嗜酸乳杆菌NC55的安全性评价_林赓.pdf

研究报告 年第 卷第 期（总第 期）：引用格式：林赓，马欣，谢雨欣，等 嗜酸乳杆菌 的安全性评价 食品与发酵工业，（）：，（）：嗜酸乳杆菌 的安全性评价林赓，马欣，谢雨欣，王杰，谢欣茹，付加芳，曹广祥，（山东第一医科大学（山东省医学科学院）生物医学科学学院，山东 济南，）（山东省医药生物技术研究中心，山东 济南，）摘 要 嗜酸乳杆菌（）广泛应用于发酵饮品及食品领域。该实验室从发酵食品中分离获得一株嗜酸乳杆菌，将其命名为嗜酸乳杆菌，该研究通过抗生素敏感实验、有害代谢产物实验及动物实验对 菌株进行安全性评价。结果显示，菌株对多数抗生素敏感，未携带质粒，不存在耐药性通过质粒传递的可能。菌株无氨基脱羧酶活性，菌株表现为不溶血。动物实验过程中小鼠生命活动正常，解剖发现主要脏器无病变，未发现细菌移位现象；致畸试验显示小鼠胚胎发育正常。综上，嗜酸乳杆菌 在抗生素敏感实验、质粒检测、溶血实验及动物实验中均表现出良好的安全性，可被认为是应用于人和动物的潜在有益菌株。关键词 嗜酸乳杆菌；安全性评价；抗生素敏感实验；溶血实验；动物实验第一作者：硕士研究生（曹广祥研究员为通信作者，：）基金项目：山东省重点研发计划项目（）收稿日期：，改回日期：益生菌是指一类活的微生物，当有足够量的菌体到达宿主肠道、定植从而改变宿主肠道菌群平衡，能够对宿主产生健康效应。益生菌主要包括乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌等，其中乳酸菌是应用最多的一类益生菌。嗜酸乳杆菌（）具有降低机体胆固醇、代谢乳品中乳糖，缓解乳糖不耐症，有效降解食物中的杂环胺等功能，被广泛应用于食品发酵、奶酒和干酪制品的生产、调节血糖血脂等领域。益生菌的安全性一直是人们关注的热点，对益生菌安全性的理解也在不断的发生变化。国内外研究显示，绝大多数乳酸菌经过长期的应用筛选，通常被认为是安全的，但部分乳酸菌中携带抗性基因的质粒，可以通过质粒水平转移等途径将抗性基因转移至其他肠道菌群内，带来健康隐患。此外，少数乳酸菌可能产生诸如溶血素、生物胺 等有害物质进而对宿主产生健康威胁。本实验室从发酵食品中分离获得一株优势乳酸菌 ，但其生物安全性尚不清楚。为评估该菌株的生物安全性，本研究参考国家标准 食品安全国家标准 食品安全性毒理学评价程序等资料，通过抗生素敏感实验、质粒提取实验、有害产物代谢实验和动物实验等，从体内、体外两方面对 菌株的安全性进行评价，为后续将其开发应用于特色膳食或者药品奠定研究基础。材料与方法 材料与试剂嗜酸乳杆菌，本实验室分离保存；嗜酸乳杆菌（）、金黄色葡萄球菌（），本实验室保存；健康 级 小鼠，北京斯贝福生物技术有限公司；培养基，青岛高科园海博生物技术有限公司；哥伦比亚血琼脂培养基，北京陆桥技术股份有限公司；质粒小提试剂盒，美国 ；氨苄西林、头孢噻吩等抗生素，上海麦克林生化科技有限公司；溶菌酶，北京索莱宝科技有限公司。仪器与设备 型核酸电泳仪、型凝胶成像系统，北京君意东方电泳设备有限公司；型恒温培养箱，上海科恒实业发展有限公司；型生物安全型独立送风隔离笼具，苏州市冯氏实验动物设备有限公司；型多波段酶标仪，杭州遂真生物技术有限公司；型恒温摇床，上海新苗医疗器械制造有限公司。食品与发酵工业 （）实验方法 抗生素敏感性检测采用肉汤稀释法分析 菌株对临床常用抗生素的最小抑菌浓度（，）。