多花黄精PLT基因家族的鉴定与表达分析.pdf

朱田圆，李小利，张慧，等.多花黄精PLT基因家族的鉴定与表达分析J.福建农业学报，2023，38（6）：678685.ZHUTY,LIXL,ZHANGH,etal.IdentificationandExpressionsofPLTFamilyof Polygonatum cyrtonemaJ.Fujian Journal of AgriculturalSciences，2023，38（6）：678685.多花黄精PLT基因家族的鉴定与表达分析朱田圆1，李小利1，张慧1，班景洁1，李丹1，罗彬彬1，朱建明2，林玉玲1，杜迎刚1,3*，赖钟雄1*（1.福建农林大学园艺植物生物工程研究所，福建福州350002；2.福建金湖源生态农业有限公司，福建邵武354099；3.潍坊科技学院/山东省高校设施园艺实验室，山东潍坊261000）摘要：【目的】PLT（Plethora）属于 AP2/ERF 型转录因子，在植物生长发育及抗胁迫等过程中发挥重要作用。本文旨在探究多花黄精 PLT（Polygonatum cyrtonemaHuaPLT，PcPLT）基因在根状茎器官生长发育中及盐胁迫下的调控作用，为深入研究 PcPLT 基因的功能提供理论依据。【方法】基于多花黄精转录组数据库进行 PcPLT 基因家族鉴定及生物信息学分析，通过 qRT-PCR 技术检测其在多花黄精不同组织部位及不同浓度 NaCl 处理下的相对表达量，利用 RT-PCR 技术构建 PcPLT2-2、PcPLT2-7 基因融合表达载体，观察其荧光信号验证亚细胞定位。【结果】共鉴定获得 15 个 PcPLT 家族成员，该家族无内含子结构，蛋白编码长度为 159601 个氨基酸，均为亲水蛋白；进化树分析显示 PcPLT 与百合科石刁柏（Asparagus officinalisL.）亲缘关系最近；亚细胞定位预测及验证结果显示PcPLT2-2 定位于细胞质、细胞核中，PcPLT2-7 定位于细胞核中。qRT-PCR 结果显示 PcPLT2-3 和 PcPLT2-7 在根状茎中表达最高，PcPLT1-3、PcPLT1-4、PcPLT2-7 响应盐胁迫调控。【结论】PcPLT 不仅具有组织特异性还能提高抗逆性，提示可能作为器官发育调节因子参与多花黄精根状茎膨大的形态建成，为深入研究 PLT 调控植物根状茎器官生长发育的生物学功能和多花黄精遗传改良奠定基础。关键词：多花黄精；PLT；基因家族；表达分析中图分类号：S567.239文献标志码：A文章编号：1008-0384（2023）06067808Identification and Expressions of PLT Family of Polygonatum cyrtonemaZHUTianyuan1,LIXiaoli1,ZHANGHui1,BANJingjie1,LIDan1,LUOBinbin1,ZHUJianming2,LINYuling1,DUYinggang1,3*,LAIZhongxiong1*（1.Institute of Horticultural Biotechnology,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou,Fujian350002,China;2.Fujian Jinhuyuan Eco-agriculture Co.,Ltd.,Shaowu,Fujian354099,China;3.Weifang University of Science andTechnology/Facility Horticulture Laboratory of Universities in Shandong,Weifang,Shandong261000,China）Abstract:【Objective】RegulatoryfunctionsofPolygonatum cyrtonemaHua PLT(PcPLT)inthegrowthanddevelopmentofrhizomesoftheplantwereinvestigated.