疏水载体辅助液相多肽合成与固相多肽合成工艺的比较.pdf

药学论著基金项目：山东省新旧动能转换重大工程重大课题攻关项目通信作者：姬胜利，：疏水载体辅助液相多肽合成与固相多肽合成工艺的比较张发进郭凯王者江张文杰姬胜利，滨州医学院药学院山东 烟台 ；润辉生物技术（威海）有限公司山东 威海 【摘要】目的分别采用两种液相多肽合成法和固相多肽合成（）法对具有抗病毒活性的多肽 进行合成工艺研究，通过工艺比较分析以研究其潜在的商业价值。方法分别采用 液相法、液相法及 法合成抗病毒多肽 ，并对三种不同的合成工艺进行物料消耗量、“三废”产生量、收率比较。结果比较 液相法和 液相法，两种方法的收率相差不大且都优于 法；液相法物料消耗量和“三废”产生量高于 液相法，但都远远低于 法。结论 液相法对合成多肽 具有较好的工业研究意义和潜在的商业价值。【关键词】多肽；法；法；法【中图分类号】【文献标志码】【文章编号】（）：，；（），【】（），“”，“”，【】；近年来在动植物、微生物体内相继发现了大量天然肽。哺乳动物中的天然肽主要有抗菌肽和防御素两大类 。这些肽通常由感染部位的上皮细胞和中性粒细胞表达，具有免疫调节和抗菌特性。许多天然肽已经被证实具有抗病毒的活性 ，其优点为广谱抗病毒活性及低耐药性。然而，通过天然提取法生产这些多肽成本高、产量低，而直接通过化学合成法生产由于氨基酸序列长（个氨基滨州医学院学报 年 月第 卷第 期 ，酸），导致生产周期长、纯化难度大、生产成本高，并且天然多肽通常稳定性差，易被蛋白酶降解 。可行的方法是人工合成保留原有多肽有生物活性的截短肽（个氨基酸）。多肽相比传统药物具有很多优点 ，包括：多肽分子量较小，免疫源性较低，相对于许多大分子类药物来说更为安全；多肽的分子结构相对简单，单体分子的功能较为明确、特异性好，产生副作用的概率较小；多肽的分子较小，合成技术成熟完善，生产成本较低；多肽药物的体内稳定性相对来说比较好，可以多途径给药（如口服、喷雾、透皮吸收等），易于吸收 。目前，多肽较少应用于抗病毒临床治疗，而本研究着眼于广谱抗病毒多肽合成方法的研究，并为其他类型多肽合成提供参考。本研究已经筛选出具有广谱抗病毒活性的多肽 。作为一种多肽化合物，其合成方法与很多多肽化合物相类似，以往主要通过传统的固相多肽合成法（，）来进行制备，见图 。法存在一些缺点 ，包括：法的载体为不溶的树脂，反应时间过长以及无法有效地通过 法实时检测反应是否完全，导致终产品粗产品纯度偏低；法所涉及的反应均为非均相反应，为了让反应进行完全，需要投入几倍当量的氨基酸，导致原料消耗量过大，工业“三废”产生过多，尤其多肽的肽链过长或偶联反应遇到困难氨基酸导致原料使用量更大、反应时间更长、需要复投、更换反应体系（副反应增加、产物纯度降低）、工业“三废”也大幅度增加，不利于生产成本的控制。用 法 制 备 得 到 的 粗 产 品 收 率 为 ，潜在的商业应用价值不大。本研究尝试使用有别于传统 法的方法，来进行 的合成，比如日本东京农业大学 课题组 、西北工业大学钦传光课题组 采用两种使用疏水载体辅助的多肽液相合成法，分别为 液相法和 液相法。图 法流程图 液 相 法（）类似于传统 法，见图 。同样是将多肽末端的氨基酸与载体相偶联，逐个偶联对应的氨基酸得到所需要的片段，最后裂解得到所需的产物。