以无菌生理盐水稀释菌液，将菌液加入含不同浓度抗生素的液体培养基中（菌液）（培养基），恒温摇床中培养，采用酶标仪测定 菌株的生长情况。质粒提取与检测取对数生长期的 菌株和阳性对照菌株（），离心 后收集菌体，在离心管中加入 （已预先加入 ），涡旋振荡后加入 溶菌酶（），孵育；加入 混匀后静置 ；加入 离心 后收集上清液，依次加入 及 洗涤后用超纯水洗脱质粒。以琼脂糖凝胶电泳方式进行检测，使用凝胶成像系统分析质粒条带。质粒提取与检测菌株溶血性检测参考已报道的方法进行。将活化后的 菌株接种于 液体培养基中 培养过夜，离心收集菌体，以无菌生理盐水洗涤后重悬，点样于哥伦比亚血琼脂培养基，培养 后观察有无溶血环出现。以金黄葡萄球菌 作为对照。氨基酸脱羧酶检测氨基酸脱羧酶检测参考已报道的方法进行。将活化的 菌株以 （体积分数）接种量接入含有 氨基酸（组氨酸、酪氨酸、赖氨酸或鸟氨酸）的 液体培养基中培养过夜，多次传代后，离心收集菌体。以无菌生理盐水洗涤后重悬，点样于添加组氨酸、酪氨酸、赖氨酸或鸟氨酸的氨基脱羧酶固体培养基，培养 后，观察培养基有无变色，检测是否生成组胺、酪胺、腐胺或尸胺等生物胺。经口毒性试验 经口毒性试验可以对受试动物的全身毒性进行评价。本试验参考 食品安全国家标准 天经口毒性试验进行实验。选取 周龄 级 小鼠 只，雌雄各半，分为对照组、低剂量组、高剂量组，每组 只小鼠。其中对照组小鼠灌胃生理盐水，实验组小鼠灌胃 生理盐水稀释液（低剂量：，高剂量 ）。每日定时灌胃 次，剂量为 只，连续灌胃 。每日灌胃后观察小鼠形态、行为变化。灌胃 后，小鼠禁食禁水过夜。称取小鼠体重，每组选择 只小鼠处死取全血、血清，送武汉赛维尔生物科技有限公司对小鼠血常规、血生化数据测定。随后解剖小鼠，取小鼠心、肝、脾、肺、肾称重后计算小鼠脏器系数。参考朱广素等的方法，观察脏器确定表面无异常组织或增生后，于超净工作台剖开脏器，以一次性无菌棉签擦拭切面后涂布于 固体培养基上，倒置培养 ，观察有无特征菌落生长，分析有无细菌移位现象产生。急性毒性试验急性毒性试验可以探明受试物可能对实验动物产生的急性毒性强度和性质，确定毒性作用的靶器官。本试验参考 食品安全国家标准 急性经口毒性试验进行实验。选取 周龄 级 小鼠 只，雌雄各半，分为对照组与实验组。对照组小鼠灌胃生理盐水，实验组小鼠灌胃 菌液（）。每日定时灌胃 次，剂量为 只，连续灌胃。每日灌胃后观察小鼠形态、行为变化。灌胃 后，小鼠禁食禁水过夜。称取小鼠体重，处死小鼠，一半小鼠取全血，另一半取血清。后续处理同。致畸试验参考 食品安全国家标准致畸试验 进行。选取性成熟 级 小鼠 只，雌雄各半，饲料为大小鼠营养繁殖饲料，自由饮食饮水。雌雄小鼠随机 合笼饲养，以母鼠阴道口发现阴道栓时间视为小鼠怀孕，为孕 。将出栓小鼠分为对照组、低剂量组、高剂量组 组，每组 只，实验设计与 喂养实验一致。小鼠孕 ，每日定时灌胃 次，剂量为 只。小鼠在孕 时处死，取子宫及胎盘，检查胚胎外观有无异常。将一半小鼠胚胎放入茜素红染液染色后检查小鼠骨骼发育状态，另一半小鼠胚胎放入 固定液中固定，检查内脏发育情况。数据处理使用 软件中的 检验、非参数检验，对数据进行统计及显著性差异分析。数据的表示方法为平均值 标准差。结果与分析 体外安全性实验 菌株的抗生素 实验结果如表 所示，菌株对 类抗生素中的 类敏感，对四环素存在抗性。