法检测大鼠粪便中短链脂肪酸（SCFAs）含量变化情况。结果生脉散各剂量组均可降低 2 型糖尿病大鼠FBG、FINS、HbAlc 等血糖指标（P0.01或 0.05），降低血脂指标中TC、TG、LDL-C 的水平（P0.01），升高HDL-C 的水平（P0.01）。此外，生脉散的干预，可以恢复模型组的OUTs 数目，提高Chao1、Shannon 与Simpson 指数（P0.01），升高厚壁菌门、拟杆菌门和疣微菌门的丰度（P0.01），降低放线菌门和变形菌门的丰度（P0.01 或 0.05），并促进SCFAs 的分泌。结论生脉散可改善T2DM 模型大鼠糖脂代谢，其机制可能与改善肠道菌群的组成和结构有关。关键词：生脉散；2 型糖尿病；大鼠；糖脂代谢；肠道菌群中图分类号：R 258.5 文献标志码：A 文章编号：2096-3610（2023）02-0127-06Effect of Shengmai San on glucolipid metabolism and intestinal flora in type 2 diabetes model ratsQIU Wen-long1,PENG Yu-wei1,YANG Xin-yi1,TAN Xiao-jun1,ZHANG Xue-yang1,ZHAO Wen-chang1,WU Du-du1,LU Hong-mei2,LIU Xiao-liu3,YUAN Yong-dui2*,CHEN Zhi1*(College of Pharmacy,Guangdong Medical University,Dongguan 523808,China;2.The First Dongguan Affiliated Hospital of Guangdong Medical University,Dongguan 523710,China;3.Medical Laboratory,Shenzhen Luohu People s Hospital,Shenzhen 518001,China)Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of Shengmai San on glucolipid metabolism and intestinal flora in type 2 diabetes model rats.MethodsAn insulin-resistant type 2 diabetic rat model was established with the method of intraperitoneal injection of low-dose streptozotocin(STZ)combined with high-sugar and high-fat feed.The rats were divided into the Control Group,the Model Group,the Metformin Group,the Simvastatin Group,and Shengmai San Low-Dose,Medium-Dose and High-Dose Groups.After 6 weeks of continuous administration,the fasting blood glucose(FBG),fasting insulin(FINS),and glycosylated hemoglobin(HbAlc)levels as well as total cholesterol(TC),triglyceride(TG),high-density lipoprotein cholesterol(HDL-C)and low-density lipoprotein cholesterol(LDL-C)levels were detected.The composition and structure of intestinal flora of rats were detected with 16s rDNA high-throughput sequencing,and the content of short-chain fatty acids(SCFAs)in feces of rats was detected by high performance liquid chromatography.ResultsIn all Shengmai San groups,the FBG,FINS,HbAlc and other blood glucose indexes of type 2 diabetic rats were all decreased(P0.01 or 0.05),the TC,TG and LDL-C levels among blood lipid indexes were all reduced(P0.01),and the HDL-C level was increased(P0.01).