不同点包括：液相法使用的载体在二氯甲烷、四氢呋喃等非极性溶剂中非常易溶，而在乙腈、纯化水、甲醇等极性溶液中很难溶解，整个反应过程为均相反应，氨基酸等原料的投料比更加合理，工业“三废”产生量大幅度下降，生产成本得到有效的控制；反应在溶液中进行，能通过 法实时动态检测反应是否完全和杂质的产生；当反应完全后，向反应液加入乙腈或者其他不良溶剂便可有产物析出，只需要抽滤洗涤便能对产物进行纯化，操作简单，易于处理；载体 能回收利用，符合绿色化学的发展理念 。图 流程图 液相法（）与 液相法相似，见图 。辅助基团替代固相树脂 ，在偶联脱水剂的作用下与 端 保护的氨基酸的 端相连，然后分离纯化、脱除 端 、多肽偶联，重复以上步骤，依次偶联相应的氨基酸，得到产物。向产物中加入极性小的烷烃或醚类溶剂，借助 辅助基团在溶剂系统中易结晶沉淀的特性，将产物与其他物质分离，对分离后的产物进行过滤、洗涤或重结晶便可得到纯化的产物。整个实验过程中，原料的投料比比较合滨州医学院学报 年 月第 卷第 期 ，理，工业“三废”的产生量下降，能通过 法实时监控反应是否进行完全，载体能够回收，符合绿色化学的发展理念。图 流程图 材料 仪器智能磁力搅拌器（）购于上海越众有限公司，高效液相色谱仪（）、质谱仪（）购于美国 有限公司，旋转蒸发仪（）购于上海爱朗有限公司，紫外分析仪（）购于上海光豪有限公司。试剂二氯甲烷、乙腈购于旺通化工有限公司，羟基苯并三唑、氨基酸、二异丙基碳二亚胺、二甲氨基吡啶均购于苏州昊帆生物股份有限公司，二羟基苯甲醛、三异丙基氯硅烷购于麦克林生化科技有限公司，三异丙基硅烷购于湖北永阔有限公司，二甲基甲酰胺购于鲁西化工基团股份有限公司，溴二十二烷购于青岛大德生物科技有限公司，树脂购于蓝晓科技新材料股份有限公司。方法与结果 合成路线 的合成路线见图 。终产物的结构式和序列式如图 所示。图 的合成图图 结构式 液相合成法 称取 （，），二羟基苯甲醛用 ，二甲基甲酰胺溶于 圆底烧瓶 ，加入 （，）溴二十二烷、（，）碳酸钾，保护，温度 过夜，检测反应完全。温度降至室温，将反应液缓慢倒入水中，搅拌下瞬间有大量红棕色固体析出，搅拌。抽滤，用 甲醇打浆洗涤，抽滤，烘干，得灰红色固体，称重 ，收率为 。将上一步的的产物 ，二（二十二烷氧基）用 四氢呋喃、甲醇溶于 圆底烧瓶，加入 （，）硼氢化钠，滨州医学院学报 年 月第 卷第 期 ，保护，反应。反应 ，检测反应完全。缓慢倒入 纯化水淬灭，瞬间有大量气泡和白色固体产生，减压浓缩，得白色固体，用甲醇洗涤，烘干得白色固体 ，二（二十二烷氧基）（苯甲醇），反应路线如图 所示，称重 ，收率为 。图 合成路线称取 （，）用 二氯甲烷溶于 圆底烧瓶，加入 （，），（，）二异丙基碳二亚胺，（，）二甲氨基吡啶，保护，反应 ，检测反应完全。减压浓缩，得灰白色固体，用 乙腈溶解，抽滤，得灰白色固体，烘干，称重 ，收率为 。用 四氢呋喃溶解上一步的产物（），加入 （，）六氢吡啶脱 ，保护，反应，检测反应完全。减压浓缩，得灰白色固体，用 乙腈溶解，抽滤，测滤液 值，如果 值 ，要继续用乙腈洗涤，直到 值 。得到中间体 ，反应路线如图 所示，称重 ，收率为 。