【Methods】BasedontheP.cyrtonematranscriptomedatabase,theidentityandbioinformaticsofPcPLTfamilywereobtained.RelativeexpressionsintissuesoftheplantandthatunderNaClstressweredetectedusingtheqRT-PCRtechnique.Thefusionexpressionvectorsof PcPLT2-2and PcPLT2-7wereconstructed,andtheirfluorescence signals examined to determine subcellular localization.【Results】Fifteen PcPLT family members wereidentified.Theywerehydrophilicproteins,absentofintronstructure,coded159-601aminoacids,andevolutionarilycloselyrelatedtoLiliaceae Asparagus officinalisL.ThepredictedsubcellularlocalizationofPcPLT2-2wasincytoplasmandnucleus,whilePcPLT2-7innucleusonly.PcPLT2-3andPcPLT2-7mostlyintherhizomes;and PcPLT1-3,PcPLT1-4,andPcPLT2-7responsivetosaltstress.【Conclusion】PcPLTweretissue-specificandcapableofenhancingthestressresistanceofP.收稿日期：20221202初稿；20230327修改稿作者简介：朱田圆（1997），女，硕士研究生，研究方向：园艺植物生物技术（E-mail：）*通信作者：杜迎刚（1977），男，博士，教授，研究方向：害虫生物防治、园艺害虫生物技术（E-mail：）；赖钟雄（1966），男，博士，研究员，研究方向：园艺植物的生物技术与遗传资源（E-mail：）基金项目：福建农林大学横向科技项目（KH200373A）；福建省高原学科建设项目（102/71201801101）福建农业学报2023，38（6）：678685http:/Fujian Journal of Agricultural Sciencesdoi:10.19303/j.issn.1008-0384.2023.06.006cyrtonema.Theymightactasanorgandevelopmentregulatorassociatedwiththemorphogenesisofrhizomeexpansion.Ifso,theresultobtainedinthisstudywouldbeofvalueforthein-depthunderstandingofthebiologicalfunctionsofPLT.Key words:Polygonatum cyrtonemaHua；PLT；genefamily；expressionanalysis0引言【研究意义】多花黄精（Polygonatum cyrtonemaHua）为百合科（Liliaceae）黄精属（Polygonatum）多年生草本植物。其根状茎肥厚，富含多糖、甾体皂苷、黄酮类等多种对人体有益物质，是我国传统药食同源的珍稀药材，具补气养阴、健润脾肺、益肾之功效，开发利用前景广阔13。多花黄精根状茎作为主要药用部位，生长缓慢，极易受到外界不良生长环境的影响，部分适宜生长地区土壤盐渍化日益严重逐年扩散，对多花黄精的生长和品质都有较大的影响，目前相关研究多局限于药理作用4、生理指标5、组织培养6等方面，对分子生物学方面的研究少之又少。因此对多花黄精根状茎生长发育及抗盐胁迫相关基因的深入研究具有非常重要的意义。【前人研究进展】转录因子（Transcriptionfactor，TF）是能与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性结合，和下游靶基因顺式作用元件相互作用，进而调控靶基因表达的一类蛋白7，在植物的生长发育、形态建成、抗逆及次生代谢物等方面具有重要的调控作用。Plethora（PLT）属于 AP2/ERF 型转录因子，含有两个AP2重复结构。PLT 基因在胚胎发育、干细胞龛（静止中心，QC）、分生组织维护、器官生长发育等过程中具有核心作用8；在盐胁迫、干旱胁迫、高温、低温胁迫等非生物胁迫条件下，调节相关功能基因的表达以提高抗逆性9。