舒芬太尼对大鼠骨折愈合的影响_李玉斐.pdf

doi:10 3969/j issn 1002 7386 2023 02 002论著舒芬太尼对大鼠骨折愈合的影响李玉斐马智聪项目基金:山西省自然科学基金面上项目(编号:201901D111368)作者单位:030001太原市，山西医科大学麻醉学院(李玉斐);山西医科大学第二医院麻醉科(马智聪)通讯作者:马智聪E-mail:mazhicong1970126 com【摘要】目的探讨舒芬太尼对胫骨骨折大鼠骨折术后骨愈合的影响。方法选取 48 只雄性 SD 大鼠，麻醉下建立胫骨骨折模型，随机分为实验组(枸橼酸舒芬太尼注射液，10 gkg112 h1)和对照组(0 9%氯化钠溶液)，在第 1、2、4 周时分别处死 8 只大鼠，X 线片观察，HE 染色观察组织学特征，测定血清碱性磷酸酶及转化生长因子 1水平，采用免疫组化法检测骨折处骨组织中骨形态发生蛋白 2 表达水平。结果X 线片观察到在 1 周、2 周、4 周时，实验组骨折愈合程度均低于对照组(P 0 05);HE 染色结果显示在 1 周、2 周、4 周时，实验组骨折愈合程度均低于对照组;实验组和对照组血清碱性磷酸酶含量 1 周时开始上升，2 周时含量最高，4 周时逐渐降低，且在术后 1 周、2 周、4周时，实验组大鼠的血清碱性磷酸酶含量均低于对照组(P 0 05)。2 组血清转化生长因子 1 含量在术后 1 周、2周、4 周不断增高，且实验组大鼠的血清转化生长因子 1 含量均低于对照组(P 0 05)。术后1 周、2 周、4 周时，实验组大鼠的骨折部位的骨组织中骨形态发生蛋白 2 表达水平均低于对照组(P 0 05)。结论舒芬太尼会抑制胫骨骨折大鼠的骨折愈合。【关键词】舒芬太尼;骨折愈合;碱性磷酸酶;转化生长因子 1;骨形态发生蛋白 21【中图分类号】R 971 2【文献标识码】A【文章编号】1002 7386(2023)02 0170 05Effect of sufentanil on bone healing in ratsLI Yufei*，MA Zhicong School of Anesthesiology，Shanxi Medical University，Shanxi，Taiyuan 030001，China【Abstract】ObjectiveTo explore the effect of sufentanil(SF)on postoperative bone healing(BH)in rats with tibialfracture(TF)MethodsThe TF model was established in 48 healthy male SD rats under anesthesia，and the rats wererandomly assigned to the experimental group(sufentanil citrate injection，10gkg112h1)and the control group(0 9%sodium chloride solution)Eight rats were sacrificed in weeks 1，2，4 The X-ray was performed for imageobservation;the histologic characteristics was observed using the HE staining The serum alkaline phosphatase(ALP)andtransforming growth factor beta 1(TGF-1)were detected;the expression of bone morphogenic protein-2(BMP-2)in bonetissue at fracture was detected by immunohistochemistry ResultsBoth X-ray and HE staining showed that the BH rates onweeks 1，2 and 4 in the experimental group were lower than those in the control group(P 0 05)The serum ALP level inthe two group increased on week 1，peaked on week 2，and decreased on week 4;the serum ALP level on weeks 1，2 and 4in the experimental group was decreased