图 法合成中间体 量取 四氢呋喃将中间体 （）溶于 圆底烧瓶，量取 四氢呋喃溶解 （，）（），依次加入 （，）羟基苯并三唑、（，）二异丙基碳二亚胺，活化 ，加入到反应液中。保护，反应 ，检测反应完全。减压浓缩，得橙黄色固体，用 乙腈洗涤，打浆，抽滤，得灰白色固体，烘干，称重 ，收率为 。量取 四氢呋喃将上一步的产物 （）溶于 圆底烧瓶，加入 （，）六氢吡啶脱 ，保护，反应 ，检测反应完全。减压浓缩，得橙黄色固体，用 乙腈溶解，打浆，抽滤，测滤液 值，如果 值 ，要继续用乙腈洗涤，直到 值 。得到中间体 ，反应路线如图 所示，称重 ，收率为 。图 法合成中间体 接下来连 （）、（）、（）、（）、（）、（）、（）的方法、用量、处理方式和上一步 （）的一致。粗产品称重 ，收率为 。量取 四氢呋喃将产物溶于 圆底烧瓶，加入 （，）一水合氢氧化锂裂解，保护，反应，检测反应完全，减压浓缩，得灰白色黏稠液体，缓慢倒入到 甲基叔丁基醚中，瞬间有大量白色固体析出，搅拌 。抽滤得白色固体，烘干，终产物粗产品称重 ，收率为 ，回收滤液，减压浓缩得白色固体即为载 体 ，烘 干、称 重 ，回 收 率 为 。法量取 二氯甲烷溶胀 （，）树脂 ，抽取滤液，先用 ，二甲基甲酰胺 次洗涤树脂，每次 ，再用 二氯甲烷 次洗涤树脂，每次 。量取 二氯甲烷溶解 （，），加入 （，），二异丙基乙胺活化 ，加入到反应液中，反应完全，按 ，二异丙基乙胺 甲醇 二氯甲烷 的摩尔比，加入甲醇进行盖帽，反应 ，抽取滤液，滨州医学院学报 年 月第 卷第 期 ，用 ，二甲基甲酰胺 次洗涤树脂，每次 ，用 六氢吡啶 ，二甲基甲酰胺脱 ，茚三酮检测，溶液变蓝色，树脂变成黄色，反应完全。用 ，二甲基甲酰胺洗涤树脂，每次 ，直到 值 ，获得中间体 ，反应路线如图 所示。图 法合成中间体 量取 ，二甲基甲酰胺溶解 （，）（），依次加入 （，）羟基苯并三唑、（，）二异丙基碳二亚胺，活化 ，加入到中间体 （）中。反应 ，茚三酮检测，溶液变淡黄色，树脂变成无色，反应完全。抽取滤液，用 ，二甲基甲酰胺 次洗涤树脂，每次 ，用 六氢吡啶 ，二甲基甲酰胺脱 ，茚三酮检测，溶液变蓝色，树脂变成黄色，反应完全。用 ，二甲基甲酰胺洗涤树脂，每次 ，直到 值 ，获得中间体 ，反应路线如图 所示。图 法合成中间体 （）、（）、（）、（）、（）、（）、（）的方法、用量、处理方式和上一步 （）的一致。最后用 甲醇 次收缩树脂，每次 ，晾干，产品称重 ，收率为 。按产物的质量与裂解液体积的比例为 配制裂解液，裂解液的成分比例为三氟乙酸 三异丙基硅烷 纯化水 ，保护，反应 ，反应完全，进行抽滤、滤液减压浓缩得灰白色黏稠液体，缓慢倒入到 甲基叔丁基醚中，瞬间有大量白色固体析出，搅拌 。抽滤得到白色固体，烘干，粗产品称重 ，收率为 。液相合成法量取 四氢呋喃溶解 （，），羟基二甲酮于 圆底烧瓶中，并置于冰浴中搅拌 ，反应体系中加入缚酸剂 （，）。量取 （，）二苯基次磷酰氯，滴加加入上述反应体系中，冰浴条件下，反应 ，保护，反应 ，检测反应完全，加入 硫酸淬灭反应，旋转蒸发仪减压浓缩除去四氢呋喃并加入 纯化水，加入 乙酸乙酯萃取得到有机相，用无水硫酸钠干燥，抽滤，旋转蒸发仪减压浓缩干后，加入 的乙酸乙酯使样品充分溶解，滴加 正己烷（乙酸乙酯正己烷 ），体系中出现大量白色沉淀为中间体 ，反应路线如图 所示，过滤白色沉淀并干燥得到化合物 ，收率为 。