QC 是干细胞的组织中心，植物干细胞具有自我更新和持续分裂子细胞的能力，是植物根、茎、叶和花等器官发生的源泉。PLT1和PLT2 是干细胞维持静止中心所必需的两个基因，静止中心的正常形成要求PLT1、PLT2、SHORT-ROOT（SHR）和SCARECROW（SCR）共同参与，PLT、SCR、植物特异性转录因子 TCP 的 3 个基因互作形成PLT-TCP-SCR复合体，与 WOX5启动子中的PLT结合位点结合进行诱导表达，在胚胎发生过程中特化干细胞龛，并在胚胎后维持干细胞属性8,10。PLT 基因与生长素关联密切，参与较多的基因调控网络，转录响应生长素积累并依赖于生长素响应转录因子进行转录，通过生长素的局部合成11及 PIN 蛋白12作为介导定向运输转运生长素在 QC中形成了浓度梯度1314，作用于下游的 PLT 基因，形成一个调控网络来维持稳定的生长素浓度和根尖干细胞龛的位置15，对根分生组织的大小和维持至关重要16。PLT3、PLT5和PLT7 调节侧根原基的启动及建立正确的对称生长轴中基因表达程序1718。Kareem 等19揭示了 PLT控制不定芽再生的机制：第一步，PLT3、PLT5和PLT7通过PLT1和PLT2 激活根干细胞建立多能性；第二步，PLT3、PLT5和 PLT7 通 过 增 强 因 子 Cupshapedcotyledon2（CUC2）调节来完成芽形成。PLT 活性高能维持干细胞活性，PLT 活性低有利于干细胞进行有丝分裂，PLT 活性更低则促进细胞分化8。PLT 基因在根干细胞区域和不定芽的生成过程中都表现出特异性表达19。PLT 基因不仅能响应种子萌发、生根等器官发育，响应激素信号，还能调控非生物胁迫9,20。【本研究切入点】PLT 基因家族的功能研究大多集中在模式植物拟南芥（Arabidopsis thalianaL.）和水稻（Oryza sativaL.）中，且主要集中在根系中，目前国内有关 PLT 基因家族的研究较少，在多花黄精中更是未见报道，PLT 基因家族是否调控多花黄精生长发育及行使相关功能还未曾揭示。【拟解决的关键问题】以实验室前期获得的多花黄精不同组织部位转录组数据为基础，对多花黄精 PLT 家族进行生物信息学分析并对关键成员进行克隆，测定其在不同组织部位和调控盐胁迫方面的表达情况，以期为多花黄精 PLT 家族基因的生物学功能研究、多花黄精遗传改良奠定基础。1材料与方法1.1材料野生植株不同组织部位（果实、叶片、根、茎秆、根状茎）转录组数据材料由采自福建省邵武市大竹镇（北纬 27116.80，东经 117354.60）野生多花黄精测序获得（另文发表），盐胁迫转录组数据由多花黄精组培苗经不同浓度 NaCl 处理 24h 后采样测序获得。1.2方法1.2.1总 RNA 的提取及 cDNA 的合成参考 RNAprepPure 总 RNA 提取试剂盒（TIANGEN）说明书提取多花黄精样品总 RNA，用 Thermo 超微量核酸检测仪测第6期朱田圆等：多花黄精PLT基因家族的鉴定与表达分析679定 RNA 浓度，通过 1%琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 纯度，然后采用 AllsupeiMix（TransGenBiotech 公司）和 GeneRacerTM 试 剂 盒（TaKaRa）逆 转 录 成cDNA 用于 PLT 基因定量和克隆，用 SYBRGreenMasterMix（NoRox）进行 qRT-PCR 反应。1.2.2多花黄精PLT基因家族的鉴定从Pfam数据库（http:/pfam.xfam.org/）获取PLETHORA（PF00847）结构域的隐马尔可夫模型文件，使用TBtools 软件对多 花 黄 精 转 录 组 数 据 库 进 行 搜 索。使 用 CDD（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）和SMART（http:/smart.embl-heidelberg.de/）对候选序列进行保守结构域鉴定和筛选。采用在线网站ExPASy（https:/web.expasy.org/protparam/）分析多花黄精 PLT 成员的氨基酸数量、蛋白分子量、等电点、不稳定指数和亲水性。