收稿日期：2022-11-10基金项目：广东省自然科学基金(2021B1515140020,2019A1515110017),广东省中医药厅科技基金(20212100),东莞科技特派员项目(20201800500062),广东医科大学科技基金(GDMUZ2020006),广东省医学科研基金(B2021056),东莞市社会发展科技项目(20211800905542),广东医科大学学科建设项目(4SG21229GDGFY01,4SG21006)作者简介：丘文龙（2000-），男，在读硕士研究生，E-mail: 彭瑜威（1999-），男，在读硕士研究生，E-mail:，为共同第一作者通信作者：陈稚（1979-），女，博士，副教授，E-mail: 阮永队（1966-），男，硕士，主任中医师，E-mail:，为共同通信作者广东医科大学学报1282023年 第41卷In addition,the intervention of Shengmai San could restore the number of OUTs in the Model group,increase the Chao1,Shannon and Simpson indexes(P0.01),increase the abundance of firmicutes,bacteroidetes and warthomicrophyla(P0.01),reduce the abundance of actinobacteria and proteobacteria(P0.01 or 0.05),and promote the secretion of SCFAs.ConclusionShengmai San can improve glucolipid metabolism in type 2 diabetes rats,and the mechanism may be related to improvement of composition and structure of intestinal flora.Key words:Shengmai San;type 2 diabetes;rats;glucolipid metabolism;intestinal flora2 型糖尿病（T2DM）是危害人类健康的重大疾病，其病死率在肿瘤、心血管之后居第三位，是目前备受全球关注的公众卫生问题。在我国T2DM 的患病率高达 11.6%，T2DM 的防治已成为研究热点1-2。目前T2DM 的发病机制较为复杂，但普遍认为胰岛素抵抗是T2DM 的主要发病机制。而肠道菌群与糖尿病的发生、发展密切相关，肠道菌群在胰岛素抵抗的发生、发展过程中发挥了至关重要的作用3-6。因此，靶向调控肠道菌群及其代谢产物，调节肠道菌群的稳态，被认为是治疗T2DM 的有效手段。另外，在中医理论中，糖尿病属于“消渴病”范畴，是以气阴虚弱为本，燥热炽盛为标的一种慢性发展性疾病。不少研究表明，生脉散能有效改善胰岛素抵抗，明显改善T2DM 患者的临床症状和体征7-9。目前生脉散改善胰岛素抵抗的作用机制并未明了，本研究将从肠道微生态的角度探讨生脉散调节糖脂代谢治疗 T2DM 的可能作用机制，旨在为其临床应用提供理论和实验依据。1材料和方法1.1材料1.1.1动物选择SD 大鼠 70 只，雄性，SPF 级，身体质量（100.010.0）g，由广东医科大学院动物实验中心提供，许可证号码SCXK（粤）2013-0008。所有动物均在无病原体的环境中饲养并随意喂食。照顾和使用动物的程序得到广东医科大学动物中心伦理委员会的批准，并遵守了有关动物道德使用的所有适用的机构和政府法规。1.1.2药物与试剂受试药物：生脉散，药物组成按照普通高等教育中医药类规划教材 方剂学 第五版所载:人参、麦冬、五味子按 332 比例组成，本实验中取人参 9 g、麦冬 9 g、五味子 6 g，以上药物麦冬和五味子以 10 倍量水煎煮 1.5 h 后，人参 10 倍水另煎 1.5 h 后滤出药液和其余药物药液混合、过滤，浓缩至 0.5 g/mL。用药剂量依据 2015 年版 中华人民共和国药典，根据人和动物体表面积折算的等效剂量比率表计算，用药总量为 200 mg/kg，将该剂量设为中剂量，低、中、高剂量分别为 50.0、200.0、400.0 mg/kg。对照药物：（1）盐酸二甲双胍，250 mg/片，河北天成药业有限公司，国药准字H20031134，按照临床常用剂量换算后给动物灌服，剂量为 4.0 mg/kg；（2）辛伐他汀，20 mg/片，浙江京新药业股份有限公司，国药准字H20000009，按照临床常用剂量换算后给动物灌服，剂量为 0.32 mg/kg。采用葡萄糖氧化酶测定试剂盒、胰岛素放免试剂盒、大鼠胰岛素试剂盒、DNA 提取试剂盒（美国Cayman 试剂公司）、链脲佐菌素（STZ，美国Sigma 公司）。