研究表明乳酸菌普遍研究报告 年第 卷第 期（总第 期）对四环素具有抗性，部分菌株 。大多数四环素耐药基因与质粒、转座子或接合型转移元件相关联，表明嗜酸乳杆菌的四环素抗性为获得性耐药。本研究中 菌株对四环素耐药，与文献报道乳酸菌普遍对四环素具有抗性相一致。表 嗜酸乳杆菌 菌株的抗生素 检测结果 抗生素类别抗生素（）青霉素类氨苄西林头孢菌素类头孢噻吩 四环素类四环素苯丙醇类氯霉素叶酸合成抑制剂磺胺甲噁唑林可胺类林可霉素大环内酯类红霉素 糖肽类万古霉素安沙霉素类利福平 菌株中质粒提取结果琼脂糖凝胶电泳实验结果如图 所示。结果显示嗜酸乳杆菌 泳道内无质粒条带；而对照阳性菌株（）泳道内存在质粒条带，证明对革兰阳性菌质粒提取成功且嗜酸乳杆菌 内不存在质粒，表明 菌株不存在通过质粒水平转移扩散抗性基因至肠道菌群的能力，但尚不能排除嗜酸乳杆菌 通过转座子或者其他接合型转移元件扩散抗生素抗性基因的风险。；（）菌株；菌株图 嗜酸乳杆菌 菌株中质粒检测 菌株中质粒提取结果菌株溶血性检测结果如图 所示。在血琼脂培养基中阳性对照菌株金黄色葡萄球菌 菌落附近出现透明的溶血圈，表现为完全溶血（溶血），菌落附近无明显变化，属于无毒性的不溶血菌株。结果表明 菌株不 会 以 溶 血 方 式 危 害宿主安全。图 嗜酸乳杆菌 菌株溶血性检测 氨基酸脱羧酶检测结果本研究结果显示 菌株在氨基脱羧酶固体培养基中可正常生长，培养基颜色不发生变化，说明 菌株生长、增殖过程中不能利用组氨酸、酪氨酸、赖氨酸或鸟氨酸产生生物胺。体内安全性实验 小鼠 经口毒性试验结果本试验将小鼠分为对照组、低剂量组、高剂量组连续 固定时间对小鼠灌胃。小鼠灌胃后无异常，偶有呃逆发生，可自行恢复。后，小鼠无死亡，生命活动一切正常，精神状态良好，饮食、饮水正常，无腹泻血便，对外界刺激反应正常，鼠毛光洁白亮，皮肤无破损溃烂。结果显示，在小鼠 经口毒性试验中对照组小鼠与低剂量组、高剂量组小鼠在体重、脏器系数、血液生化指标方面均无显著性差异（表 表），解剖观察未发现内脏异常，细菌培养也未发现细菌移位现象。综上，可认为在 经口毒性试验中，嗜酸乳杆菌 未造成小鼠机体各项数据的改变，未对小鼠机体造成不良影响。表 小鼠 经口毒性试验动物体重单位：组别 对照组体重 低剂量组体重 高剂量组体重 注：数据为平均值 标准差（）食品与发酵工业 （）表 小鼠 经口毒性试验脏器系数 脏器对照组低剂量组高剂量组心 肝 脾 肺 肾 注：数据为平均值 标准差（）（表、表 同）表 小鼠 经口毒性试验血常规、血生化数据 项目对照组低剂量组高剂量组白细胞数目（个）单核细胞数目（个）中性粒细胞数目（个）红细胞数目（个）血红蛋白（）血小板数目（个）葡萄糖（）胆固醇（）白蛋白（）尿素（）尿酸（）总胆红（）谷草转氨酶（）谷丙转氨酶（）小鼠急性毒性试验结果在本研究中以浓度为 的 菌液对小鼠灌胃，对照组小鼠灌胃等体积的生理盐水。小鼠体重变化趋势及脏器系数如表 和表 所示，实验组与对照组小鼠间体重、脏器系数均无显著性差异。实验组与对照组小鼠体重均有一定程度减轻，可能与灌胃前禁食时间过长、灌胃剂量过大影响小鼠进食有关。小鼠血液检测数据如表 所示，与对照组相比，实验组血常规、血生化数据不存在显著性差异，说明 菌株未对小鼠血常规、血生化数值造成影响。此外，小鼠内脏表面无肉眼可见增生或病变，脏器剖面于无菌条件下涂布无 菌株生长，提示未发生细菌移位现象，证明 菌株不存在造成多器官功能障碍或肠源性感染的危险。