利用 SignalP4.1Server（https:/services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP）、TMHMM Server 2.0（https:/services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）、Cell-PLoc2.0（http:/ 基因结构。使用MEME在线软件（https:/meme-suite.org/meme/tools/meme）分 析 该 家族成员编码蛋白的保守基序。同时结合结构域分析结果，使用TBtools绘制基因结构、保守基序和保守结构域图。1.2.4PcPLT家族系统进化关系分析模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）的PLT家族蛋白序列下载自TAIR数据库（https:/www.arabidopsis.org），水稻（Oryza sative L.）的 PLT 家 族 蛋 白 序 列 下 载 自RiceData数据库（http:/ Center for Biotechnology Information(nih.gov）下载石刁柏（Asparagus officinalisL.）、油棕（Elaeis guineensis）、葡萄（Vitis vinifera）蛋白序列。使用MEGA11.0软件中的最大似然法（Maximumlikelihood，ML）构建系统发育树，并使用在线软件iTOL（https:/itol.embl.de/upload.cgi）对 进 化 树 进 行美化。1.2.5PcPLT家族 GO 功能注释为了解到 PcPLT全部基因信息，进行 GO 数据库功能注释搜索，分析注释信息。1.2.6多花黄精 PLT 基因特异表达分析为进一步了解 PLT基因在多花黄精不同组织器官中的表达模式，通过 qRT-PCR 检测 PLT基因在不同组织部位以及 NaCl 不同浓度处理下的表达情况。根据 HieffTMqPCRSYBRGreenMasterMix（YEASEN）说明书进行 qRT-PCR 反应。反应体系为 20L，包括 Mix10L，ddH2O7.2L，cDNA模版 2L，上、下引物各0.4L。内参基因选用-tubulin 基因，依据 2Ct法分析计算 PcPLT 基因的相对表达量，并使用 GraphPadPrism 进行图表绘制。分析多花黄精 PLT 基因在不同组织器官中及不同浓度 NaCl 处理下的表达情况（引物序列见表 1）。1.2.7过表达载体的构建及亚细胞定位将 PcPLT2-2、PcPLT2-7 的 CDS 序 列 导 入 DNAMAN7.0软 件中，对其进行 pCAM-BIA1302 的酶切位点预测，本试验选择 Nco和 SpeI酶切位点进行后续试验。经扩增、胶回收、连接后将连接产物导入 DH5 大肠杆菌感受态细胞，挑取单菌落摇菌后送测，提取重组质粒 pCAMBIA1302-目的片段 GFP。将带目的片段的重组质粒与 pCAMBIA1302 植物表达载体分别进行酶切，并回收。采用冻融法转化根癌农杆菌 3101，然后采用农杆菌介导法侵染洋葱内表皮 PLT 进行蛋白亚细胞定位，洋葱 37 暗培养 3d 后取表皮进行观察（引物序列见表 1）。2结果与分析2.1多花黄精 PLT 家族成员鉴定利用 PLT 结构域对多花黄精不同组织部位转录组进行搜索筛选，最终鉴定出 15 个 PLT 家族成员，依次命名为 PcPLT1-1PcPLT1-4、PcPLT2-1PcPLT2-11（表 2）。PcPLT 编码长度 159601aa、分子量17827.93 Da（PcPLT2-4）66506.19（PcPLT2-1）、等电点（pI）为 6.479.64 的蛋白质。所有蛋白的不稳定系数都大于40，表明均为不稳定蛋白；亲水性指数都为负值，表明均为亲水蛋白。信号肽预测结果显示均不含信号肽且15 个成员中都不具有跨膜结构。亚细胞定位显示，PcPLT1-4、PcPLT2-1、PcPLT2-2、PcPLT2-5、PcPLT2-8、PcPLT2-9、PcPLT2-10 定位在细胞质、细胞核中，PcPLT1-1、PcPLT1-2、PcPLT1-3、PcPLT2-3、PcPLT2-4、PcPLT2-6、PcPLT2-7、PcPLT2-11 定位在细胞核中。通过在线软件SOPMA分析预测多花黄精PLT蛋白序列的二级结构，发现多花黄精PLT家族蛋白中大部分成员无规则卷曲结构所占比例高，-转角结构所占比例最低，所有-螺旋结构所占比例都高于延伸链结构。