图 合成中间体 量取 甲醇溶解上一步的产物羰基双（，亚苯基）双（二苯基次膦酸盐）（，）于 的圆底烧瓶中并于冰浴下搅拌 ，加入 （，）硼氢化钠，保护，反应 ，检测反应完全。加入 饱和氯化铵淬灭反应，浓缩除去甲醇加入 纯化水，乙酸乙酯萃取得到有机相，无水硫酸钠干燥，抽取滤液，滤液旋干后加入 乙酸滨州医学院学报 年 月第 卷第 期 ，乙酯使样品充分溶解，滴加加入 正己烷（乙酸乙酯 正己烷 ），体系中出现大量白色沉淀为中间体 ，反应路线如图 所示，过滤白色沉淀并干燥得到化合物 ，收率为 。图 合成中间体 量取 二氯甲烷溶解上一步的产物（羟基亚甲基）双（，亚苯基）双（二苯基次膦酸盐）（，）于 的圆底烧瓶中，依次加入 （，）、（，）羟基苯并三唑、（，）二异丙基碳二亚胺和 （，）二甲氨基吡啶，反应，检测反应完全，浓缩加入 乙酸乙酯溶解，加入饱和碳酸钠洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩后用 乙酸乙酯溶解样品，逐滴加入 正己烷（乙酸乙酯 正己烷 ），体系中出现大量白色沉淀，过滤白色沉淀并干燥得到产物 称重 ，收率为 。量取 乙腈溶解产物 于 的圆底烧瓶中，搅拌滴加入 二乙胺（二乙胺 乙腈 ，二乙胺脱 保护基），搅拌 ，检测反应完全，减压浓缩除去乙腈及二乙胺，加入 二氯甲烷继续浓缩，连续操作 次除净二乙胺，加入 乙酸乙酯，滴加 乙醚（乙酸乙酯 乙醚 ），搅拌出现大量白色固体，静止 ，除去上清液，得到脱保护的产物中间体 （），反应路线如图 所示，称重 ，收率为 。图 合成中间体 量取 二氯甲烷将上一步的产物中间体（）溶解于 的圆底烧瓶，量取 二氯甲烷溶解 （，）（），依次加入 （，）羟基苯并三唑和 （，）二异丙基碳二亚胺，活化 ，反应 ，检测反应完全，浓缩加入 乙酸乙酯溶解，加入饱和碳酸钠洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩后用 乙酸乙酯溶 解 样 品，逐 滴 加 入 正 己 烷（乙酸乙酯 正己烷 ），体系中出现大量白色沉淀，过滤白色沉淀并干燥得到产物 （），称重 ，收率为 。量取 乙腈将产物 （）溶于 的圆底烧瓶中，搅拌滴加入 二乙胺（二乙胺 乙腈 ，二乙胺脱 保护基），搅拌 ，检测反应完全，减压浓缩除去乙腈及二乙胺，加入 二氯甲烷继续浓缩，连续操作次除净二乙胺，加入 乙酸乙酯，滴加 乙醚，震荡（乙酸乙酯 乙醚 ），出现大量白色固体，静止 ，除去上清液，得到中间体 （），反应路线如图 所示，称重 ，收率为 。图 合成中间体 滨州医学院学报 年 月第 卷第 期 ，接 下 来 （）、（）、（）、（）、（）、（）、（）的方法、用量、处理方式和上一步 （）的一致。称重 ，收率为 。量取 四氢呋喃将产物溶于 圆底烧瓶，量取 四氢呋喃溶解 （，）一水合氢氧化锂进行裂解，保护反应，反应，检测反应完全，进行减压浓缩，用 稀盐酸调节 值至 。出现沉淀，对沉淀进行过滤，得到含有粗产品和载体的混合沉淀，混合沉淀释放到 乙醚中，超声震荡搅拌 ，连续操作 次，抽滤得白色固体产物，烘干、称重 ，收率为 。