as compared to the control group(P 0 05)The TGF-1 level on weeks 1，2 and4 in groups was continuously increased，which in the experimental group was decreased as compared to the control group(P 0 05)The expression of BMP-2 in bone tissue on weeks 1，2 and 4 in the experimental group was decreased in comparisonwith the control group(P 0 05)ConclusionSF can inhibit BH in TF rats【Key words】sufentanil;bone healing;alkaline phosphatase;transforming growth factor beta 1;bone morphogeneticprotein 2舒芬太尼是芬太尼的衍生物，通过激动 阿片受体发挥镇痛作用，其镇痛效果是芬太尼的 5 10 倍，且对呼吸和循环功能抑制较轻，可以降低应激反应因此被广泛运用于骨科术中及术后镇痛1 3。有研究证实舒芬太尼会抑制机体内 P 物质(SP)5、降钙素相关基因肽(CGRP)7 及 c-fos 基因6，7 等的表达，发挥镇痛作用，而这些基因和细胞因子在促进骨折愈合的过程中起到重要作用5，8 13。本实验给予胫骨骨折大鼠腹腔注射舒芬太尼处理，旨在研究舒芬太尼对大鼠骨折愈合的影响。1材料与方法1 1实验材料48 只健康雄性 SD 大鼠，6 周龄，体重(200 25)g，由山西医科大学动物中心提供，所有SD 大鼠分开饲养在相同鼠笼，每日摄食量相当，饮水不限，饲养温度控制在 22，12 h 光照和 12 h 黑暗交替，饲养 1 周。枸橼酸舒芬太尼注射液(厂家:人福医药，批号:11A05361)。1 2实验方法1 2 1大鼠胫骨骨折模型的建立:SD 大鼠经 7%水合氯醛 0 5 ml/100 g 腹腔内注射麻醉后，于右小腿胫骨中下 1/3 处使用骨折装置制造横形骨折。在右腿胫071河北医药 2023 年 1 月 第 45 卷 第 2 期Hebei Medical Journal，2023，Vol 45 Jan No.2骨平台处脱毛，碘伏消毒，切开皮肤后取适宜长度的0 8 mm 克氏针从胫骨平台穿入髓腔，手法复位后逆行穿入骨折远端并固定，0 9%氯化钠溶液冲洗后缝合切口。术后大鼠肌内注射青霉素 8 万 U/100 g，1 次/d，连续肌内注射 3 d，然后分笼饲养，死亡大鼠由备用同系大鼠在相同处理后补充。1 2 2实验分组及用药:将制备好胫骨骨折模型的48 只 SD 大鼠随机分为实验组(腹腔注射舒芬太尼10 g/kg，稀释至 0 5 ml)和对照组(腹腔注射 0 9%氯化钠溶液 0 5 ml)2 组，每组 24 只，术后第 1 天起开始给药，每天早 8 00 和晚 20 00 给药，每次给药间隔12 h，2 次/d。1 2 3实验标本采集及观察:术后第 7 天、14 天、28天，分别从实验组和对照组随机选取 8 只大鼠，经水合氯醛腹腔注射麻醉后，颈动脉置管取血，将所取血液离心后取血清于 20冰箱保存。处死大鼠后取右下肢拍 X 线片观察骨折愈合程度。然后取右胫骨，剔除干净软组织，用 4%多聚甲醛固定 24 h 后使用 EDTA 脱钙液脱钙 1 个月，在胫骨骨痂远近各 1 cm 处截取胫骨，脱水、浸蜡、包埋、切片、脱蜡后，进行 HE 染色，显微镜下观察大鼠骨折部位的骨组织学特征。1 2 4ELISA 法检验大鼠血清中碱性磷酸酶(ALP)和转化生长因子 1(TGF-1)水平。1 2 5免疫组化检测骨形态发生蛋白 2(BMP-2)表达水平，电子显微镜下进行图像采集和分析。1 3统计学分析应用 SPSS 25 0 统计软件，计量资料以 珋x s 表示，2 组间比较采用两独立样本 t 检验，P 0 05 为差异有统计学意义。2结果2 1X 线片比较2 1 1术后 1 周:实验组骨折线清晰可见;对照组断端稍模糊，出现轻度骨膜反应，但无骨痂生长。见图 1。实验组对照组图 12 组术后 1 周 X 线片比较2 1 2术后 2 周:实验组骨折线较清晰;对照组骨折线模糊，有少量骨痂形成。见图 2。实验组对照组图 22 组术后 2 周 X 线片比较2 1 3术后 4 周:实验组可见大量骨痂包绕断端，但仍能看到骨折线;对照组骨折线完全消失，断端可见大量外骨痂及少量骨桥连接骨折两端。见图 3。