680福建农业学报第38卷2.2多花黄精 PLT 基因结构、保守结构域及保守基序分析为进一步揭示PcPLT 的结构和功能特性，采用在线网站MEME对多花黄精PLT蛋白保守基序进行分析，共鉴定到10个保守基序，分别命名为motif1motif10（图 1），每个蛋白序列上分布的基序种类和表 1 引物序列Table 1 Sequences of primers used引物名称Primername引物序列Primersequence(5-3)退火温度Tm/用途UsagePLT2-2-Q-FPLT2-2-Q-RCGTCATCTTATCGTGGAGTTACCATCTTTCCGCCTTGTTACT55qRT-PCR引物PLT2-7-Q-FPLT2-7-Q-RTCAAGTGTAATGGGAGGGAAGAGAATAGCGGCAATGTTG55qRT-PCR引物-tubulin-Q-F-tubulin-Q-RTTGTCGAAAATGCTGACGAGCAAGCTTCCGGAGATCAGAG60内参基因引物PLT2-2-GFP-FPLT2-2-GFP-RCATGCCATGGATGAAGAAGTTTGCGGTGCCGGACTAGTTAACTCAAGTTTGCAGGGTT60载体构建、亚细胞定位PLT2-7-GFP-FPLT2-7-GFP-RCATGCCATGGATGGGGAACTTGACCAAGGGACTAGTGCTCCTGGGGTAGAAATAGG64载体构建、亚细胞定位PLT1-3-Q-FPLT1-3-Q-RTACCTCCTCCACCACTTCTCTCTTCAAATCAGAGTCCGC60qRT-PCR引物PLT1-4-Q-FPLT1-4-Q-RATGGTGAGTGCTTGGCTTTGCCTCCCTTTCCTTGTT50qRT-PCR引物表 2 多花黄精PLT 家族成员信息Table 2 Information on PcPLT family members基因名称Genename基因IDGeneID注释到拟南芥成员AnnotatedArabidopsis氨基酸数量Aminoacids/aa分子量Molecularweight/Da等电点pI脂肪系数Aliphaticindex二级结构Secondarystructure/%亚细胞定位Subcellularlocalization-螺旋Alphahelix-转角Betaturn延伸链Extendedstrand无规卷曲RandomcoilPcPLT1-1Cluster-11683.110576.p1AtPLT131735195.858.9654.6432.185.3610.7351.74细胞核PcPLT1-2Cluster-11683.110575.p1AtPLT146951308.346.4753.4125.595.3312.1556.93细胞核PcPLT1-3Cluster-11683.173509.p1AtPLT146851236.276.4752.8825.215.1312.6157.05细胞核PcPLT1-4Cluster-11683.233671.p1AtPLT142147120.437.7158.2424.477.8413.7853.92细胞质、细胞核PcPLT2-1Cluster-11683.222146.p1AtPLT260166506.196.5159.6318.473.9912.4865.06细胞质、细胞核PcPLT2-2Cluster-11683.100274.p1AtPLT227730714.027.2561.6634.307.2215.5242.96细胞质、细胞核PcPLT2-3Cluster-11683.77849.p1AtPLT218020995.909.6470.9433.897.7826.1132.22细胞核PcPLT2-4Cluster-11683.163200.p1AtPLT215917827.936.4867.6142.775.6616.3535.22细胞核PcPLT2-5Cluster-11683.105355.p1AtPLT231234191.206.9473.9126.926.7313.1453.21细胞质、细胞核PcPLT2-6Cluster-11683.151415.p2AtPLT219922672.779.1174.0239.707.5422.6130.15细胞核PcPLT2-7Cluster-11683.204809.p1AtPLT233236898.449.1161.8425.005.1212.6557.23细胞核PcPLT2-8Cluster-11683.147730.p1AtPLT239544135.249.0763.0127.596.8415.9549.62细胞质、细胞核PcPLT2-9Cluster-11683.151416.p1AtPLT239143773.698.8959.6424.557.4213.8154.22细胞质、细胞核PcPLT2-10 