1.1.3主要仪器AUW120D 电子分析天平，Shimad-zu 公司，日本；DYCP-24DN 电泳仪，北京六一仪器厂，中国；TQ8040 气相色谱-质谱仪，日本岛津公司；MiSeq PE300 高通量测序平台，美国Illumina 公司。ABI 9700 逆转录PCR 仪，ABI 公司，美国；PikoReal荧光定量PCR 仪，Thermo Scientific 公司，美国；iMark 酶标仪：美国Bio-Rad 公司。1.2造模与分组大鼠饲养于广东医科大学院动物实验中心，室内温度（252），湿度 50%70%，采用 12 h12 h 昼夜间断照明，每天给予换水 1 次，定量添加饲料 1 次，并及时更换垫料次，动物自由饮水进食，维持饲料由广东医科大学动物实验中心提供，进行适应性喂养 1 周后，按随机区组法分为正常组 10 只，造模组 60 只。造模组用高糖高脂饲料（猪油蔗糖奶粉鸡蛋常规饲料=10204363）持续喂养 8 周并结合腹腔注射 30 mg/kg 链脲佐菌素诱导大鼠制备成糖尿病模型，正常组动物腹腔注射等剂量的生理盐水作为对照。1.3干预方法选取造模成功的实验性糖尿病大鼠随机分组，共分为正常组、模型组、二甲双胍组（4.0 mg/kg）、辛伐他汀组（0.32 mg/kg）、生脉散低剂量组（50.0 mg/kg，L-SMS）、生脉散中剂量组（200.0 mg/kg，M-SMS）和生脉散高剂量组（400.0 mg/kg，H-SMS），每组 10 只。给药组每日上午定时灌胃给药，模型组和正常组用等第2期丘文龙，等.生脉散对 2 型糖尿病模型大鼠糖脂代谢和肠道菌群的影响129剂量（1 mL/100 g）的生理盐水灌胃，连续 6 周，期间配合普通饲料喂养。1.4检测指标与方法1.4.1 血清FBG、FINS、HbAlc 的检测 所有动物在取标本前均禁食并自由饮水，禁食 12 h 后，采用剪尾法从尾静脉末梢取血 0.2 mL 收集于干燥试管中，3 000 r/min 离心 15 min 后，取血清用于检测。检测药物干预后的空腹血糖（FBG）、空腹胰岛素（FINS）及糖化血红蛋白（HbAlc）的水平，其中FBG 使用葡萄糖氧化酶试剂盒检测，FINS 采用胰岛素放免试剂盒检测，血清中HbAlc 使用相关试剂盒进行检测。1.4.2血脂水平的检测测量完小鼠空腹血糖后，从小鼠眼球部取血，取血后采用颈椎脱臼方法处死小鼠。全血室温静置 3 h，以 3 000 r/min 离心 15 min，缓慢轻柔吸取上层血清样品，利用试剂盒及酶标仪分析血清中总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的水平。1.4.3DNA 提取和测序 采用DNA 提取试剂盒提取各组小鼠结肠及盲肠内容物中的微生物总 DNA。对样品进行 PCR 扩增、产物纯化、文库制备与库检及 Miseq 上机测序。利用 overlap 将双端数据进行拼接，并进行质控、嵌合体过滤，获得高质量的有效数据。由于序列数量庞大，本试验对最终获得的有效数据进行 97%的相似度聚类，为降低假阳性率，会过滤 singleton 序列，获得最终的 OTU 丰度及代表序列，进一步进行多样性分析、主坐标分析分析（principal coordinates analysis，PCoA）及微生物菌属组成差异分析等。1.4.4 短链脂肪酸含量的测定 从收集的粪便中取0.1 g 置于 2 mL 离心管中，加 500 L 的饱和氯化钠溶液，在冰浴条件下用打碎机打碎均匀，再加 20 L 10%H2SO4溶液，混合器振荡混匀，到通风橱中加 500 L 无水乙醚，混合器振荡混匀，14 000 r/min 离心15 min，取上清液置于装有 0.25 g 无水硫酸钠的 2 mL离心管中，再以同样的条件离心，取上清液置于气相瓶中待测。1.5统计学处理应用SPSS 26.0 软件进行统计学处理，计量资料以均数 标准差表示，采用单因素方差分析及LSD-t检验。P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1生脉散对大鼠血糖的影响与正常组比较，模型组大鼠的FBG、FINS、HbAlc水平显著升高（P0.01）；与模型组比较，生脉散不同剂量组的FBG、FINS、HbAlc 水平均降低（P0.01 或0.05），且其降糖作用随剂量增加而增加，尤其是生脉散高剂量组，其效果与二甲双胍组接近，提示生脉散可降低胰岛素抵抗大鼠的血糖水平。见表 1。