回收乙醚减压浓缩得载体 ，烘干、称重 ，回收率为 。粗产品的质谱图 法、法、法合成的粗产品质谱分别见图 、。图 法合成的粗产品质谱图图 法合成的粗产品质谱图图 法合成的粗产品质谱图 成本计算本研究计算了三种方法的物料消耗量、三废产生量以及粗产品回收率。液相法和 液相法的粗产品回收率相差不大，都高于 法。但 液相法的原料消耗量、工业“三废”产生量高于 液相法。见表 。讨论 法并非固态反应（如熔融反应、核裂变反应）那样没有任何溶剂为介质。反应时键连在固相载体上的底物结构处于适当的溶剂中，与外加构件表 成本方法收率氨基酸消耗量 羟基苯并三唑 二异丙基碳二亚胺 废液产生总量 四氢呋喃 乙腈六氢吡啶 二氯甲烷 ，二甲基甲酰胺 甲醇乙酸乙酯 正己烷 二乙胺 乙醚 法 法 法 分子及试剂分子在固液两相交界处进行有关的化学反应，反应后滤除溶在溶剂中的过量构件、试剂及副产物，便可得到键连在不溶于溶剂的载体上的产物，最后经适当反应切断 键，便将目标产物从载体上释放出来。在用 法制备 的过程中，反应均为非均相反应。为了让反应进行完全，需要投入过量的氨基酸，尤其遇到困难氨基酸时，氨基酸的使用量更大。氨基酸的消耗量、“三废”产生量远远高于 液相法和 液相法，成本很高。法无法通过 法实时检测反应是否进行完全和杂质的产生，导致纯度不高，粗产品的收 率 仅 为 ，低 于 液 相 法 的 和 液相法的 ，潜在的商业应用价值不大。液相法和 液相法类似于传统 法，辅助基团替代固相树脂，同样是将多肽 末端的氨基酸与载体相偶联，逐个偶联对应的氨基酸得到所需要的片段，最后裂解得到所需的产物。不同的是，液相法反应液加入乙腈或者其他不良溶剂便可有产物析出，只需要抽滤洗涤便能对产物进行纯化，载体 能回收利用，符合绿色化学的发展理念，载体回收率为 ，产物的粗产品回收率为 。而 液相法向产物（下转第 页）滨州医学院学报 年 月第 卷第 期 ，（），（）：，（）：，（）：，（）：，（）（），（）：，（）：，（）：，（）：，（）：?，（）：（收稿日期：）（本文责编：于腊梅）（上接第 页）中加入极性小的烷烃或醚类溶剂，借助 辅助基团在溶剂系统中易结晶沉淀的特性，将产物与其他物质分离，对分离后的产物进行过滤、洗涤便可得到纯化的产物，载体能够回收，回收率为 ，符合绿色化学的发展理念，粗产品回收率为 。液相法和 液相法的粗产品回收率相差不大，都高于 法，载体都可以回收利用，符合绿色化学发展理念，都具有潜在的商业价值。但是，液相法的原料消耗量、工业“三废”产生量高于 液相法。综上所述，液相法具有更高的商业应用价值。参考文献 ：，（）：于蕾，李传迪，东方，等 硒多糖的药理活性研究进展 中国医药导报，（）：，：，（）：刘梦，于彭城，徐寒梅 蛋白多肽类药物长效化技术研究进展 药学进展，（）：秦建鹏，代英辉，王东凯 口服蛋白多肽类药物制剂开发策略 中国药剂学杂志，（）：郑龙，田佳鑫，张泽鹏，等 多肽药物制备工艺研究进展 化工学报，（）：，（）：，（），（）：，（），（）：钦传光，李海迪，张子鑫，等 辅助基团及基于 辅助基团的普卡那肽及类似物的液相全合成方法：马永香 绿色化学工程与工艺对化学工业节能减排的促进作用 产业创新研究，（）：（收稿日期：）（本文责编：李林）滨州医学院学报 年 月第 卷第 期 ，