Cluster-11683.133871.p1AtPLT238042322.239.2761.8924.477.3713.6854.47细胞质、细胞核PcPLT2-11 Cluster-11683.182808.p2AtPLT218420988.809.2669.4639.677.0718.4834.78细胞核第6期朱田圆等：多花黄精PLT基因家族的鉴定与表达分析681顺序有一定差异性，揭示了功能的多样性，其中除PcPLT2-11 外，其 他 成 员 均 含 有 motif1、motif2、motif3、motif5，具有高度保守性；所有成员均含有2 个 AP2 结构域且无内含子。PcPLT2-6PcPLT2-9PcPLT2-10PcPLT2-11PcPLT2-8PcPLT2-7PcPLT2-3PcPLT2-5PcPLT2-4PcPLT2-2PcPLT2-1PcPLT1-4PcPLT1-1PcPLT1-2PcPLT1-3Motif 4Motif 7Motif 3Motif 1Motif 5Motif 2Motif 6Motif 8Motif 10Motif 9AP2AP2superfamilyUTRCDS530 100 200 300 400 500 600 700530 100 200 300 400 500 600 7005304008001 2001 6002 000图 1 PcPLT 蛋白保守基序 Motif、保守结构域及基因结构Fig.1 Conserved motif,conserved domains,and structure of PcPLT2.3多花黄精PLT家族系统进化分析为分析多花黄精 PLT 家族的进化关系，参考水稻、拟南芥、石刁柏、油棕和葡萄 PLT 成员氨基酸序列构建系统进化树（图 2）。参考水稻 PLT 家族的进 化 分 类，将 多 花 黄 精 PLT 家 族 分 为 2 个 大 类（和）8 个亚家族(a)、(b)、(c)、(d)、(a)、(b)、(c)、(d)，两个大类各包含 6 和9 个多花黄精成员，进化树显示多花黄精与石刁柏亲缘关系较近，油棕其次，推测是因为多花黄精与石刁柏都属于百合科植物，具有一定相同的序列，而与拟南芥亲缘关系最远，可能是拟南芥是双子叶植物，多花黄精是单子叶植物，因此同源性较其他单子叶植物更远，这有利于进一步探索 PcPLT 的生物学功能。2.4多花黄精 PLT 基因家族的不同组织部位表达分析为了探究 PLT 家族基因不同组织部位的表达差异，使用多花黄精不同组织部位和盐胁迫转录组中PLT 家族基因的表达量（FPKM）绘制热图（图 3）。不同组织部位转录组结果（图 3A）显示，15 个PcPLT 基因在不同组织部位中均有不同程度的表达，PcPLT2-7、PcPLT2-3、PcPLT2-2、PcPLT2-8 在根 状 茎 和 根 中 有 较 高 的 表 达 量，PcPLT2-2和PcPLT2-8 在所有部位表达量都较高，PcPLT2-3 和PcPLT2-7 在根状茎里的表达量最高。根据不同部位转录组筛选到的 PcPLT 成员在盐胁迫转录组中进行比对，共比对到 8 个成员（图 3B），在 500mmolL1NaCl 处理下 PcPLT1-3有明显上调表达，PcPLT2-2、PcPLT2-8、PcPLT1-4、PcPLT2-5 和 PcPLT2-9 相比较于 CK 都有不同程度的下调表达。选取 PcPLT2-2、PcPLT2-3、PcPLT2-7 进行不同组织部位的表达量分析，选取 PcPLT1-3、PcPLT1-4、PcPLT2-7 进行不同浓度盐胁迫的 qRT-PCR 表达分析。结果表明（图 4）：PcPLT2-2、PcPLT2-3、PcPLT2-7 在多花黄精各个组织部位均有表达，以茎秆为 CK 进行表达量计算，其中 PcPLT2-2 在根的表达量最高，在叶的表达量最低；PcPLT2-3 在根状茎的表达量最高，在叶的表达量最低，根状茎的表达量是叶的 45 倍；PcPLT2-7 在根状茎的表达量最高，在果实的表达量最低，根状茎的表达量是果实的 135 倍，推测 PcPLT基因在根状茎 和 根 中 行 使 重 要 功 能。