表 小鼠急性毒性试验动物体重单位：组别 对照组体重 实验组体重 注：数据为平均值 标准差（）（表 同）表 小鼠急性毒性试验脏器系数 脏器对照组实验组心 肝 脾 肺 肾 表 小鼠急性毒性试验的血常规、血生化数据 项目对照组实验组白细胞数目 （个）单核细胞数目 （个）中性粒细胞数目 （个）红细胞数目 （个）血红蛋白（）血小板数目 （个）葡萄糖（）胆固醇（）白蛋白（）尿素（）尿酸（）总胆红（）谷草转氨酶（）谷丙转氨酶（）致畸试验结果实验过程中孕鼠精神状态良好，饮食、饮水正常。无腹泻、血便，对外界刺激反应正常，毛发光洁白亮，皮肤无破损。胎鼠外观均无异常，未发现四肢缺失或多肢、五官缺失、肛门发育不全等情况。茜素红染液染色观察显示，高剂量组和低剂量组的胎鼠均未发现骨骼畸形变异情况。使用 固定液固定后解剖观察，胎鼠内脏发育正常，五官清晰，未见变异或缺失，大脑发育完好。综上所述，在孕期大剂量摄入 菌株不会对小鼠胚胎形成和发育造成影响，可视为通过致畸试验。结论嗜酸乳杆菌作为国内外研究者重视的乳酸菌，被应用于乳品及其他饮品的复配发酵中，具有改善风味，提高肠道乳酸菌定存率的作用，同时也被视为膳食补充剂来预防乃至治疗诸如腹泻、炎症损伤等疾病。本研究对一株分离于发酵食品的嗜酸乳杆菌 菌株进行了安全性实验，确定菌株的安全性。常用抗生素的 检测显示 菌株仅对四研究报告 年第 卷第 期（总第 期）环素耐药，质粒提取实验证明菌株不存在质粒，不具备通过质粒传播耐药基因的能力；溶血实验表现为不溶血的 溶血；氨基脱羧实验中未表现氨基脱羧酶活性。动物实验显示，在急性毒性试验和 经口毒性试验中 菌株实验组各项数据均未与对照组数据之间存在显著差异，致畸试验中胎鼠外观及脏器发育正常，无畸变。综上所述，嗜酸乳杆菌 在各项实验中均表现出良好的安全性，为后续将其开发为益生菌或应用于食品发酵奠定了基础。参考文献 陈潇，吕涵阳，张婧，等 益生菌在食品中应用及健康声称管理现状和分析 中国食品卫生杂志，（）：，（）：吴蜀豫，冉陆 食品益生菌评价指南 中国食品卫生杂志，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，：，（）：高婧，姚景慧，赵秋华，等 奶酪中抗生素抗性基因检测及奶酪分离乳酸菌耐药性分析 南昌大学学报（理科版），（）：；，（），（）：；，：，（）：，（）：，（，），：，（）：，（），：，：，（）：，（）：，：朱广素，王刚，王园园，等 两株具有缓解代谢综合征功能的人源益生菌的安全性评价 食品与发酵工业，（）：，（）：王楠，田晗，张文晓，等 两株具有潜在益生作用的人源链球菌的安全性评价 食品与发酵工业，（）：，（）：郑鹏，田亚光，黄贺 小鼠繁殖行为的观察与分析 黑龙江动物繁殖，（）：，（）：，食品与发酵工业 （），（），：，（）：韩慧玲，李华，包振江，等 内蒙古传统发酵乳制品中乳酸菌的分离及其耐药性研究 中国酿造，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：许女，李雅茹，王超宇，等 传统发酵食品中乳酸菌的抗生素耐药性评估及耐药基因分析 中国食品学报，（）：，（）：，（）：，（），（）：，（）：薛玉玲，袁庆彬，冯丽莉，等 益生菌饮料改善甲型副伤寒沙门氏菌诱导小鼠腹泻作用研究 食品与发酵工业，（）：，（）：，（，）（，），；，；