实验组对照组图 32 组术后 4 周 X 线片比较2 2HE 染色组织学比较2 2 1术后 1 周:实验组可见少量软骨细胞与成骨细胞;对照组可见大量软骨细胞形成和成骨细胞聚集现象，可见少量新生骨组织形成。见图 4。2 2 2术后 2 周:实验组可见大量新生骨小梁和新生血管形成，新生骨小梁数量较少，排列紊乱;对照组可见较多新生骨小梁和新生血管，且骨小梁宽度、数量多于实验组。见图 5。2 2 3术后 4 周:实验组有较多成纤维细胞形成，但成熟骨小梁仍较少;对照组有大量成纤维细胞和骨小梁形成，骨小梁明显增多、增厚，形成编织骨，并向成熟板层骨转化。见图 6。171河北医药 2023 年 1 月 第 45 卷 第 2 期Hebei Medical Journal，2023，Vol 45 Jan No.2实验组对照组图 42 组术后 1 周组织学比较(HE 染色 200)实验组对照组图 52 组术后 2 周组织学比较(HE 染色 200)实验组对照组图 62 组术后 4 周组织学比较(HE 染色 200)23血清 ALP 及 TGF-1 含量比较与对照组相比，实验组大鼠血清碱 ALP 和 TGF-1 含量在 1 周、2 周、4 周时均明显降低(P 0 05。见表 1、2。表 1舒芬太尼对胫骨骨折大鼠血清碱性磷酸酶含量的影响n=48，珋x s组别1 周2 周4 周实验组1 243 0 061*2 609 0 614*0 848 0 092*对照组1 726 0 2403 641 0 5821 561 0 442注:与对照组比较，*P 0 05表 2舒芬太尼对胫骨骨折大鼠血清转化生长因子 1 含量的影响n=48，珋x s组别1 周2 周4 周实验组24 854 6 132*25 390 7 496*27 515 9 188*对照组32 049 5 66242 369 11 39553 366 16 338注:与对照组比较，*P 0 052 4骨折部位骨组织中 BMP-2 表达水平比较与对照组相比，实验组大鼠 BMP-2 表达水平在 1 周、2 周、4周时均明显降低(均 P 0 05)。见表 3，图 7。表 3舒芬太尼对胫骨骨折大鼠骨折部位 BMP 表达水平的影响n=48，珋x s组别1 周2 周4 周实验组0 138 0 017*0 140 0 023*0 168 0 013*对照组0 167 0 0130 179 0 0210 203 0 021注:与对照组比较，*P 0 05实验组对照组实验组实验组对照组实验组图 7骨折部位骨组织中 BMP-2 表达(免疫组化 500)3讨论舒芬太尼是 1974 年合成，1976 年被首次报道的芬太尼 N2-4 噻吩基衍生物，通过激动特异性 阿片受体发挥镇痛作用2。舒芬太尼镇痛效价约为芬太尼 5 10 倍，是目前镇痛效应最强的阿片类药物，其脂溶性强，血浆蛋白结合率高，对呼吸系统、心血管系统及血流动力学抑制作用较芬太尼轻，被广泛运用于骨科、心血管外科及产科等手术和术后镇痛3。舒芬太尼可以通过作用于人体大脑、脑干和脊髓等部位的阿片受体，抑制 P 物质(SP)、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体、降钙素基因相关肽(CGRP)及 c-fos 基因等的表达，发挥镇痛作用。研究表明 阿片受体激动剂可以通过使电压门控 Ca2+通道失活抑制NMDA 受体诱导的 P 物质释放4。P 物质(SP)是一271河北医药 2023 年 1 月 第 45 卷 第 2 期Hebei Medical Journal，2023，Vol 45 Jan No.2种神经递质，通过传递疼痛信息，激活伤害性感受神经元，发挥致痛作用。P 物质可以作用于骨髓基质细胞上的 NK-1 受体，促进成骨细胞的增殖、分化，从而促进骨形成8;也作用于骨髓巨噬细胞上的 NK-1 受体，促进破骨细胞生成，从而促进骨吸收9，通过促进骨形成和骨吸收，加速骨转化，促进骨折愈合。王懿春等 5 实验证实鞘内注射舒芬太尼可以抑制大鼠脊髓背角 N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体和降钙素基因相关肽(CGRP)的表达。降钙素基因相关肽作为疼痛因子参与多种慢性疼痛的形成，同时可以促进细胞内 cAMP 的产生，通过 cAMP/PKA 途径增加骨髓基质细胞的矿化和碱性磷酸酶的活性，促进成骨细胞的增殖 10。降钙素基因相关肽(CGRP)还可以通过促进骨形态发生蛋白-2的表达，加速骨折愈合 11。c-fos 原癌基因属于即刻早期基因(IECs)家族，很多研究表明伤害性刺激可以诱导c-fos 基因的表达，c-fos 基因的表达产物 Fos 蛋白可与Jun 蛋白结合形成 fos/jun 异源二聚体 AP-1，识别细胞表面的 TRE 位点，启动 TGF-等因子的转录，进而促进骨折愈合 11，12。