表 1生脉散对大鼠血糖的影响（x-s,n=10）组别FBG/（mmol/L）FINS/（U/L）HbAlc/%正常组4.970.2823.153.224.180.39模型组16.381.56a49.516.17a5.880.72a二甲双胍组9.430.60b25.363.62b4.350.45b生脉散低剂量组13.381.14bd40.884.91bd5.820.11d生脉散中剂量组12.520.46bd36.283.95bd5.310.13cd生脉散高剂量组10.980.21bdf28.882.84bf5.060.10bde与正常组比较：aP0.01；与模型组比较：bP0.01，cP0.05；与二甲双胍组比较：dP0.01；与生脉散低剂量组比较：eP0.01，fP0.052.2生脉散对大鼠血脂水平的影响与正常组相比，模型组大鼠的模型组TC、TG、LDL-C 水平升高（P0.01），HDL-C 水平降低（P0.01）；与模型组比较，辛伐他汀组和生脉散不同剂量组的TC、TG、LDL-C 水平降低，HDL-C 水平升高（P0.01或 0.05）；尤其是生脉散高剂量组，其降脂效果与辛伐他汀组基本一致，提示生脉散能够改善高脂饮食诱导的小鼠血脂紊乱的现象。见表 2。2.3 生脉散对大鼠肠道菌群多样性及组成的影响正常组、模型组、生脉散低剂量组和生脉散高剂 表 2生脉散对大鼠血脂的影响（x-s，n=10）组别TC/（mmol/L）TG/（mmol/L）HDL-C/（nmol/L）LDL-C/（nmol/L）正常组3.760.240.770.062.970.461.200.16模型组4.750.58a1.130.13a1.540.22a2.360.37a辛伐他汀组3.910.27b0.850.10b2.620.35b1.310.21b生脉散低剂量组4.330.13ce1.040.04d1.930.12cd2.630.11cd生脉散中剂量组4.120.15b0.960.05be2.080.06be2.350.08df生脉散高剂量组4.010.10b0.890.03b2.690.11bg1.470.04bg与正常组比较：aP0.01；与模型组比较：bP0.01，cP0.05；与辛伐他汀组比较：dP0.01，eP0.05；与生脉散低剂量组比较：fP0.01，gP0.05广东医科大学学报1302023年 第41卷量组分别观测到 1 034、755、894 和 971 个特有OTU数。与正常组比较，模型组的OTUs 数下降；而在大鼠接受不同剂量的生脉散后，OUTs 数目较模型组有一定程度提高。这表明生脉散有利于肠道菌群的恢复，丰富肠道菌群数。见图 1。图 1大鼠肠道菌群OTUs 分布的Venn 图Alpha 多样性主要与种类数目和多样性相关，即丰富度和均匀性。菌群丰富度主要包括 Chao1 指数，而菌群均匀性主要包括Shannon 和Simpson 指数。与正常组相比，模型组的 Shannon 以及 Chao1 指数均降低（P0.01），而生脉散组与模型组相比，能有效升高Chao1、Shannon 与Simpson 指数（P0.01）。上述结果表明，生脉散可以有效防止糖尿病大鼠的肠道微生物群丰富度及多样性的降低。见表 3。表 3生脉散对大鼠肠道菌群Alpha 多样性的影响 （x-s，n=10）组别Chao1ShannonSimpson正常组397.4421.677.540.680.980.02模型组305.8014.41a6.150.37a0.900.05a生脉散低剂量组357.2517.92b7.150.39b0.960.03b生脉散高剂量组369.3218.23b7.260.48b0.970.02b与正常组比较：aP0.01；与模型组比较：bP0.01为比较微生物群落之间的差异，计算了 多样性并进行主成分分析（principal co-ordinates analysis，PCoA），其结果如图 2 所示。从图 2 可见，横坐标和纵坐标成分的贡献率分别是 45.39%和 13.28%，提示分组关系较好。而各组（正常组、模型组、生脉散低剂量组和生脉散高剂量组）样本点区别明显，其中生脉散低剂量组和生脉散高剂量组与正常组样本点距离小于模型组和正常组间的距离，说明生脉散干预后的菌群结构有向正常组的菌群结构模式调节的趋势。为进一步评估肠道微生物群的组成变化，进行了门水平的分类学分析。在门水平上，与正常组比较，模型组肠道菌群中放线菌门和变形菌门丰度升高，厚壁菌门和拟杆菌门丰度降低（P0.01）。而与模型组相比，生脉散组使厚壁菌门、拟杆菌门和疣微菌门丰度升高，放线菌门和变形菌门丰度降低（P0.01 或 0.05）。这表明生脉散可在一定程度上改善糖尿病大鼠体内肠道菌群紊乱的状态，诱导其肠道微生物组成恢复成正常大鼠状态。见表 4。0.50.40.30.20.10.0-0.1-0.2-0.3-0.4-0.3-0.2-0.10.00.10.20.30.40.5ControlModelL-SMSH-SMSPCoA1（45.39%）PCoA2（13.28%）图 2大鼠肠道菌群 多样性的PCoA 图2.4生脉散对大鼠粪便中短链脂肪酸含量的影响采用高效液相色谱法，考察了生脉散对大鼠粪便中SCFAs 含量的影响。结果发现，经灌胃高剂量生脉散后，大鼠粪便中的水分含量高于正常组，表明生脉散可能具有一定的润肠通便的功能；另外，大鼠粪便中SCFAs 的含量较正常组和模型组均有增加，表明生脉散能有效促进大鼠肠道内产SCFAs 细菌的增殖，增加SCFAs 的产生量。