PcPLT1-3 在 不 同 浓 度NaCl 处 理 下 呈 现 出 上 调 表 达，在 500 mmolL1NaCl 时 表 达 量 最 高；PcPLT1-4 和 PcPLT2-7 随 着NaCl 浓度的提高相对表达量表现出下降的趋势，在500mmolL1NaCl 表达量最低，表明 PcPLT1-3 正调(a)(d)(c)(b)(d)(c)(b)(a)Pc：多花黄精，At：拟南芥，Os：水稻，Ao：石刁柏，Eg：油棕，Vv：葡萄。Pc:P.cyrtonemaHua;At:Arabidopsis thalianaL.;Os:Oryza sativaL.;Ao:A.officinalisL.;Eg:Elaeis guineensis;Vv:Vitis vinifera.图 2 多花黄精PLT 家族系统进化树Fig.2 Phylogenetic trees of P.cyrtonema PLT families682福建农业学报第38卷控盐胁迫，PcPLT1-4、PcPLT2-7 负调控盐胁迫。2.5多花黄精 PcPLT2-2、PcPLT2-7 的载体构建及亚细胞定位为进一步研究 PcPLT 基因家族亚细胞定位，将构建好的 pCAMBIA1302-PcPLT-GFP 载体进行洋葱注射，洋葱亚细胞定位结果显示（图 5）：1302 空载GFP 充斥在洋葱整个细胞中，1302-PcPLT2-2-GFP 定位在细胞质、细胞核，1302-PcPLT2-7-GFP 定位在细胞核，均与亚细胞定位预测结果一致。PcPLT2-5PcPLT1-1PcPLT1-3PcPLT1-4PcPLT1-2PcPLT2-6PcPLT2-11PcPLT2-10PcPLT2-1PcPLT2-9PcPLT2-4PcPLT2-7PcPLT2-3PcPLT2-2PcPLT2-8PcPLT1-3PcPLT1-4PcPLT2-1PcPLT2-9PcPLT2-7PcPLT2-5PcPLT2-2PcPLT2-8果实Fruit叶片Leaf根Root茎秆Stems根状茎Rhizomes65432104.03.53.02.52.01.01.50.50对照CK500 mmolL1 NaCl 处理500 mmolL1 NaCl 不同组织部位Different tissue parts盐胁迫Salt stressAB图 3 PcPLT在不同组织部位及盐胁迫下的表达模式分析Fig.3 Expressions of PcPLTs in various tissues and under NaCl stress2.52.01.51.00.50果实Fruit叶片Leaf根Root茎秆Stems根状茎Rhizomes不同组织部位Different tissue parts相对表达量Relative expressionAPcPLT2-2151050果实Fruit叶片Leaf根Root茎秆Stems根状茎Rhizomes不同组织部位Different tissue parts相对表达量Relative expressionPcPLT2-3151050果实Fruit叶片Leaf根Root茎秆Stems根状茎Rhizomes不同组织部位Different tissue parts相对表达量Relative expressionPcPLT2-7B100806040200 NaCl 浓度NaCl concentrations/(mmolL1)相对表达量Relative expressionPcPLT1-3CK 100 200 300 400 5001.51.00.50 NaCl 浓度NaCl concentrations/(mmolL1)相对表达量Relative expressionPcPLT1-4CK 100 200 300 400 50043210 NaCl 浓度NaCl concentrations/(mmolL1)相对表达量Relative expressionPcPLT2-7CK 100 200 300 400 500A：PcPLT 在不同组织部位的表达；B：不同 NaCl 浓度处理下 PcPLT 的表达。