而全身或局部应用阿片类药物会抑制大脑皮质、海马和脊髓 c-fos 基因的表达，且其抑制作用可以被阿片受体拮抗剂纳洛酮逆转 6，7。随着社会发展和交通工具的变革，骨折患者的数量越来越多，在积极治疗骨折的基础上，缓解骨折患者的疼痛也越来越重要。目前临床上常用的镇痛药物主要有非甾体抗炎药和中枢性镇痛药，大量研究表明非甾体抗炎药在镇痛的同时会延缓骨折愈合14，15。许多实验证实舒芬太尼会抑制骨折愈合相关的基因和细胞因子的表达，而关于中枢性镇痛药对骨折愈合的影响，笔者所见国内外鲜有报道，故本实验对胫骨骨折大鼠腹腔注射舒芬太尼处理，并与注射等量 0 9%氯化钠溶液的空白组大鼠进行对比，旨在研究舒芬太尼时候会抑制骨折愈合。X 线片显示术后 1 周时，实验组大鼠骨折线清晰可见，对照组大鼠骨折断端稍模糊，出现轻度骨膜反应，但无骨痂生长。术后 2 周时，实验组大鼠骨折线较清晰，对照组大鼠骨折线模糊，有少量骨痂形成。术后 4 周时，实验组大鼠可见大量骨痂包绕断端，但仍能看到骨折线，对照组大鼠骨折线完全消失，骨折断端可见大量外骨痂及少量骨桥连接骨折两端。HE 染色组织学结果显示术后 1 周时，实验组可见少量软骨细胞与成骨细胞，对照组出现大量软骨细胞形成和成骨细胞聚集现象，可见少量新生骨组织形成。术后 2 周时，实验组可见大量新生骨小梁和新生血管形成，新生骨小梁数量较少，排列紊乱，对照组可见较多新生骨小梁和新生血管，且骨小梁宽度、数量多于实验组。术后 4 周时，实验组有较多成纤维细胞形成，但成熟骨小梁仍较少，对照组有大量成纤维细胞和骨小梁形成，骨小梁明显增多、增厚，形成编织骨，并向成熟板层骨转化。ALP 可以分解有机磷酸化合物产生无机磷酸盐离子，并与钙离子结合成磷酸钙沉淀于骨组织内，促进骨折愈合。碱性磷酸酶由成骨细胞分泌后可以渗入血液，使血清碱性磷酸酶含量增高，故血清碱性磷酸酶可以作为评价骨折愈合的指标16。本实验中，实验组和对照组血清碱性磷酸酶含量 1 周时开始上升，2 周时含量最高，4 周时逐渐降低，且在术后 1 周、2 周、4 周时，实验组大鼠的血清碱性磷酸酶含量均低于对照组，结果有统计学意义。转化生长因子 1(TGF-1)广泛存在于正常细胞和转化细胞中，以骨细胞和血小板中含量最多。TGF-1 存在于大鼠骨折愈合的各个阶段，调控成骨细胞、破骨细胞、间充质细胞等多种骨细胞的增殖、分化，在骨折愈合过程中起到重要作用17。本实验中，血清 TGF-1 含量在术后 1 周、2 周、4 周不断增高，且实验组大鼠的血清 TGF-1 含量均低于对照组，结果有统计学意义。BMP 是 TGF-超家族中的一种酸性多肽，也是目前最强的成骨因子，其中 BMP-2是 BMP 中研究最多的亚型，也是成骨作用最强的亚型，可诱导间充质细胞向成骨细胞转化，促进骨折愈合18。本实验中，在术后 1 周、2 周、4 周时，实验组大鼠的骨组织骨形态发生蛋白 2 表达水平均低于对照组，结果有统计学意义。综上所述，舒芬太尼处理的胫骨骨折大鼠在影像学和组织形态学上骨折愈合程度低于单纯胫骨骨折大鼠，且同一时间段，舒芬太尼处理的胫骨骨折大鼠血清ALP 含量、血清 TGF-1 含量及骨组织 BMP-2 表达水平低于单纯胫骨骨折大鼠。故本实验证实舒芬太尼会抑制胫骨骨折大鼠的骨折愈合，应慎用于骨折患者的镇痛治疗，尤其是老年人、骨质疏松患者等易发生骨折延迟愈合或骨折不愈合的患者。舒芬太尼对骨折愈合的抑制作用可能是通过抑制 P 物质、降钙素基因相关肽及 c-fos 基因等的表达来实现的，关于舒芬太尼抑制骨折愈合的具体机制有待进一步研究。参考文献1张灵犀，陈李骏，戴近 不同剂量舒芬太尼对老年胫腓骨骨折术后恢复和凝血功能的影响 河北医药，2020，42:3370-3373，33782Niemegeers CJ，Schellekens KH，Van Bever WF，et al Sufentanil，a verypotent and extremely safe intravenous morphine-like compound in mice，rats and dogs Arzneimittel-Forschung，1976，26:1551-15563徐露，李元海 舒芬太尼的药理作用和临床应用研究进展 安徽医药，2011，15:375-377(下转 179 页)371河北医药 2023 年 1 月 第 45 卷 第 2 期Hebei Medical Journal，2023，Vol 45 Jan No.2竞争 RANKL，进而抑制破骨细胞生成15，16。Li 等17 研究发现 RANKL 刺激后，激活 ERK、p38 和 JNK、MAPK 磷酸化促进破骨细胞成熟，抑制此通路可有效抑制破骨细胞成熟和骨吸收。