见表 5。3讨论随着人们生活方式尤其是饮食习惯的变化，使得诸如冠心病和糖尿病之类的慢性代谢性疾病发病率 表 4生脉散对大鼠肠道菌群基于门水平的物种构成影响（x-s，n=10，%）组别厚壁菌门拟杆菌门放线菌门变形菌门疣微菌门其他正常组69.636.5122.383.943.570.473.70 0.420.48 0.070.240.03模型组56.014.92a12.152.71a13.662.84a16.802.63a0.460.030.920.02a生脉散低剂量组63.145.34c18.403.57b6.981.68b9.312.36b1.840.17b0.330.05b生脉散高剂量组67.266.22b19.853.66b4.321.27b6.171.95b2.060.26b0.340.05b与正常组比较：aP0.01；与模型组比较：bP0.01，cP0.05第2期丘文龙，等.生脉散对 2 型糖尿病模型大鼠糖脂代谢和肠道菌群的影响131增加10。糖尿病是由于体内胰岛素分泌缺陷而引发的以高血糖为特征的代谢性疾病，其中 90%以上患者为T2DM。而胰岛素抵抗被认为是造成T2DM 的主要病理基础和发病机制。近年来，中药复方因具有多成分、多靶点、毒性低、价格低、整体调节糖代谢、改善胰岛素抵抗的作用而成为了研究热点11-13。且临床研究已证明，生脉散对糖尿病及其并发症有良好的防治作用14。本研究以传统的中药为切入口，使用生脉散对T2DM模型大鼠进行治疗，从肠道微生态的角度探讨生脉散调节糖脂代谢治疗 T2DM 的可能作用机制。本实验结果显示，生脉散可以降低T2DM 模型大鼠的血糖以及HbAlc 水平，也可以调节血脂水平。同时通过 16SrDNA 高通量测序法研究肠道微生物，大鼠肠道菌群的OTUs 分布结果显示，与正常组比较，模型组肠道菌群Chao1、Shannon、Simpson 指数均降低，表明模型组的肠道菌群丰度、多样性均有降低；而生脉散低剂量与高剂量组中，Chao1、Shannon、Simpson指数明显回调，提示生脉散对肠道菌群结构的多样性有显著改善且效果良好。此外，多样性的PCoA 图显示，生脉散低剂量和高剂量组之间相互聚拢，表明生脉散低、高剂量这两组在相应的维度上菌群群落组成相似；而且生脉散低、高剂量两组有向正常组靠近的趋势，提示大鼠肠道菌群的结构组成，在生脉散的干预下可以在一定程度上往正常大鼠菌群的结构组成回调。此外，据文献报道在T2DM 患者肠道内，厚壁菌门与拟杆菌门的比值与血糖水平呈正相关，而且这两门菌群也是影响能量代谢平衡的主要群落15-18。因此我们在门水平上评估了肠道微生物的群落变化，结果显示，与正常组比较，模型组的肠道菌群中放线菌门和变形菌门丰度明显增加，拟杆菌门降低。作为肠道微生态失调的潜在生物标志物，变形菌门相对丰度增加与体内代谢紊乱有关联，这一结果证实了模型组大鼠体内出现了肠道菌群失调19。经生脉散干预后，厚壁菌门、拟杆菌门和疣微菌门丰度升高，变形菌门丰度降低，说明生脉散对T2DM 大鼠肠道菌群有一定改善作用。最后，本实验还考察了大鼠粪便中SCFAs 含量。SCFAs 主要包括乙酸、丙酸和丁酸，丙酸是拟杆菌门发酵的主要产物，可抑制胆固醇合成，丁酸是厚壁菌门发酵的主产物，可维持肠道内环境稳定20。本研究结果显示，模型组大鼠的SCFAs 含量较正常组少，而生脉散组SCFAs 含量显著回调且高于正常组，表明生脉散可使产SCFAs 的菌群丰度增加。综上，生脉散能显著调节T2DM 模型大鼠的血糖、HbAlc 和血脂水平，且能增加肠道厚壁菌门、拟杆菌门和疣微菌门的丰度，降低变形菌门的丰度，生脉散改善糖脂代谢的机制可能与调节体内肠道菌群的结构密切相关。参考文献：1 潘学伟.中西药结合治疗 2 型糖尿病的研究进展J.内蒙古中医药,2022,41(6)：158-160.2 中华医学会糖尿病学分会.中国 2 型糖尿病防治指南(2020 年版）J.中华内分泌代谢杂志,2021,37(4):311-398.3 牟荣菲,王绵,刘瑞红,等.肠道菌群与 2 型糖尿病相关性的研究进展J.中国糖尿病杂志,2022,30(8):636-640.4 KIM C H.Microbiota or short-chain fatty acids:Which regulates diabetes?J.Cell&Mol Immunol,2017,15(2):88-91.5 陈浩嘉,陈有红,吴寿岭.膳食纤维和肠道菌群与肥胖关系的研究进展J.医学综述,2019,25(5)：839-844.6 YIN C M,GIULIANA D N,FAN X Z,et al.The impact of mushroom polysaccharides on gut microbiota and its beneficial effects to 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