A:ExpressionsofPcPLTintissues;B:PcPLTexpressionunderstressesofvariedNaClconcentrations.图 4 PcPLT在不同组织部位及盐胁迫下的 qRT-PCR 表达分析Fig.4 qRT-PCR expressions of PcPLTs in various tissues and under NaCl stress第6期朱田圆等：多花黄精PLT基因家族的鉴定与表达分析683ABCDAPI 场DAPI fieldCFP 荧光场GFP field明场TD叠加场mnerged fieldA：pCAMBIA1302-GFP 荧光信号；B：pCAMBIA1302-PcPLT2-2-GFP 荧光信号；C：pCAMBIA1302-PcPLT2-7-GFP 荧光信号。A:pCAMBIA1302-GFPfluorescencesignal;B:pCAMBIA1302-PcPLT2-2-GFPfluorescencesignal;C:pCAMBIA1302-PcPLT2-7-GFPfluorescencesignal.图 5 PcPLT蛋白在洋葱表皮中的亚细胞定位Fig.5 Subcellular localization of PcPLT in onion epidermal cells3讨论与结论3.1多花黄精 PcPLT 家族成员鉴定与进化特性PLT作为 AP2/ERF 型转录因子，在植物体各个组织中广泛表达，尤其在幼嫩的组织中表达量高。已被证明具有促进根部分生组织生长、芽从头再生、激活根部干细胞建立全能性、茎尖分生组织定位、启动花序分生组织原基等功能，通过与其他转录因子及生长素进行互作影响植物器官的发育与形态建成，对多花黄精遗传改良和增产具有重要意义。本研究通过生物信息学方法从多花黄精不同组织部位转录组信息鉴定到 15 个 PLT 成员，该家族成员均为不稳定亲水蛋白，不含信号肽且不具有跨膜结构，无内含子。系统进化关系表明，PcPLT 与石刁柏和油棕的亲缘关系最近，通过在线软件SOPMA分析预测多花黄精PLT蛋白序列的二级结构，发现多花黄精PLT家族蛋白中大部分成员都是无-螺旋结构和延伸链结构占比较多。蛋白功能的发挥与所在位置关联密切，只有被运输到合适位置才能参与生命活动行使功能，蛋白的亚细胞定位与其蛋白的功能密不可分，因此研究亚细胞定位是研究蛋白功能的一种手段21。细胞核是细胞遗传和代谢的调控中心，控制着细胞的分裂和死亡，在细胞的代谢、生长、分化中起着重要作用，PcPLT2-2、PcPLT2-7 亚细胞定位结果表明，PcPLT2-2 定位在细胞质、细胞核中，PcPLT2-7 定位在细胞核中，这与预测结果一致，由此推测PLT 基因在多花黄精生长发育中有重要作用。3.2PcPLT 可能促进多花黄精的生长发育及参与生长素的调控Nole-Wilson 等22研究表明，PLT 基因在新生幼嫩组织中表达量更高，而多花黄精不同组织部位qRT-PCR 表明，PcPLT2-3、PcPLT2-7 基因在根状茎中表达量最高，因此推测 PLT 基因可能在根状茎新生组织中高表达，更有可能促进多花黄精根状茎的生长发育。生长素是一类重要的植物激素，参与调控植物生长发育等众多生物学过程，尤其在调控根系生长、侧根发育等过程中发挥着不可替代的作用，参与根干细胞龛的形态建成。在拟南芥中，生长素合成基因 YUC3 和 YUC8 是 PLT2 激活靶基因23，芽中的 PLT5-GR 在 DEX 存在的情况下能调控 YUC5表达，PLT 与生长素之间相互激活，PLT 蛋白通过激活 YUC 促进生长素积累24。不同 PLT 基因成员与生长素早期反应的共表达模式不同，其中与 PLT2 和PLT5 共 表 达 的 生 长 素 早 期 反 应 基 因 明 显 多 于PLT1 和 PLT7，而与 PLT4/BBM 共表达的生长素早期反应基因仅为少数。PLT 在调节器官发育的细胞分裂和分化阶段中发挥作用的分子机制可能涉及根和地上部的不同靶基因，这可能是由于这些器官系统的不同结构和生长策略。需要对拟南芥和其他物种684福建农业学报第38卷的根和芽中的 AIL/PLT 基因调控网络进行更详细的分析，以阐明生长调节剂是如何在不同的发育环境中进化定位。3.3PcPLT 可能参与多花黄精非生物胁迫的调控植物在受到非生物胁迫时，会通过升高体内脱落酸（ABA）水平进行响应，这一途径已被充分报道25。宋婷婷等9通过对水曲柳进行低温（4）、NaCl、NaHCO3和PEG6000处理，利用 qRT-PCR 检测