本研究发现，与对照组相比，模型大鼠骨组织RANKL、RANK mRNA 水平与蛋白水平均升高，OPGmRNA 水平与蛋白水平均降低，土贝母苷甲处理大鼠骨组织 RANKL、RANK mRNA 水平与蛋白水平较模型组降低，而 OPG mRNA 水平与蛋白水平较模型组升高，外源性 OPG 与土贝母苷甲处理发挥相同作用。在土贝母苷甲高剂量组基础上添加 OPG，大鼠骨组织RANKL、RANK mRNA 水平与蛋白水平进一步升高，OPG mRNA 水平与蛋白水平进一步降低，提示土贝母苷甲可能通过抑制 RANKL/RANK/OPG 通路发挥预防糖尿病性 OP 大鼠骨质流失作用。综上所述，土贝母苷甲可能通过抑制 RANKL/RANK/OPG 通路，减少糖尿病性 OP 大鼠破骨细胞形成，抑制骨流失，缓解 OP。参考文献1郑圣，冯倩云，张学利 原发性骨质疏松症骨折动物模型的选择和研究进展 现代中西医结合杂志，2019，28:790-7942Qi S，He J，Han H，et al Anthocyanin-rich extract from black rice(Oryzasativa L Japonica)ameliorates diabetic osteoporosis in rats Food Funct，2019，10:5350-53603Luo M，Luo S，Cheng Z，et al Tubeimoside I improves survival of mice insepsis by inhibiting inducible nitric oxide synthase expression BiomedPharmacother，2020，126:1100834Wang K，Zhan Y，Chen B，et al Tubeimoside I-induced lung cancer celldeath and the underlying crosstalk between lysosomes and mitochondriaCell Death Dis，2020，11:7085Chen Y，Zhong X，Zhang Y，et al Shikonin relieves osteoporosis ofovariectomized mice by inhibiting RANKL-induced NF-B and NFATpathways Exp Cell Res，2020，394:1121156程斌，张莉莉，张昕，等 针刺夹脊穴对糖尿病大鼠骨质疏松的作用中华中医药学刊，2016，34:2101-21037Yang M，Xie J，Lei X，et al Tubeimoside I suppresses diabetes-inducedbone loss in rats，osteoclast formation，and RANKL-induced nuclearfactor-BpathwayInternationalImmunopharmacology，2020，80:1062028贺志强，杨亚帆，陈先州，等 RANKL/RANK/OPG 信号通路参与调控磷酸三钙磨损颗粒诱导假体周围骨溶解的研究 实用骨科，2019，25:991-9959张孟之，柴艺汇，管连城，等 当归补血汤对维甲酸致大鼠骨质疏松模型 CYP24A1 和骨钙素表达的影响 中药药理与临床，2019，35:10-1410王雅婷，兰丽珍 葛根芩连汤治疗糖尿病骨质疏松大鼠的效果及机制 世界中医药，2020，15:1724-172811Han JK，Gao W，Su DY，et al Gypenoside inhibits RANKL-inducedosteoclastogenesis by regulating NF-B，AKT，and MAPK signalingpathways J Cell Biochem，2018，119:7310-731812Yan J，Dou X，Zhou J，et al Tubeimoside-I sensitizes colorectal cancercellstochemotherapybyinducingROS-mediatedimpairedautophagolysosomes accumulation J Exp Clin Cancer Res，2019，38:35313何峰，朱婉华，张侠福 涤痰散结药物在类风湿关节炎中的应用 中国中西医结合风湿病学术年会 201814杨明理，谢健，周琳 土贝母苷甲对 RANKL 诱导破骨细胞分化的影响与作用机制研究 中药药理与临床，2019，35:30-3415白登彦，王冠，张海军，等 TGF-1/Smad4 信号通路对去卵巢骨质疏松大鼠骨髓微环境的影响及针刺干预机制 中国骨质疏松杂志，2021，27:1140-114616Sun X，Wei B，Peng ZH，et al Protective effects of Dipsacus asperpolysaccharide on osteoporosis in vivo by regulating RANKL/RANK/OPG/VEGF and PI3K/Akt/eNOS pathway Int J Biol Macromol，2019，129:579-58717Li NX，Yan T，Shen Y，et al Calycosin attenuates osteoporosis andregulates the expression of OPG/RANKL in ovariectomized rats viaMAPK signaling Pharmazie，2016，71:607-612(收稿日期:2022 07 10)(上接 173 页)4Chen Wenling，Ennes Helena S，McRoberts James A，et al Mechanismsof-opioid receptor inhibition of NMDA receptor-induced substance Prelease in the rat spinal cord Neuropharmacology，2018，128:255-2685王懿春，郭曲练，王明德，等 鞘内注射舒芬太尼和 PKC 抑制剂对神经病理痛大鼠痛阈及脊髓背角 N-甲基-D-天冬氨受体和降钙素基因相关肽表达的影响 中南大学学报(医学版)，2012，37:783-7896冯丽娜 罗哌卡因-舒芬太尼联用对神经病理性疼痛大鼠 c-fos 表达的影响 延边大学，20147Tateyama Shingo，Ikeda Tetsuya，Kosai Kazuko，et alEndomorphinssuppress nociception-induced c-Fos and Zif/268 expression in the ratspinal dorsal horn Eur J Pharmacol，2002，451:79-878Goto T，Nakao K，Gunjigake KK，et al Substance P stimulates late-stageratosteoblasticboneformationthroughneurokinin-1receptorsNeuropeptides，2007，41:25-319Wang Liping，Zhao Rong，Shi Xiaoyou，et al Substance P stimulates bonemarrow stromal cell osteogenic activity，osteoclast differentiation，andresorption activity in vitro Bone，2009，45:309-32010Barwell James，Wootten Denise，Simms John，et al RAMPs and CGRPreceptors Adv Exp Med Biol，2012，744:13-2411Tian Gang，Zhang Gang，Tan Ying-hui Calcitonin gene-related peptidestimulates BMP-2 expression and the differentiation of human osteoblast-like cells in vitro Acta Pharmacol Sin，2013，34:1467-147412赵小纲 创伤性脑损伤影响骨折愈合速度的机制研究 浙江大学，200613王照东，官建中 创伤性脑损伤后骨折愈合加快的研究进展 中华解剖与临床，2013，4:353-355，35614黄亚峰 镇痛药影响骨质疏松性骨折愈合的临床观察 中国医院用药评价与分析，2015，15:304-30615Simon Ann Marie，O Connor J Patrick Dose and time-dependent effectsof cyclooxygenase-2 inhibition on fracture-healing J Bone Joint SurgAm，2007，89:500-51116Simank HG，Manggold 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